Name: Het verkrijgen van zeer zuivere Toxoplasma gondii Oöcysten door een discontinue Cesium Chloride Gradient (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-03T16:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: Leer een gemodificeerde CsCl-methode voor het zuiveren van Toxoplasma gondii-oöcysten uit kattenfeces. Deze techniek levert hoogzuivere oöcysten geschikt voor moleculairbiologisch en weefselkweekonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen graag Nichole Brinkman en Michael Ware bedanken voor de technische beoordeling van het manuscript en dr. Abu Sayed en Linda Ransick voor technische en administratieve ondersteuning. De Verenigde States Environmental Protection Agency via haar Bureau voor Onderzoek en Ontwikkeling deels gefinancierd en meegewerkt aan de hier beschreven onderzoek onder contract nummer EP-D-06-096 aan Dynamac, Inc en een overkoepelende overeenkomst nummer DW-12-92289801-0 tot USDA. Het is onderworpen aan een Agentschap herzien en goedgekeurd voor publicatie. Vermelding van handelsnamen of commerciële producten vormt geen goedkeuring of aanbeveling voor gebruik. MJS huidige adres: Dynamac, Inc Cincinnati, OH.

<p class="jove_title"&gt; 1. Algemene veiligheidsmaatregelen bij het werken met<em&gt; T. gondii</em&gt; Oöcysten</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Het is belangrijk om alle voorzorgsmaatregelen te volgen bij het werken met<em&gt; T. gondii</em&gt; Oöcysten. De meeste gezonde mensen,<em&gt; T. gondii</em&gt; Infectie gemakkelijk onder controle gehouden door het immuunsysteem, maar een levenslange infectie resultaten. Immuungecompromitteerde personen zijn bijzonder gevoelig voor toxoplasmose en mogen niet omgaan met<em&gt; T. gondii</em&gt; Oöcysten. Zwangere vrouwen moeten ook niet omgaan met<em&gt; T. gondii</em&gt; Oöcysten, omdat de infectie kan ernstige geboorteafwijkingen<sup&gt; 8</sup&gt;.</li&gt;<li<em&gt; T. gondii</em&gt; Oöcysten mag alleen worden behandeld in een aangewezen gebied en met getraind personeel. Borden<em&gt; T. gondii</em&gt; Oocysten wordt gewerkt dient te worden geplaatst op anderen betreden het aangewezen gebied alert.</li&gt;<li&gt; Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), zoals een labjas, wegwerp schort, wegwerp handschoenen, en een goede oogbescherming of een gelaatsscherm bij het hanteren van<em&gt; T. gondii</em&gt; Oöcysten.</li&gt;<li&gt; Frequente handschoen veranderingen worden aanbevolen. Zijn er lab-apparatuur niet aan met<em&gt; T. gondii</em&gt; Oocysten verontreinigde handschoenen.</li&gt;<li&gt; Gebruik altijd metalen autoclaveerbaar bakken bekleed met een disposable absorberend liners bij het werken met<em&gt; T. gondii</em&gt; Oöcysten. Zorg ervoor dat alle racks, buizen, enz. gebruikt worden ofwel wegwerp-of autoclaveerbaar.</li&gt;<li&gt; Alle<em&gt; T. gondii</em&gt; Afval moet twee keer worden geautoclaveerd gedurende ten minste een uur.</li&gt;<li&gt; Alle niet-disposable materiaal (rekken, bakken, enz.) moet ook twee keer worden geautoclaveerd gedurende ten minste een uur.</li&gt;<li&gt; Vacuüm-lijnen gebruikt om vloeistoffen te zuigen moet worden aangesloten op een Vacushield ™ filter om verontreiniging van het vacuum pomp te voorkomen.</li&gt;<li&gt; Alle betrokken laboratorium bench-tops moet worden ontsmet, na het voltooien van het werk met<em&gt; T. gondii</em&gt; Oöcysten. Vers gemaakte 10% hypochloriet moet royaal worden toegepast op het werkgebied en mogelijk droog. Het gebied moet dan goed worden gespoeld met water.