Een In Vitro Test op huidirritatie (SIT) het gebruik van de EpiDerm gereconstrueerde humane epidermale (RHE) Model

Epiderm is een in vitro gereconstrueerd model van de menselijke epidermis, ontwikkeld door de Matt Tech Corporation en afgeleid van normale menselijke cellen. Het gevalideerde EC VM-protocol voor de Epiderm-huidirritatietest vervangt traditionele dierproeven voor producten zoals cosmetica, grondstoffen en industriële middelen die in contact komen met de menselijke huid. Deze test begint op dag nul, wanneer de huidirritatiekit en het Epiderm-weefsel in het laboratorium aankomen en vervolgens worden geconditioneerd in een assay-medium na een incubatie van een nacht.

Op dag één wordt het atypische oppervlak van het epidermale weefsel gedurende één uur blootgesteld aan een vermoedelijke irriterende verbinding, waarna de irriterende stof op dag twee met een wasstap wordt verwijderd. Na een incubatie van 24 uur wordt de cultuurinsert in vers medium geplaatst en kan het oude medium worden gebruikt voor de analyse van vrijgekomen cytokinen en chemokinen. Het weefsel wordt behandeld met een verbinding die bekend staat als MTT, welke door mitochondriale reductase wordt omgezet in een donkerpaarse kleur voor maoz en zout.

Het biedt een uitslag voor de cellevensvatbaarheid. Het ontbreken van een donjpaarse kleur in het monster is een indicator voor een afgenomen levensvatbaarheid. Wanneer de colorimetrische uitslag voor een testverbinding minder dan 50% van de negatieve controles bedraagt, kan de testverbinding worden geclassificeerd als een irritant.

Hallo, ik ben Helena Kava van Matt Corporation. Vandaag laten we u de procedure zien voor in vitro huidirritatietests met behulp van het gereconstrueerde menselijke huidmodel epiderm. Deze procedure kan, afhankelijk van de regelgevende vereisten, worden gebruikt als volledige of gedeeltelijke vervanging van de in vivo rapid skin irritation test.

Deze nieuwe in vitro procedure kan worden gebruikt voor de identificatie van gevaren en de etikettering van chemicaliën en cosmetische grondstoffen. Laten we beginnen. Epiderm is afgeleid van een kweek van menselijke epidermale keratinocyten om een driedimensionaal, meerlaags en sterk gedifferentieerd model van de menselijke epidermis te vormen.

De weefsels zijn mitotisch en metabool actief, bootsen hun in vivo tegenhangers zowel structureel als biochemisch nauwgezet na, en doen dit met een gegarandeerde reproduceerbaarheid, zoals bij de menselijke epidermis. De Epiderm bestaat uit georganiseerde basale, spinose en granulaire lagen en een meerlaags stratum corneum. Dat laatste bevat intercellulaire lamellaire lipidenlagen die zijn gerangschikt in patronen die analoog zijn aan die welke in vivo worden aangetroffen.

Deze weefsels worden gekweekt in serumvrij medium. Elk weefsel wordt gegroeid in een individuele celluctuurinzet. Andere configuraties zijn beschikbaar, waaronder een 96-wells high-throughput formaat.

De weefselproductie duurt ongeveer drie weken om te voltooien; op een specifiek punt in dit proces wordt het weefsel naar de lucht-vloeistofinterface gebracht en wordt alle vloeistof van het apicale oppervlak van het weefsel verwijderd. Het weefsel wordt uitsluitend gevoed via het basolaterale oppervlak, dat in contact blijft met het gepatenteerde kweekmedium van MatTec. Een typische Epiderm-kit bevat 24 weefsels, elk negen millimeter in diameter in een eigen weefselkweekinsert, plus voldoende assay-medium om deze huidirritatietest uit te voeren.

De 24 inserts zijn stevig geplaatst op medium-geïnfuseerde AGA rozengelei, met één weefsel in elke well van een standaard 24-well plaat; verzending vindt plaats via een overnight-koerier bij een temperatuur van 3 tot 4 °C. Voorafgaand aan het testen van chemicaliën met behulp van het EPIDERM-testsysteem moeten alle instrumenten en hulpmiddelen die in de assay worden gebruikt, worden klaargemaakt en gesteriliseerd zoals beschreven in het geschreven protocol. Een deel van de materialen, zoals wattenstaafjes, moet in steriele verpakkingen worden geleverd of worden geautoclaveerd.

