Name: Fluorescentie In situ Hybridisatie (FISH) Protocol in menselijk sperma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-01T11:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 19 s
Description: Leer de FISH-protocollen voor het analyseren van chromosomale afwijkingen in menselijk sperma. Deze methode ondersteunt klinische diagnostiek bij onvruchtbare mannen en helpt bij het inschatten van genetische risico's.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Generalitat de Catalunya (2005-SGR00437). De auteurs danken aan J. Blanco en F. Vidal voor hun toezicht en aanmoediging, en J. Lucas voor zijn technische bijstand.

I. Voorbeeld verwerking en cel-fixatie <ol><li> Laat het sperma monster in steriele recipiënten bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten totdat het vloeibaar maken. </li><li> Breng het monster op een centrifugebuis en de spin het bij 1000g gedurende 5 minuten. </li><li> Verwijder voorzichtig en gooi het supernatant met behulp van een Pasteur pipet. </li><li> Voeg hypotone oplossing (KCl, 0.075M) voorverwarmde bij 37 ° C, druppel voor druppel, terwijl het mengen op een vortex tot een uiteindelijk volume van 10 ml te verkrijgen. </li><li> Plaats de buis in een waterbad bij 37 ° C gedurende 30 minuten. </li><li> Centrifugeer bij 1000g gedurende 5 minuten. Verwijder voorzichtig het supernatans door decanteren, zonder de pellet te verstoren. </li><li> Na resuspenderen de pellet, voeg vers bereide fixatief (3:1 methanol: azijnzuur) Carnoy&#39;s druppelsgewijs tijdens het mengen op een vortex tot een uiteindelijk volume van 8 ml te verkrijgen. </li><li> Herhaal de punten 6 en 7 zo vaak als nodig is om een ​​witte pellet te verkrijgen. </li><li> Voeg vers bereide methanol: ijsazijn (3:1) druppelsgewijs aan het uiteindelijke volume aan te passen aan de cellulaire concentratie die nodig is voor het verkrijgen van een goede spreiding cel (in die gevallen met een kleine pellets, zal paar druppels volstaan ​​terwijl monsters met een hoog bedrag van sperma hersteld, kan het uiteindelijke volume te bereiken 1-2 ml). Een test glijbaan kan worden gemaakt door het droppen van de geresuspendeerde monster op een niet ingevette glijbaan en de behandeling ervan onder een fase contrast microscoop. Dit zal verhuurd aan de verkregen cellulaire dispersie te controleren en in staat zou stellen te corrigeren, als het nodig is, in de verdere dia&#39;s. </li><li> Om de extensies, druppel uit een minimale hoogte van 40 cm twee of drie druppels celsuspensie in het centrum van unfrosted dia&#39;s (eerder opgeslagen in methanol bij -20 ° C om ze te ontvetten). Maken Om de locatie van het monster door het protocol, markeren het gebied met het sperma uitbreiding aan de andere kant van de dia met behulp van een diamant potlood. </li><li> Bewaar de dia&#39;s bij -20 ° C gedurende ten minste 24 uur. Opmerking: De toevoeging van methanol: ijsazijn (3:1) druppelsgewijs tijdens het mixen is een zeer belangrijke stap om de vorming van zaadcellen aggregaten te voorkomen. </li></ol> II. Decondensation <ol><li> De dia&#39;s worden opgeslagen bij -20 ° C worden ontdooid om verder te gaan met het protocol (laat ze op kamertemperatuur). </li><li> Plaats de dia in twee opeenvolgende Coplin potten met 2x zout-natriumcitraatoplossing (2xSSC) gedurende 3 minuten. </li><li> Overdracht van de glijbaan door een reeks van ethanol wasbeurten gedurende 2 minuten in elke Coplin pot. Begin met 70% ethanol, gevolgd door een 90% en eindig met 100%. Uitdrogen van de glijbaan laat het bij kamertemperatuur. </li><li> Incubeer de dia in dithiothreitol oplossing (1,4-dithiothreitol 5mm, 1% Triton X-100, 2-Amino-2-(hydroxymethyl) -1,3-propaandiol 50mm) bij 37 ° C in de incubator van de chromatine decondense. Dit product werkt door het breken van de disulfide bruggen van de protamines dat spoel het DNA in de kern spermatozoa. Dit is een zeer belangrijke stap, omdat het DNA in het sperma kern is zeer verdicht. De incubatietijd van de dia&#39;s in dithiothreitol oplossing (DTT) moeten worden aangepast aan het monster van de reactiviteit van dit product. Normaal gesproken, dit keer is het ongeveer 8 minuten, hoewel