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; 2. De voorbereiding van de buffers en oplossingen</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Bereid een 1 L 2,2 M oplossing van sucrose door het oplossen van 752,66 g sucrose in 600 ml DDH<sub&gt; 2</sub&gt; O. Roer voorzichtig en warmte met behulp van een verwarmde roer plaat om de sucrose te ontbinden. Eenmaal volledig is opgelost, breng het volume op een L met DDH<sub&gt; 2</sub&gt; O. Dit moet worden gevolgd door sterilisatie in de autoclaaf de oplossing ten minste 20 minuten.</li&gt;<li&gt; Bereid een 1L TE-buffer (50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA), pH 7,2 door toevoeging van 6,05 g Tris-HCl en 3,7 g EDTA in 700 ml van DDH<sub&gt; 2</sub&gt; O, breng de pH op 7,2 te brengen dan het volume op een L met DDH<sub&gt; 2</sub&gt; O.</li&gt;<li&gt; Voor de CsCl gradiënt, bereiden een voorraad oplossing van CsCl met een soortelijk gewicht van 1,15 (1,15-CsCl) door het toevoegen van 21,75 g van CsCl met 103,25 ml TE-buffer. Voor oplossing A, mix 30 ml van TE met 20 ml van 1.15-CsCl. Voor oplossing B, mix 20 ml van TE met 30 ml van 1.15-CsCl en 12,5 ul van fenolroodoplossing. Voor oplossing C, meng 10 ml van TE met 40 ml van de 1,15-CsCl (tabel 1).</li&gt;<li&gt; Maak een 1L 1 N oplossing van natriumhydroxide (NaOH) door het oplossen van 40 g NaOH, in 800 ml van DDH<sub&gt; 2</sub&gt; O. Eenmaal opgelost, breng het volume op een L met DDH<sub&gt; 2</sub&gt; O.</li&gt;<li&gt; Bereid een 1 L 2% (in volume) oplossing van H<sub&gt; 2</sub&gt; SO<sub&gt; 4</sub&gt; Mengen 20 ml H<sub&gt; 2</sub&gt; SO<sub&gt; 4</sub&gt; Met 980 ml van DDH<sub&gt; 2</sub&gt; O.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; 3. Sucrose zweven</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Voeg 10 ml van een suspensie van fecale<em&gt; T. gondii</em&gt; Oöcysten, in 2% H<sub&gt; 2</sub&gt; SO<sub&gt; 4</sub&gt;, In een 50 ml conische centrifugebuis. Opgemerkt moet worden dat de fecale suspensie verwijst naar de monsters die zijn pre-verwerkt door een sucrose flotatie procedure zoals eerder beschreven<sup&gt; 8</sup&gt;. Wanneer de fecale monsters in eerste instantie worden geoogst van de geïnfecteerde katten die worden verwerkt door een sucrose zweven, zoals beschreven in referentie 8. Deze extra sucrose float is nodig om verder te minimaliseren fecale puin overgedragen naar de CsCl zuiveringsproces en de zuiverste verkrijgen<em&gt; T. gondii</em&gt; Oöcysten mogelijk te maken.</li&gt;<li&gt; Neutraliseer de 2% H<sub&gt; 2</sub&gt; SO<sub&gt; 4</sub&gt; Door het toevoegen van 6 ml (3 / 5 volumes) van 1 N NaOH tot de fecale suspensie. Meng goed door vortexen.</li&gt;<li&gt; Voeg een gelijk volume (16 ml) van 2,2 M sucrose het creëren van een uiteindelijke concentratie van 1,1 M om de uitwerpselen schorsing en meng goed door vortexen.</li&gt;<li&gt; Voorzichtig overlay de sucrose / fecale suspensie met 10 ml DDH<sub&gt; 2</sub&gt; O met behulp van een pipet van 10 ml. Centrifugeer de suspensie bij 1200 xg gedurende 20 min bij kamertemperatuur zonder rem.</li&gt;<li&gt; Zorgvuldig verzamelen boven water en de interfase lagen en over te dragen aan een nieuwe 50 ml conische centrifugebuis door pipetteren van de lucht-water interface zonder wervelende de pipet. Het is belangrijk om sucrose overdracht te minimaliseren, terwijl het verzamelen van de interfase laag.</li&gt;<li&gt; Meng de rest van sucrose / fecale pellet-oplossing door vortexen de buis.</li&gt;<li&gt; Herhaal de stappen 3.4 en 3.5.</li&gt;<li&gt; Breng het volume van de twee oocysten interfase oplossingen tot 50 ml met DDH<sub&gt; 2</sub&gt; O en centrifugeer de buizen op 2.000 xg gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.