70% ethanol moet worden gebruikt om instrumenten zoals pincetten te steriliseren, en UV- of gammastraling moet worden gebruikt om de spoelflessen te steriliseren. Twee kritische oplossingen die in de assay worden gebruikt, moeten vooraf worden bereid: DPBS en een 5% SDS-oplossing. In gedestilleerd water zullen ongeveer twee liter steriele DPBS pH zeven in de assay worden gebruikt voor één kit die 24 epidermale weefsels bevat.

Steriel DPBS dient als negatieve controle en als waslossing. 5% SDS dient te worden bereid en gebruikt als positieve controle. De huidirritatietest begint zodra de EPIDERM EPI 200 SIT-kit is ontvangen.

Controleer alle componenten van de kit op integriteit en neem bij eventuele zorgen onmiddellijk contact op met de Mat Tech corporation; als alles aanwezig is, ga dan door naar de volgende stap. Om de test te starten, laat het bij de kit geleverde assay-medium op kamertemperatuur komen. Voorverwarm dit niet in de laminaire flowkap.

Bereid voor elke drie epidermale weefselinserts één steriele six-wellplaat voor en pipetteer onder steriele omstandigheden 0,9 milliliters van het assaymedium in elke well. Open de plastic zak met de 24-wellplaat die de epidermale weefsels bevat onder een steriele luchtstroom. Verwijder het steriele gaas en gebruik een steriele pincet om elke insert met het epidermale weefsel voorzichtig uit te nemen.

Verwijder eventuele resterende agar die aan de buitenkanten van de insert kleeft door voorzichtig te droogdeppen met steriel gaas of filterpapier. Plaats de weefsels vervolgens binnen vijf minuten in de lege steriele 24-wellplaat. Inspecteer de inserts visueel.

Noteer eventuele weefseldefecten en een teveel aan vocht op het oppervlak. Gebruik geen defecte weefsels of weefsels die volledig met vloeistof zijn bedekt.

Optimale weefselinzetten. Deze dienen een droog oppervlak te hebben en vrij te zijn van loslatingen, ongelijkheden of overtollige vloeistof aan het oppervlak. Droog vervolgens met een steriele wattenstaaf voorzichtig het oppervlak van de weefsels.

Probeer het weefsel niet rechtstreeks aan te raken. Capillaire effecten zijn voldoende om het vocht van het oppervlak te verwijderen nadat het oppervlak is gedroogd. Breng drie weefsels over naar de bovenste rij van elke zes.

Wellplaat vooraf gevuld met 0,9 milliliter assaymedium. Verwijder eventuele luchtbellen die onder de inserts vastzitten. Plaats vervolgens de zes wellplaten met de inserts gedurende één uur in de incubator.

Pre-incubatie bij 37 °C. Aan het einde van de eerste pre-incubatieperiode worden de inserts uit de bovenste wells overgebracht naar de onderste wells van de six-well plaat. Plaats de platen terug in de incubator voor een pre-incubatie gedurende de nacht.

Plaats de rest van het assaymedium in de koelkast. Na de overnachtse pre-incubatie kunnen de testchemicaliën worden aangebracht op de epidermale weefselinserts. Plaats alle benodigde apparatuur, oplossingen en testchemicaliën op kamertemperatuur voordat de chemische expositie-assay wordt gestart.

Veeg in de steriele zuigkast alle niet-steriele flesjes met materiaal af met 70% ethanol voordat u ze in de kast plaatst. De negatieve controle steriele DPBS, de positieve controle, 5% SDS en gedestilleerd water moeten eveneens in de kast bij kamertemperatuur worden geplaatst. Zet een groot vial apart voor het afval.

Bereid per chemische stof één six-wellplaat voor door alleen de bovenste rij te vullen met 0,9 milliliters assaymedium per well. Label elke plaat met het weefselnummer en de naam van de chemische stof.

Ongeveer vijf minuten vóór de geplande blootstelling aan chemicaliën. Haal de zeswellplaten met de geconditioneerde weefsels uit de incubator. Beoordeel vervolgens visueel het oppervlak van de weefsels.

Verwijder eventueel vocht met steriele wattenstaafjes en druk niet op het weefseloppervlak. Label tot slot de deksels van de six-wellplaat met de codes of namen van het testmateriaal. Test niet meer dan zes chemicaliën per testronde, inclusief negatieve en positieve controles, elk in drievoud.

Gebruik een interval van één minuut voor de chemische applicatie en het wassen bij het hanteren van bekende testsubstantiën. Volg de instructies in het veiligheidsinformatieblad of MSDS voor gecodeerde of onbekende monsters. Volg de richtlijnen voor chemische veiligheid en gebruik een geventileerde kast.