het kan variëren van 2 tot 15 minuten. </li><li> Onmiddellijk, overdracht van de dia om twee opeenvolgende Coplin potten met 2xSSC gedurende 3 minuten in elk Coplin. </li><li> Ga verder door het plaatsen van de foto door een reeks van ethanol wasbeurten gedurende 2 minuten in elke Coplin pot (70%, 90% en 100% ethanol). Laat de schuif uit te drogen bij kamertemperatuur. Let op: Overmatige blootstelling aan DTT zou resulteren in verspreiden FISH signalen aan het einde van de procedure, terwijl een te korte blootstelling zou resulteren in een gebrek aan sommige signalen. </li></ol> III. Hybridisatie <ol><li> Denatureren het sperma DNA door het incuberen van de dia in een Coplin pot met formamide oplossing (70% Formamide/2xSSC) bij 73 ° C gedurende 5 minuten. </li><li> Overdracht van de foto door de ethanol-oplossingen voor 1 minuut per Coplin pot (te beginnen met 70% ethanol, 85% en eindig met 100%). Laat de schuif uit te drogen bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg direct 5 l van de overeenkomstige kant-en-klare probe mengsel aan een 15x15 dekglas (AneuVysion Assay multi-color Probe Panel: CEP 18/X/Y of LSI 13/21). </li><li> Zoals is te zien in de video, plaatst u voorzichtig de slide op de cover slip samen te stellen het doelgebied en de probe mengsel. Afdichting met rubber cement. </li><li> Plaats de dia in een voorverwarmde 37 ° C hybridisatie kamer (HYBrite ™) en bij 37 ° C incuberen voor 6-24 uur. Let op: Overwegende dat de denaturatie van het sperma monster is verplicht, de noodzaak van de denaturering de sondes wordt bepaald door de fabrikant. De sonde mengsels die in dit protocol zijn klaar voor gebruik en, in dit geval, probe denaturatie is niet vereist. Het volume van de sonde mengsel is afhankelijk van de grootte van het gehybridiseerde gebied. </li></ol> IV. Wastpost-hybridisatie <ol><li> Haal de dia in de hybridisatie kamer. </li><li> Verwijder de rubber cement en trek het dekglas schuiven voorzichtig naar de zijkant. </li><li> Het elimineren van de niet-specifieke hybridisatie signalen plaats de schuif gedurende 2 minuten in een Coplin pot met 0.4xSSC/0.3% NP-40 voorverwarmd bij 73 ° C in een waterbad. </li><li> Overdracht van de dia naar een 2xSSC/0.1% NP-40 wassen oplossing bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut. Laat de schuif uit te drogen bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg een tegenkleuring product om de doelstelling regio (8 l voor een 18x18 dekglas). De meest gebruikte product is 4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Vysis Inc.) </li><li> Zoals is te zien in de video, dekking van de gehybridiseerd regio met een dekglas (voor de hybridisatie van de dekglas kan worden afgesloten met nagellak te behouden). </li><li> Bewaar gehybridiseerd dia&#39;s bij -20 ° C in het donker tot hun prospect analyse. Onder deze omstandigheden de dia&#39;s kan worden opgeslagen voor maximaal 12 maanden zonder grote verliezen in fluorescentie-signaal intensiteit. Opmerking: Een hogere temperatuur of een overmatige wassen tijd kan resulteren in de eliminatie van een aantal signalen, terwijl het omgekeerde niet zou wassen uit niet-specifieke probe hybridisaties. Het volume van de toegevoegde tegenkleuring product is afhankelijk van de grootte van het hybridisatie gebied te dekken. </li></ol> V. Visualisatie De preparaten kunnen geëvalueerd onder een epifluorescentiemicroscoop uitgerust met een triple-band filter voor DAPI / Texas Red / FITC en single-band filters voor Aqua, FITC en Texas Red. Standaard beoordelingscriteria moet worden gevolgd voor de correcte evaluatie van het sperma kernen 1. De voorbereiding gehybridiseerd met probes voor chromosomen X, Y en 18 moet worden weergegeven signalen voor deze drie chromosomen. Elke normale spermatozoa moeten laten zien een blauw-signaal (dat overeenkomt met het chromosoom 18), en een groen signaal (X-dragende spermatozoa) of een rood signaal (Y-dragende spermatozoa). In de voorbereiding gehybridiseerd met probes voor chromosomen 13 en 21, een groen signaal voor chromosoom 13 en een rood signaal voor chromosoom 21 dient te worden onderscheiden in elke normale spermatozoa.

