Fluorescentie In situ Hybridisatie (FISH) Protocol in menselijk sperma

Het protocol voor fluorescentie in situ hybridisatie in menselijke spermakernen is op grote schaal geïntegreerd in het veld van de klinische diagnostiek. Een van de toepassingen van deze methodologie is de screening van de ploidie van spermatozoa. Als onderdeel van het reproductieadvies aan onvruchtbare mannen is gebleken dat de aanwezigheid van numerieke abnormaliteiten bij deze individuen hoger is dan in de algemene populatie, en zij vertonen vaak abnormale semenparameters.

Dit wijst op een verhoogd risico op de overdracht van deze anomalieën aan het nageslacht. Vandaag gaan we het protocol voor fluorescentie in situ hybridisatie illustreren in gedecondenseerde spermakernen voor de analyse van chromosomen 13, 18, 21, X en Y. Zodra het monster is verzameld, moet het 20 minuten bij kamertemperatuur blijven staan tot liquefactie heeft plaatsgevonden. Om het protocol te starten, moet het monster worden overgebracht naar een centrifugebuis.

De oplossingen die we in het eerste deel van het experiment gaan gebruiken, zijn hypertoon en voorverwarmd tot 37 °C en methanol-azijnzuur in een verhouding van drie op één. Deze moeten vers bereid zijn. Vervolgens is het monster klaar om gedurende vijf minuten te worden gecentrifugeerd bij 1000 ×g.

Verwijder nu voorzichtig het supernatant en voeg de hypertone oplossing druppel voor druppel toe tot een volume van ongeveer 10 milliliters is bereikt. Deze buis moet gedurende 30 minuten op 37 °C blijven, waarna het monster opnieuw gecentrifugeerd moet worden. Door centrifugatie verzamelen de spermatozoa zich op de bodem van de buis, waardoor we de hypotone oplossing kunnen vervangen door methanol.

Centrifugatie met azijnzuur moet worden herhaald en het mengsel van methanol en azijnzuur moet zo vaak worden vervangen als nodig is om een wit pellet te verkrijgen. Wanneer dit gebeurt, moet er meer methanol en azijnzuur worden toegevoegd. Het uiteindelijke volume moet worden aangepast op basis van de cellulaire dispersie die u wilt verkrijgen in verdere stappen.

De laatste stap is het maken van de uitstrijkjes door het gefixeerde monster op Reed-preparaten te druppelen die bewaard worden in methanol bij -20 °C. Het is nuttig om het gebied op het preparaat dat de sperma-uitstrijk dient te bevatten af te bakenen voor toekomstige lokalisaties. Dit kan eenvoudig worden gedaan met een diamantpotlood aan de andere zijde van het preparaat. Zodra een optimale cellulaire dispersie is geverifieerd, moeten de preparaten gedurende minimaal 24 uur bij -20 °C worden bewaard.

Voordat u verdergaat met het protocol. In dit deel van het experiment gaan we gebruikmaken van een zoutoplossing van natriumcitraat, een ethanolserie, DRE, fatal en fide. Wanneer de preparaten zijn ontdooid, moeten de gefixeerde monsters worden gewassen en gedehydrateerd door ze onder te dompelen in twee opeenvolgende Coplan-potten die 2× SSC bevatten.

Dit duurt drie minuten per ethanolbad. Vervolgens moeten de coupes gedurende twee minuten worden ondergedompeld in elk van de ethanolbaden in volgorde van toenemende concentratie. Op dit punt moeten de coupes worden uitgebracht en gedroogd om verder te kunnen gaan met de volgende fasen.

Aangezien het DNA in de kern van de zaadcel sterk gecondenseerd is, is het noodzakelijk om het chromatine te decondenseren voordat het gedenatureerd wordt. Dit kan worden gedaan met een DTT-oplossing bij 37 °C. Dit is een product dat werkt door de disulfidebruggen van de protamine te verbreken, welke het DNA in de kern van de spermatozoön opwikkelen. De incubatietijd van de slide in DTT moet worden aangepast op basis van de reactiviteit van het semenmonster op dit product.

Meestal duurt dit ongeveer acht minuten, hoewel dit kan variëren van twee tot 15 minuten. Na deze tijd moeten de coupes onmiddellijk worden overgebracht naar 2× SSC voor drie minuten en vervolgens nogmaals voor drie minuten, gevolgd door twee minuten in elk van de ethanolcoplan-potten. Voor de hybridisatie van de probe is het essentieel om met enkelstrengs DNA te werken. Dit vereist een denaturatiestap vóór de toevoeging van de probes, bestaande uit een incubatieperiode van vijf minuten in een formamide-oplossing bij 73 °C. Om de behandeling van de coupes af te sluiten, is een laatste overdracht naar de ethanoloplossing vereist, waarbij de coupes gedurende één minuut per coplan-pot worden ondergedompeld.

De objectglaasjes zijn vervolgens klaar voor hybridisatie in de FISH-onderzoeken die worden uitgevoerd voor klinische diagnostiek. De meest geanalyseerde chromosomen zijn de geslachtschromosomen en de chromosomen 13, 18 en 21. Om deze chromosomen te analyseren, maken we gebruik van een multicolor DNA-sondekit van Vices.

Dit bevat één vial met een sondecombinatie voor de alfa-satellietregio van chromosomen X, Y en 18, respectievelijk gelabeld met groen-origine en aqua, en een andere vial met een combinatie van sondes voor chromosomen 13 en 21, respectievelijk gelabeld met groen en oranje. Het volume van het toegevoegde sondemengsel varieert afhankelijk van de grootte van het gebied dat u wilt hybridiseren; voor een dekglas van 15 bij 15 dient een volume van vijf microliters als referentie en is voldoende.