Draag handschoenen en bescherm uw ogen en gezicht; doseer de weefsels met chemicaliën in tijdsintervallen van één minuut om het spoelen van de testchemicaliën na blootstelling te vergemakkelijken. Houd de platen met de gedoseerde weefsels in de laminaire flowkast tot het laatste weefsel is gedoseerd. Gedurende de gehele procedure wordt een pipette met een bolvormige kop gebruikt om het weefsel en de testverbindingen te manipuleren. Een Bunsenbrander kan worden gebruikt om de bolvormige tip voor de vloeibare testchemicaliën te vormen.

Breng 30 µL van het vloeibare testartikel direct aan op het weefsel en start onmiddellijk de timer. Plaats het nylon gaas op het oppervlak van het weefsel. Wanneer de timer één minuut bereikt, wordt de tweede vloeibare verbinding toegevoegd. Gebruik drie weefsels per testchemische stof, waarbij elke verbinding met tussenpozen van één minuut wordt toegevoegd.

Gebruik voor het testen van halfvaste stoffen een positive displacement pipet om 30 µL direct op het weefsel aan te brengen. Verspreid de stof indien nodig met een Pasteurpipet zodat deze overeenkomt met de grootte van het weefsel. Bevochtig vlak voor het aanbrengen van de vaste stof het weefseloppervlak met 25 µL steriele DPBS om het contact tussen het weefseloppervlak en de teststof te verbeteren; vul vervolgens een scherpe applicatielepel van 25 mg met het fijn gemalen testmateriaal.

Breng de vaste testchemische stof aan op het weefseloppervlak. Gebruik indien nodig een steriele pipetteerbol om de lepel volledig te legen. Schud de inserts voorzichtig om de verspreiding van de vaste stof op het oppervlak te verbeteren.

U kunt ook de kop van de pipet gebruiken om deze af te stemmen op de grootte van het weefsel. Druk niet op het weefseloppervlak. Breng ten slotte DPBS aan als negatieve controle en 5% SDS als positieve controle op de weefselinserts, eveneens in triplikaat. Nadat het laatste weefsel is gedoseerd, worden alle platen gedurende 35 ± 1 minuten geplaatst in de bevochtigde incubator bij 37 °C.

Zorg er tijdens deze incubatie voor dat alle materialen die nodig zijn voor de wasstappen in de zuurkast staan. Verwijder na de incubatie van 35 minuten alle platen uit de incubator. Plaats ze in de steriele zuurkast en wacht 60 minuten tot de chemische blootstelling voor het weefsel van de eerste dosis is voltooid.

Start vervolgens met de wasprocedure. Spoel de weefsels 15 keer af met steriele DPBS. Om eventueel resterend testmateriaal te verwijderen, vult u de weefselinsert door een constante stroom DPBS op 1,5 centimeter afstand van het weefseloppervlak toe te dienen en deze vervolgens te legen.

Zorg ervoor dat de DPBS-stroom niet te zwak is, anders wordt de testsubstantie niet verwijderd. Houd vast aan het tijdsinterval van één minuut voor het viermaal wassen van weefsels met een nylon gaas; was vijf keer en verwijder het gaas voorzichtig met de scherpe pincet. Ga vervolgens verder met de resterende 10 wasbeurten; spoel na de 15e beurt met de spoelfles door de insert drie keer volledig onder te dompelen in 150 milliliters DPBS en schud om de resterende testmateriaal te verwijderen.

Spoel ten slotte het weefsel. Voeg één keer vanaf de binnenzijde en één keer vanaf de buitenzijde steriele DPBS toe. Verwijder overtollige DPBS van het weefsel door het insert voorzichtig te schudden en het op steriel absorptiepapier te drogen.

Breng vervolgens de gedroogde weefselinserts over naar de nieuwe zeswellplaat die vooraf is gevuld met assaymedium. Onthoud opnieuw dat al deze stappen binnen een interval van één minuut moeten worden uitgevoerd om de blootstellingstijd van 60 minuten voor elk blootgesteld monster te handhaven. Nadat het laatste weefsel is gespoeld, wordt het oppervlak van elk weefsel voorzichtig gedroogd met een steriel wattenstaafje.

Indien er nog sporen van de chemicaliën op het oppervlak aanwezig zijn, probeer deze dan te verwijderen met behulp van het steriele wattenstaafje. Incubeer de weefsels vervolgens gedurende de volgende 24 uur in de incubator. Noteer het starttijdstip van de incubatie op het documentatieblad van de methoden.

Noteer daarnaast alle verschillende toepassingen in het documentatieblad van de methode. Bijlage bij de standaardwerkwijze verstrekt door Mat Tech Corporation voor het verplaatsen van de platen in de zuurkast. Breng de insert over naar het onderste gedeelte van de zeswells-plaat die vooraf is gevuld met 0,9 milliliter medium.