<ol><li>Blanco, J., Egozcue, J., Vidal, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+chromosome+21+disomy+in+human+spermatozoa+as+determined+by+fluorescent+in-situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Incidence of chromosome 21 disomy in human spermatozoa as determined by fluorescent in-situ hybridization.</a> Hum. Reprod. 11, 722-726 (1996).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te verklaren.

Dit protocol beschrijft hoe menselijk sperma monsters proces voor het verkrijgen van sperma visbereidingen. Met behulp van dit protocol is het mogelijk om chromosomale afwijkingen te analyseren in mannelijke gameten. Spermatozoa aneuploidie screening heeft toepassingen hetzij in het kader van fundamenteel onderzoek en in de reproductieve advies aan onvruchtbare mannen. Hoewel in de klinische diagnose van de meest bestudeerde chromosomen zijn X, Y, 13, 18 en 21, andere commerciële probes voor een breed scala van chromoso...

<table><tbody><tr><td>1,4-Dithiothreïtol (DTT)</td><td>Materiaal</td><td>Roche Group</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>2-Amino-2-(hydroxymethyl)propaan-1,3-diol</td><td>Materialen</td><td>Roche Group</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>Azijnzuur</td><td>Materialen</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>100.063</td><td></td></tr><tr><td>AneuVysion&amp;#174; Multicolor DNA-sondekit&lt;ul style=&quot;padding:2px;&quot;&gt;&lt;li&gt;20x Saline-Natriumcitraat&lt;/li&gt;&lt;li&gt;4,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI II)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;CEP 18/X/Y DNA-sonde&lt;/li&gt;&lt;li&gt;NP-40&lt;/li&gt;&lt;li&gt;LSI 13/21 DNA-sonde&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td><td>Materiaal</td><td>Vysis Inc.</td><td>32-161075 &lt;ul style=&quot;padding:2px;&quot;&gt;&lt;li&gt;30-805850&lt;/li&gt;&lt;li&gt;30-804941 &lt;/li&gt;&lt;li&gt;30-171077&lt;/li&gt;&lt;li&gt;30-804820&lt;/li&gt;&lt;li&gt;30-171078&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5804R</td><td>Instrument</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifugebuis</td><td>Materiaal</td><td>Nalge Nunc international</td><td>347856</td><td></td></tr><tr><td>Coplin-pot (glas)</td><td>Materialen</td><td>Barloworld Scientific</td><td>Hellendahl (ZCT278)</td><td></td></tr><tr><td>Coplin-pot (plastic)</td><td>Materiaal</td><td>Deltalab</td><td>191087</td><td></td></tr><tr><td>Dekglasjes (15x15)</td><td>Materiaal</td><td>Knittel Glaser</td><td>4600115</td><td></td></tr><tr><td>Dekglasjes (18x18)</td><td>Materialen</td><td>Knittel Glaser</td><td>4600118</td><td></td></tr><tr><td>Diamanten kraspen</td><td>Materiaal</td><td>Hammacher</td><td>335117010</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Materiaal</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>100.983</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Materialen</td><td>Roche Group</td><td>11814320001</td><td></td></tr><tr><td>Vriezer</td><td>Instrument</td><td>Zanussi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Handschoenen</td><td>Materiaal</td><td>Sanyo</td><td>101/3300</td><td></td></tr><tr><td>HYBrite&amp;#8482;</td><td>Instrument</td><td>Vysis Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>immersie-olie</td><td>Materiaal</td><td>Olympus Corporation</td><td>35505</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Instrument</td><td>Heraeus Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Materiaal</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>106.009</td><td></td></tr><tr><td>Micropipet</td><td>Materiaal</td><td>Laboratuursystemen</td><td>Finnpipette (4500000)</td><td></td></tr><tr><td>Vervangingspunt voor micropipet</td><td>Materiaal</td><td>Daslab</td><td>16-2001</td><td></td></tr><tr><td>Nagellak</td><td>Materiaal</td><td>Quo-cosmetica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX60 epifluorescentiemicroscoop</td><td>Instrument</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>Uitgerust met een driebandsfilter voor DAPI/Texas Red/FITC en eenbandsfilters voor Aqua, FITC en Texas Red.</td></tr><tr><td>Pasteurpipet</td><td>Materiaal</td><td>Rubilabor</td><td>211.0230</td><td></td></tr><tr><td>Fasecontrastmicroscoop</td><td>Instrument</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastic pipet (3 ml)</td><td>Materialen</td><td>Deltalab</td><td>200007</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchloride (KCl)</td><td>Materiaal</td><td>Fluka</td><td>60128</td><td></td></tr><tr><td>Rubbercement</td><td>Materiaal</td><td>Beste test</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Preparaten</td><td>Materiaal</td><td>Knittel Glaser</td><td>4520022</td><td></td></tr><tr><td>Objectglassenvijlen</td><td>Materiaal</td><td>Deltalab</td><td>19276.1</td><td></td></tr><tr><td>Steriele container</td><td>Materiaal</td><td>Deltalab</td><td>409726</td><td></td></tr><tr><td>Spuit</td><td>Materialen</td><td>PentaFerte</td><td>002022300</td><td></td></tr><tr><td>Thermometer</td><td>Materialen</td><td>Comark Instruments, Inc</td><td>KM12</td><td></td></tr><tr><td>Trivoudig gedistilleerd water</td><td>Materiaal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Materiaal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Pincet</td><td>Materiaal</td><td>B. Braun Medical</td><td>Aesculap (BD224R)</td><td></td></tr><tr><td>Verticale laminaire stroming &lt;em&gt;laminaire flowkast&lt;/em&gt;</td><td>Instrument</td><td>Burdinola</td><td>OR-ST 1500</td><td></td></tr><tr><td>Vortexmixer</td><td>Instrument</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB15012</td><td></td></tr><tr><td>Waterbad</td><td>Instrument</td><td>Raypa&amp;#174;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescentie in situ hybridisatie (fish) protocol in menselijk sperma

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploïdieën zijn de meest voorkomende chromosomale afwijkingen bij de mens. De meeste van deze afwijkingen het gevolg zijn van fouten tijdens de meiose gametogene proces in de ouders. In de menselijke mannetjes, kunnen deze fouten leiden tot de productie van spermatozoa met numerieke chromosoomafwijkingen die een verhoogd risico van overdracht van deze afwijkingen aan het nageslacht te vertegenwoordigen. Om deze reden heeft de techniek van fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) op het sperma kernen wordt een protocol op grote schaal opgenomen in de context van de klinische diagnose. Deze werkwijze geeft een schatting van de frequenties van numerieke chromosoom afwijkingen in de gameten van de patiënten die zoeken naar genetische voortplanting advies. Tot op heden, de chromosomen het vaakst opgenomen in het sperma FISH analyse zijn chromosomen X, Y, 13, 18 en 21. Deze video-artikel beschrijft stap voor stap, hoe te verwerken en vast een menselijk sperma, hoe decondense en denatureren het sperma chromatine, hoe over te gaan tot zaadcellen visbereidingen te krijgen, en hoe u de resultaten op de microscoop zichtbaar te maken. Bijzondere opmerkingen van de meest relevante stappen worden gegeven aan de beste resultaten te bereiken.