</li&gt;<li&gt; Het supernatans van elke buis en resuspendeer pellets samen Zuig met 5 ml TE-buffer en het zwembad van het oocysten schorsing. Het totale volume gepoolde moet 10 ml zijn.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; 4. CsCl gradiënt</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Bereid een discontinue CsCl gradiënt in een 50 ml polycarbonaat Oak Ridge buis door zorgvuldig onderliggende elke laag met behulp van een 50 ml spuit met een 18 gauge stompe, autoclaveerbaar, stalen naald, en een 2-weg stop pik. Let op: Fenolrood wordt toegevoegd aan Oplossing B gemakkelijk onderscheid te maken tussen de helling lagen (tabel 1).</li&gt;<li&gt; Voeg langzaam de volgende oplossingen om de buis in de volgorde hieronder. Opgemerkt moet worden dat het debiet niet meer dan 0,5 ml / sec te overschrijden.<ol&gt;<li&gt; 10 ml van de TE / oocysten schorsing monster</li&gt;<li&gt; 8 ml Oplossing A</li&gt;<li&gt; 8 ml Oplossing B</li&gt;<li&gt; 8 ml Oplossing C</li&gt;</ol&gt;</li&gt;<li&gt; Centrifugeer het Oak Ridge buis bij 12.000 xg gedurende 60 min bij 4 ° C zonder rem. Het gebruik van een vaste hoek rotor is acceptabel, maar een hoge snelheid swingende emmer resulteert in een betere scheiding van de oöcysten van de suspensie monster met een minimale fecale puin vlekken langs de zijkant of de buis. De omvang van de uitstrijkjes is afhankelijk van de samenstelling van de fecale suspensie en dus kan het nodig zijn om twee CsCl hellingen uit te voeren als de fecale suspensie is erg vuil.</li&gt;<li&gt; Na centrifugatie, de ondoorzichtige / wit oocysten bevatten band tussen oplossingen A en B. verzamelen om besmetting met fecale puin te minimaliseren, ga direct naar de oocysten band zonder verstoring van de gradiënt en het verzamelen van de oocysten interfase met behulp van een pipet van 10 ml. Breng de oocysten interfase om een ​​nieuwe 50 ml conische centrifugebuis. Probeer om de hoeveelheid aangezogen CsCl oplossing te minimaliseren, terwijl het verzamelen van de oocysten interfase als het kan een probleem in pelleteren de oöcysten tijdens de wasstap pose.</li&gt;<li&gt; Was oöcysten met 30-40 ml van DDH<sub&gt; 2</sub&gt; O. Centrifugeer de buis bij 2000 xg bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten met geen rem. Voorzichtig het supernatans aspireren zonder de oocysten pellet. Herhaal het wassen 2 keer extra.</li&gt;<li&gt; Aan het einde van de laatste wassen, zorgvuldig aspireren het supernatant en resuspendeer de pellet in 10 ml 2% zwavelzuur en bewaren bij 4 ° C tot gebruik. Oöcysten zijn nu klaar voor verdere manipulatie. Oocysten zuiverheid kan microscopisch worden gecontroleerd door de afwezigheid van fecale puin in het monster.</li&gt;</ol

<ol><li>Dubey, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+viable+Toxoplasma+gondii+in+beef%2C+chicken%2C+and+pork+from+retail+meat+stores+in+the+United+States%3A+risk+assessment+to+consumers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Prevalence of viable Toxoplasma gondii in beef, chicken, and pork from retail meat stores in the United States: risk assessment to consumers.</a> J. Parasitol. 91, 1082-1093 (2005).</li>
<li>Tenter, A. M., Heckeroth, A. R., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+from+animals+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: from animals to humans.</a> Int. J. Parasitol. 30, 1217-1258 (2000).</li>
<li>Bowie, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outbreak+of+toxoplasmosis+associated+with+municipal+drinking+water%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Outbreak of toxoplasmosis associated with municipal drinking water.</a> Lancet. 350, 173-177 (1997).</li>