Verzamel het medium uit de bovenste rij en breng dit over in een vooraf gelabelde 24-wellplaat, die vervolgens bij -20 °C wordt bewaard. De analyse van cytokinen en/of chemokinen die in het cultuurmedium zijn vrijgekomen, is een optionele stap voorafgaand aan de verdere analyse. Zet de incubatie voort voor nog 18 ± 3 uur voor de MTT-assay; label twee 24-wellplaten met de chemische namen of codes.

Houd er rekening mee dat MTT toxisch is, draag daarom altijd beschermende handschoenen tijdens het werken. Bereid de MTT-oplossing door het MTT-concentraat te ontdooien en te verdunnen met het MTT-verdunningsmiddel.

Bescherm tegen licht, aangezien MTT lichtgevoelig is, en gebruik de oplossing binnen twee tot drie uur. Omdat MTT na verloop van tijd degradeert, pipetteert u 300 µL MTT-medium in elke put van de 24-wells plaat. Haal nu de zes-wells platen uit de incubator.

Dep de onderkant van de inserts op blottingpapier en breng ze over naar de 24-wells plaat die vooraf is gevuld met MTT. Plaats de 24-wells plaat in de incubator en incubeer gedurende drie uur. Vergeet niet de starttijd van de MTT-incubatie in het MDS te noteren; houd de incubatietijd van drie uur strikt aan om variaties in de MTT-metingen te voorkomen. Wanneer de MTT-incubatie is voltooid, gebruik dan een vacuümpomp met een gifafvalval om het MTT-medium voorzichtig uit alle wells te aspireren.

Vul de wells opnieuw met DPBS en aspireer dit. Herhaal dit spoelen nog twee keer en zorg ervoor dat de weefsels droog zijn na de laatste aspiratie. Breng na het wassen de inserts over naar een nieuwe 24-wells plaat en dompel de inserts onder door voorzichtig twee milliliters extractie-oplossing in elke insert te pipetteren.

Het niveau zal boven de bovenranden van de insert stijgen, waardoor de weefsels aan beide zijden volledig worden bedekt. Seal de 24-wellplaat met een heat sealer of parafilm om lekkage van het extract en verdamping te voorkomen. Noteer het starttijdstip van de extractie in het methodedocument en extraheer gedurende ten minste twee uur bij kamertemperatuur met zachte schudbewegingen op een plaatshaker. Nadat de extractieperiode is voltooid, doorprikt u de inserts met een injectienaald of een pipet met bolvormige kop en laat u het extract in de well lopen waaruit de insert was gehaald.

Gooi de doorboorde inserts weg en pipetteer de oplossing in de well drie keer op en neer tot deze homogeen is. Per weefsel kan ook een plaatshaker worden gebruikt, ingesteld op 120 RPMs. Breng twee aliquots van 200 µL van de blauwe forma-oplossing over naar een 96-well vlakbodige microtiterplaat.

Breng de duplicaten over volgens het vaste plaatontwerp voor blanco's dat is vermeld in de spreadsheet bij dit videoprotocol. Gebruik ISO-propanol, lees de optische dichtheid of OD af met een 96-wellplaat-spectrofotometer bij een golflengte van 570 nanometers zonder gebruik van een referentiefilter. Voer de resultaten in de spreadsheet in voor automatische berekening van de resultaten.

Houd rekening met correcties als gevolg van interferentie door de teststof zoals beschreven in het bijbehorende protocol; een teststof wordt geclassificeerd als irriterend indien het percentage weefselviabiliteit gelijk is aan of lager is dan 50% na spectrofotometrische analyse, de OD 570 van de NC-weefsels groter dan of gelijk is aan 1 en kleiner dan of gelijk is aan 2,5, en de gemiddelde viabiliteit van PC-weefsels uitgedrukt als een percentage van de negatieve controleweefsels minder dan 20% is, en de SD berekend uit de individuele percentages weefselviabiliteit van drie identiek behandelde replica's minder dan 18% is. Verbindingen die celviabiliteitswaarden van minder dan 50% opleveren, kunnen worden beschouwd als irriterend.

We hebben zojuist aangetoond hoe u de gevalideerde huidirritatietest van 60 minuten en 42 uur uitvoert met het gereconstrueerde menselijke huidmodel Epiderm. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat het grootste deel van de test onder steriele of aseptische omstandigheden wordt uitgevoerd. Indien er behoefte is aan enige aanpassing van de methode of als u een betere uitleg nodig heeft van een van de procedurestappen, aarzel dan niet om contact met ons op te nemen voor hulp en advies.

Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.