Deze video-artikel beschrijft stap voor stap, hoe je een sperma monster proces om goede kwaliteit te bereiken fluorescentie<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie op de menselijke spermatozoa. Verkregen preparaten kunnen gebruikt worden voor aneuploidie screening in de context van de klinische diagnose.

Fluorescentie In situ Hybridisatie (FISH) Protocol in menselijk sperma

Aneuploïdieën zijn de meest voorkomende chromosomale afwijkingen bij mensen. De meeste van deze afwijkingen zijn het resultaat van meiotische fouten tijdens de gametogenese ...

Het protocol voor fluorescentie in situ hybridisatie in menselijke spermakernen is op grote schaal geïntegreerd in het veld van de klinische diagnostiek. Een van de toepassingen van deze methodologie is de screening van de ploidie van spermatozoa. Als onderdeel van het reproductieadvies aan onvruchtbare mannen is gebleken dat de aanwezigheid van numerieke abnormaliteiten bij deze individuen hoger is dan in de algemene populatie, en zij vertonen vaak abnormale semenparameters.Dit wijst op een verhoogd risico op de overdracht van deze anomalieën aan het nageslacht. Vandaag gaan we het protocol voor fluorescentie in situ hybridisatie illustreren in gedecondenseerde spermakernen voor de analyse van chromosomen 13, 18, 21, X en Y. Zodra het monster is verzameld, moet het 20 minuten bij kamertemperatuur blijven staan tot liquefactie heeft plaatsgevonden. Om het protocol te starten, moet het monster worden overgebracht naar een centrifugebuis.De oplossingen die we in het eerste deel van het experiment gaan gebruiken, zijn hypertoon en voorverwarmd tot 37 °C en methanol-azijnzuur in een verhouding van drie op één. Deze moeten vers bereid zijn. Vervolgens is het monster klaar om gedurende vijf minuten te worden gecentrifugeerd bij 1000 ×g.Verwijder nu voorzichtig het supernatant en voeg de hypertone oplossing druppel voor druppel toe tot een volume van ongeveer 10 milliliters is bereikt. Deze buis moet gedurende 30 minuten op 37 °C blijven, waarna het monster opnieuw gecentrifugeerd moet worden. Door centrifugatie verzamelen de spermatozoa zich op de bodem van de buis, waardoor we de hypotone oplossing kunnen vervangen door methanol.Centrifugatie met azijnzuur moet worden herhaald en het mengsel van methanol en azijnzuur moet zo vaak worden vervangen als nodig is om een wit pellet te verkrijgen. Wanneer dit gebeurt, moet er meer methanol en azijnzuur worden toegevoegd. Het uiteindelijke volume moet worden aangepast op basis van de cellulaire dispersie die u wilt verkrijgen in verdere stappen.De laatste stap is het maken van de uitstrijkjes door het gefixeerde monster op Reed-preparaten te druppelen die bewaard worden in methanol bij -20 °C. Het is nuttig om het gebied op het preparaat dat de sperma-uitstrijk dient te bevatten af te bakenen voor toekomstige lokalisaties. Dit kan eenvoudig worden gedaan met een diamantpotlood aan de andere zijde van het preparaat. Zodra een optimale cellulaire dispersie is geverifieerd, moeten de preparaten gedurende minimaal 24 uur bij -20 °C worden bewaard.Voordat u verdergaat met het protocol. In dit deel van het experiment gaan we gebruikmaken van een zoutoplossing van natriumcitraat, een ethanolserie, DRE, fatal en fide. Wanneer de preparaten zijn ontdooid, moeten de gefixeerde monsters worden gewassen en gedehydrateerd door ze onder te dompelen in twee opeenvolgende Coplan-potten die 2× SSC bevatten.Dit duurt drie minuten per ethanolbad. Vervolgens moeten de coupes gedurende twee minuten worden