<li>Moura, L. de <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Waterborne+toxoplasmosis%2C+Brazil%2C+from+field+to+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Waterborne toxoplasmosis, Brazil, from field to gene.</a> Emerg. Infect. Dis. 12, 326-329 (2006).</li>
<li>Jones, J. L., Dubey, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Waterborne+toxoplasmosis+-+Recent+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Waterborne toxoplasmosis - Recent developments.</a> Exp. Parasitol. doi: 10.1016/j.exppara.2009.03.013, (2009).</li>
<li>Dumetre, A., Darde, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+detect+Toxoplasma+gondii+oocysts+in+environmental+samples%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">How to detect Toxoplasma gondii oocysts in environmental samples.</a> FEMS Microbiol. Rev. 27, 651-661 (2003).</li>
<li>Dumetre, A., Darde, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Toxoplasma+gondii+oocysts+by+cesium+chloride+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Purification of Toxoplasma gondii oocysts by cesium chloride gradient.</a> J. Microbiol. Methods. 56, 427-4230 (2004).</li>
<li>Dubey, J. P. Toxoplasmosis of Animals and Man. , 2nd Edition, CRC Press, Inc. Boca Raton, FL. (2009).</li>
</ol>

het verkrijgen van zeer zuivere toxoplasma gondii oöcysten door een discontinue cesium chloride gradient

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Toxoplasma gondii is een obligaat intracellulaire protozo ziekteverwekker die vaak infecteert mensen. Het is een goed gekarakteriseerde apicomplexan in verband met het veroorzaken van voedsel-en water-gedragen ziekte-uitbraken. De definitieve gastheer is de kat soort waar seksuele replicatie plaatsvindt resulteert in de ontwikkeling van de zeer besmettelijke en milieuvriendelijk bestendig oocysten. Besmetting vindt plaats via inname van weefsel cysten van besmet vlees of oöcysten uit de bodem of water. Infectie is meestal asymptomatisch bij gezonde personen, maar resulteert in een levenslange latente infectie die kan activeren waardoor toxoplasmic encefalitis en de dood als het individu wordt verzwakt immuunsysteem. Vlees besmet met T. gondii cysten zijn de primaire bron van besmetting in Europa en de Verenigde Staten, maar de recente veranderingen in het diermanagement en veehouderijpraktijken en verbeterde voedingsmiddelen en-verwerking procedures aanzienlijk verminderd de prevalentie van T. gondii cysten in vlees 1, 2. Toch seroprevalentie in de mens blijft relatief hoog wat suggereert dat de blootstelling van oocysten verontreinigde grond of water waarschijnlijk is. Sterker nog, watergedragen uitbraken van toxoplasmose gemeld wereldwijde ondersteuning van de theorie van de blootstelling aan de milieu-oocysten formulier vormt een belangrijke risico voor de gezondheid 3-5. Tot op heden is het onderzoek naar het begrijpen van de prevalentie van T. gondii oöcysten in het water en het milieu zijn te wijten aan het gebrek aan tools om oöcysten te detecteren in het milieu 5, 6 beperkt. Dit is voornamelijk te wijten aan het ontbreken van een efficiënte zuivering protocollen voor het verkrijgen van een groot aantal zeer gezuiverd T gondii oöcysten van geïnfecteerde katten voor onderzoeksdoeleinden. Deze studie beschrijft de ontwikkeling van een aangepaste CsCl methode die gemakkelijk zuivert T. gondii oöcysten uit uitwerpselen van geïnfecteerde katten die geschikt zijn voor moleculair-biologische en weefselkweek manipulatie 7.