Beide sonemengsels zijn voor gebruiksgemak vooraf gedenatureerd in een hybridisatiebuffer, zodat u ze direct aan de gedecondenseerde en gedenatureerde preparaten kunt toevoegen. Er zijn ook andere commerciële sones beschikbaar voor een breed scala aan chromosomen en loci die in deze experimenten kunnen worden gebruikt. Gewoonlijk vereisen deze sones echter een voorafgaande denaturatiebehandeling voordat het mengsel aan de doelmonsters wordt toegevoegd.

In deze situaties is het voldoende om de instructies van de fabrikant te volgen. Het doelgebied moet worden afgedekt met een dekglas en worden verzegeld met rubbercement. Vervolgens zijn de preparaten klaar om in de hybridisatiekamer te worden geplaatst, die is voorverwarmd tot 37 °C, en gedurende zes tot 24 uur bij die temperatuur te worden geïncubeerd.

In het laatste deel van het protocol maken we gebruik van deze twee wasoplossingen, bestaande uit verschillende concentraties van een zout natriumcitraatoplossing en het detergent NP 40. Na de incubatietijd kunnen de preparaten uit de hybridisatiekamer worden gehaald om de rubbercementresten te verwijderen. Neem vervolgens voorzichtig het dekglas eraf.

Zoals getoond, worden de preparaten gedurende twee minuten ondergedompeld in de eerste wasoplossing, die vooraf is opgewarmd tot 73 °C. Vervolgens worden ze voor nog een minuut overgebracht naar de tweede wasoplossing op kamertemperatuur. Deze twee wasbeurten helpen ons om alle aspecifieke hybridisatiesignalen te elimineren. Na deze twee wasbeurten moeten we wachten tot de preparaten zijn opgedroogd om de laatste stap van het protocol af te ronden.

Op dit punt wordt een tegenkleuringsproduct toegevoegd om de visualisatie van de celkernen te vergemakkelijken. Een van de meest gebruikte producten voor dit doeleinde is dpi. Het toegevoegde volume moet worden aangepast aan de grootte van het gehybridiseerde gebied, waarbij een dekglas van 18 bij 18 als referentie dient.

Een volume van 8 µL DPI is voldoende. Het dekglas kan worden afgesloten met nagellak; de preparaten zijn nu klaar om gevisualiseerd te worden. In alternatief kunnen ze worden bewaard bij -20 °C tot de beoogde analyse.

De microscoop die we voor de visualisatie gaan gebruiken, is een Olympus BX 60 epi-fluorescentiemicroscoop, uitgerust met een drievoudig banddoorlaatfilter voor dpi, Texas Red, FITC, en enkelvoudige banddoorlaatfilters voor aqua, FITC en Texas Red. Via het drievoudige banddoorlaatfilter toont het met x, Y en 18 gehybridiseerde preparaat signalen voor deze drie chromosomen. Met het enkelvoudige banddoorlaatfilter voor aqua kunnen we alleen de fluorescentiesignalen voor chromosoom 18 visualiseren. We mogen één van deze signalen in elke normale spermatozoon verwachten.

Wanneer echter het enkelbandige filter alleen voor FITC wordt gebruikt, vertonen sommige spermatozoön een groen fluorescent signaal dat overeenkomomt met het X-chromosoom. De spermatozoön die het groene signaal missen, zouden een rood signaal voor het Y-chromosoom moeten vertonen, wat specifiek gevisualiseerd kan worden via het filter voor Texas Red. Door de 1321-hybridisatie via het drievoudige bandenfilter te visualiseren, kunnen we signalen voor deze twee chromosomen onderscheiden.

Het groene signaal komt overeen met chromosoom 13 en kan specifiek worden gevisualiseerd met behulp van het single band-filter voor FITC. Het single band-filter voor Texas Red stelt ons in staat om specifiek de signalen voor chromosoom 21 te visualiseren. Alle normale spermatozoïen zouden één signaal voor elk van deze twee probes moeten vertonen.

Samengevat zijn dit de belangrijkste fasen van het protocol. Nogmaals: het fixatieproces moet nauwkeurig worden uitgevoerd om extensies van goede kwaliteit te verkrijgen, door het druppelsgewijs toevoegen van het methanol-azijnzuur. Om de vorming van spermagregaten tijdens het decondensatieproces te voorkomen, moet de incubatietijd in de DTT-oplossing worden aangepast op basis van de reactiviteit van het zaadmonster op dit product.

Overmatige blootstelling van de spermatozoa aan DTT zou leiden tot diffuse signalen aan het einde van het protocol, terwijl onvoldoende blootstelling zou resulteren in nul probe-hybridisatie en het ontbreken van sommige signalen. Waar de denaturatie van het spermaproefmonster verplicht is, moet de denaturatie van de probe worden aangepast aan de aanwijzingen van de fabrikant. Het is belangrijk om een strikte controle te houden over de tijd en temperatuur van de twee wasstappen na de hybridisatie.

Een hogere temperatuur of een overmatige wastijd kan leiden tot het wegvallen van sommige signalen, terwijl het tegenovergestelde aspecifieke signalen niet zou elimineren. Ten slotte is het gebruik van een epifluorescentiemicroscoop, uitgerust met geschikte specifieke filters, essentieel voor een goede visualisatie en signaalinterpretatie. En dat is alles.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.