ondergedompeld in elk van de ethanolbaden in volgorde van toenemende concentratie. Op dit punt moeten de coupes worden uitgebracht en gedroogd om verder te kunnen gaan met de volgende fasen.Aangezien het DNA in de kern van de zaadcel sterk gecondenseerd is, is het noodzakelijk om het chromatine te decondenseren voordat het gedenatureerd wordt. Dit kan worden gedaan met een DTT-oplossing bij 37 °C. Dit is een product dat werkt door de disulfidebruggen van de protamine te verbreken, welke het DNA in de kern van de spermatozoön opwikkelen. De incubatietijd van de slide in DTT moet worden aangepast op basis van de reactiviteit van het semenmonster op dit product.Meestal duurt dit ongeveer acht minuten, hoewel dit kan variëren van twee tot 15 minuten. Na deze tijd moeten de coupes onmiddellijk worden overgebracht naar 2× SSC voor drie minuten en vervolgens nogmaals voor drie minuten, gevolgd door twee minuten in elk van de ethanolcoplan-potten. Voor de hybridisatie van de probe is het essentieel om met enkelstrengs DNA te werken. Dit vereist een denaturatiestap vóór de toevoeging van de probes, bestaande uit een incubatieperiode van vijf minuten in een formamide-oplossing bij 73 °C. Om de behandeling van de coupes af te sluiten, is een laatste overdracht naar de ethanoloplossing vereist, waarbij de coupes gedurende één minuut per coplan-pot worden ondergedompeld.De objectglaasjes zijn vervolgens klaar voor hybridisatie in de FISH-onderzoeken die worden uitgevoerd voor klinische diagnostiek. De meest geanalyseerde chromosomen zijn de geslachtschromosomen en de chromosomen 13, 18 en 21. Om deze chromosomen te analyseren, maken we gebruik van een multicolor DNA-sondekit van Vices.Dit bevat één vial met een sondecombinatie voor de alfa-satellietregio van chromosomen X, Y en 18, respectievelijk gelabeld met groen-origine en aqua, en een andere vial met een combinatie van sondes voor chromosomen 13 en 21, respectievelijk gelabeld met groen en oranje. Het volume van het toegevoegde sondemengsel varieert afhankelijk van de grootte van het gebied dat u wilt hybridiseren; voor een dekglas van 15 bij 15 dient een volume van vijf microliters als referentie en is voldoende.Beide sonemengsels zijn voor gebruiksgemak vooraf gedenatureerd in een hybridisatiebuffer, zodat u ze direct aan de gedecondenseerde en gedenatureerde preparaten kunt toevoegen. Er zijn ook andere commerciële sones beschikbaar voor een breed scala aan chromosomen en loci die in deze experimenten kunnen worden gebruikt. Gewoonlijk vereisen deze sones echter een voorafgaande denaturatiebehandeling voordat het mengsel aan de doelmonsters wordt toegevoegd.In deze situaties is het voldoende om de instructies van de fabrikant te volgen. Het doelgebied moet worden afgedekt met een dekglas en worden verzegeld met rubbercement. Vervolgens zijn de preparaten klaar om in de hybridisatiekamer te worden geplaatst, die is voorverwarmd tot 37 °C, en gedurende zes tot 24 uur bij die temperatuur te worden geïncubeerd.In het laatste deel van het protocol maken we gebruik van deze twee wasoplossingen, bestaande uit verschillende concentraties van een zout natriumcitraatoplossing en het detergent NP 40. Na de incubatietijd kunnen de preparaten uit de hybridisatiekamer worden gehaald om de rubbercementresten te verwijderen. Neem vervolgens voorzichtig het dekglas eraf.Zoals getoond, worden de preparaten gedurende twee minuten ondergedompeld in de eerste wasoplossing, die vooraf is opgewarmd tot 73 °C. Vervolgens worden ze voor nog een minuut overgebracht naar de tweede wasoplossing op kamertemperatuur. Deze twee wasbeurten helpen ons om alle aspecifieke hybridisatiesignalen te elimineren. Na deze twee wasbeurten moeten we wachten tot de preparaten zijn opgedroogd om de laatste stap van het protocol af te ronden.Op dit punt wordt een tegenkleuringsproduct toegevoegd om de visualisatie van de celkernen te vergemakkelijken. Een van de meest gebruikte producten voor dit doeleinde is dpi. Het toegevoegde volume moet worden aangepast aan de grootte van het gehybridiseerde gebied, waarbij een dekglas van 18 bij 18 als referentie dient.Een volume van 8 µL DPI is voldoende. Het dekglas kan worden afgesloten met nagellak; de preparaten zijn nu klaar om gevisualiseerd te worden. In alternatief kunnen ze worden bewaard bij -20 °C tot de beoogde analyse.De microscoop die we voor de visualisatie gaan gebruiken, is een Olympus BX 60 epi-fluorescentiemicroscoop, uitgerust met een drievoudig banddoorlaatfilter voor dpi, Texas Red, FITC, en enkelvoudige banddoorlaatfilters voor aqua, FITC en Texas Red. Via het drievoudige banddoorlaatfilter toont het met x, Y en 18 gehybridiseerde preparaat signalen voor deze drie chromosomen. Met het enkelvoudige banddoorlaatfilter voor aqua kunnen we alleen de fluorescentiesignalen voor chromosoom 18 visualiseren. We mogen één van deze signalen in elke normale spermatozoon verwachten.Wanneer echter het enkelbandige filter alleen voor FITC wordt gebruikt, vertonen sommige spermatozoön een groen fluorescent signaal dat overeenkomomt met het X-chromosoom. De spermatozoön die het groene signaal missen, zouden een rood signaal voor het Y-chromosoom moeten vertonen, wat specifiek gevisualiseerd kan worden via het filter voor Texas Red. Door de 1321-hybridisatie via het drievoudige bandenfilter te visualiseren, kunnen we signalen voor deze twee chromosomen onderscheiden.Het groene signaal komt overeen met chromosoom 13 en kan specifiek worden gevisualiseerd met behulp van het single band-filter voor FITC. Het single band-filter voor Texas Red stelt ons in staat om specifiek de signalen voor chromosoom 21 te visualiseren. Alle normale spermatozoïen zouden één signaal voor elk van deze twee probes moeten vertonen.Samengevat zijn dit de belangrijkste fasen van het protocol. Nogmaals: het fixatieproces moet nauwkeurig worden uitgevoerd om extensies van goede kwaliteit te verkrijgen, door het druppelsgewijs toevoegen van het methanol-azijnzuur. Om de vorming van spermagregaten tijdens het decondensatieproces te voorkomen, moet de incubatietijd in de DTT-oplossing worden aangepast op basis van de reactiviteit van het zaadmonster op dit product.Overmatige blootstelling van de spermatozoa aan DTT zou leiden tot diffuse signalen aan het einde van het protocol, terwijl onvoldoende blootstelling zou resulteren in nul probe-hybridisatie en het ontbreken van sommige signalen. Waar de denaturatie van het spermaproefmonster verplicht is, moet de denaturatie van de probe worden aangepast aan de aanwijzingen van de fabrikant. Het is belangrijk om een strikte controle te houden over de tijd en temperatuur van de twee wasstappen na de hybridisatie.Een hogere temperatuur of een overmatige wastijd kan leiden tot het wegvallen van sommige signalen, terwijl het tegenovergestelde aspecifieke signalen niet zou elimineren. Ten slotte is het gebruik van een epifluorescentiemicroscoop, uitgerust met geschikte specifieke filters, essentieel voor een goede visualisatie en signaalinterpretatie. En dat is alles.Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

fluorescence-in-situ-hybridization-fish-protocol-in-human-sperm

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hele monteren in situ hybridisatie is een van de meest gebruikte technieken in de ontwikkelingsbiologie. Hier presenteren wij een hoge resolutie dubbele fluorescente in situ hybridisatie protocol voor de analyse van de precieze expressiepatroon van een enkel gen en voor het bepalen van de overlap van de expressie-domeinen van twee genen. We nemen een propidiumjodide nucleair anti-vlek weefsel organisatie te markeren.

Zebravis hele Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridisatie

Dit artikel beschrijft de selectie van geschikte probes voor single-cell FISH, het verspreiden van technieken voor blastomeer kernen, en in situ hybridisatie en signaal scoren, toegepast op de pre-implantatie genetische diagnose (PGD) in een klinische setting.

FISH voor Pre-implantatie genetische diagnostiek

Fluorescerende<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie op Mitotische Chromosomen van muggen

Hier beschrijven we een geheel gemonteerde...

Hele Mount RNA TL<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie van<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo&#39;s

Hier beschrijven we een protocol voor gelijktijdige detectie van histonmodificaties door immunofluorescentie en DNA-sequenties van DNA FISH gevolgd door 3D microscopie en analyses (3D-immuno DNA FISH).

Gecombineerd Immunofluorescentie en DNA FISH op 3D-bewaarde interfase kernen aan veranderingen in 3D Nuclear Organisatie Studie

We beschrijven een robuuste en veelzijdige protocol voor de analyse nucleaire architectuur door 3D DNA FISH met direct gelabelde fluorescerende probes.

Robuuste 3D DNA FISH behulp direct gemerkt Probes

De zebravis, een kleine tropische vissen, is uitgegroeid tot een populair model voor het bestuderen van gen-functie tijdens gewervelde ontwikkeling en ziekte. De ruimtelijke en temporele expressie van de doelwitgenen worden...

Hoge resolutie Hele Mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie in zebravis embryo&#39;s om genexpressie en functie te bestuderen

Fluorescente in situ hybridisatie (FISH) maakt de detectie van nucleïnezuren in hun eigen omgeving binnen cellen. We beschrijven hier een protocol voor gecombineerde, gelijktijdige detectie van RNA en DNA door middel van FISH, die kan worden gebruikt om X-chromosoom inactivatie in muis embryonale stamcellen.

Gecombineerde DNA-RNA-TL<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie (FISH) aan X-chromosoom inactivatie studeren in Gedifferentieerde vrouwelijke muis embryonale stamcellen

Dit protocol beschrijft hoe beelden kunnen worden verkregen door in situ hybridisatie en immunohistochemie van embryonale secties van zebravissen te combineren. In situ hybridisatie werd uitgevoerd voorafgaand aan cryosectie, gevolgd door antilichaamkleuring. Het is nuttig om de expressiepatronen van twee genen in zebravissen te detecteren als er een tekort aan antilichamen is.

Ter plaatse Hybridisatie gecombineerd met immunohistochemie in cryosectie zebravisembryo's

Gezien hun eenvoudige anatomie bieden Anopheles-testikels een goed cytologisch model voor het bestuderen van spermatogenese. Dit protocol beschrijft whole-mount fluorescentie in situ hybridisatie, een techniek die wordt gebruikt om dit biologische proces te onderzoeken, evenals het fenotype van transgene stammen die mutaties herbergen in de genen die betrokken zijn bij de productie van sperma.

Whole-Mount Fluorescentie In Situ Hybridisatie om Spermatogenese in de Anopheles-mug te bestuderen

Leer de FISH-protocollen voor het analyseren van chromosomale afwijkingen in menselijk sperma. Deze methode ondersteunt klinische diagnostiek bij onvruchtbare mannen en helpt bij het inschatten van genetische risico's.

Fluorescentie In situ Hybridisatie (FISH) Protocol in menselijk sperma

Meer video's verkennen