Deze studie beschrijft de ontwikkeling van een aangepaste CsCl methode die gemakkelijk T. gondii oöcysten zuivert van uitwerpselen van geïnfecteerde katten die geschikt zijn voor moleculair-biologische en weefselkweek manipulatie

Het verkrijgen van zeer zuivere Toxoplasma gondii Oöcysten door een discontinue Cesium Chloride Gradient

Toxoplasma gondii is een obligaat intracellulair protozoaire pathogeen die vaak mensen infecteert. Het is een goed gekarakteriseerde apicomplexaan die geassocieerd wordt met ...

Toxoplasma gondii oöcysten worden doorgaans verkregen uit feces van besmette katten en geïsoleerd middels een flotatieprocedure, wat resulteert in een gedeeltelijk gezuiverde suspensie voor moleculaire studies en weefselkweek. Experimenten met deze parasiet vereisen echter sterk gezuiverde oöcysten om dit te bereiken. Oöcysten worden verder gezuiverd via een sucroseflotatiestap, waarbij de oöcysten worden geresuspendeerd en sucrose wordt overlaagd met water, waarna centrifugatie plaatsvindt om de oöcysten te scheiden van het grootste deel van het fecale materiaal.De osis-laag wordt vervolgens overgebracht naar een nieuwe buis met een onderlaag van cesiumchloride en gecentrifugeerd. De resulterende duidelijke OSIS-band wordt daarna opgevangen en gewassen, klaar voor gebruik in experimenten waarbij zeer gezuiverde teon io assist vereist is. Hallo, ik ben Dr. Sarah Staggs, medewerker van Dynam, een aannemer voor het National Exposure Research Laboratory van de US Environmental Protection Agency.Vandaag laten we u een procedure zien voor het zuiveren van Toxoplasma gondii oöcysten uit de feces van geïnfecteerde laboratoriumkatten met behulp van een discontinue cesiumchloride-gradiënt. Deze procedure wordt in ons laboratorium routinematig gebruikt om oöcysten te isoleren ten behoeve van moleculaire biologie- en weefselkulturexperimenten. Laten we beginnen.Voordat er wordt gestart met het werken met TG O Osis, moeten belangrijke veiligheidsoverwegingen in acht worden genomen. Personen die immuungecompromitteerd zijn, zwanger zijn of actief proberen zwanger te worden, mogen het pathogeen niet hanteren vanwege het risico op het oplopen van toxoplasmose, wat kan leiden tot ziekte en ernstige geboorteafwijkingen. X.Om het risico op infectie te verminderen, dient er een aangewezen ruimte voor deze procedure te worden ingericht en moeten er waarschuwingsbordjes worden geplaatst om anderen te waarschuwen voordat zij de ruimte betreden.Vergeet niet een labjas, een wegwerpschort, wegwerphandschoenen en een geschikte oogbescherming of een gelaatsscherm te dragen bij het hanteren van T-One IO-cysten. Zorg ervoor dat u uw handschoenen vaak wisselt en vermijd het aanraken van apparatuur met besmette handschoenen. Het is daarnaast belangrijk om te werken op autoclaafbare metalen trays die zijn voorzien van absorberende wegwerpvoeringen.In dat kader is het raadzaam om even te controleren of alle rekjes, buisjes en overige apparatuur die u van plan bent te gebruiken, ofwel wegwerpbaar ofwel autoclaafbestendig zijn. Indien u niet-wegwerpartikelen gebruikt, dient u deze na gebruik te autoclaven gedurende twee cycli van één uur. Sluit daarnaast alle vacuümleidingen aan op een vacuümbeschermingsfilter om contaminatie van de vacuümpomp te voorkomen.Wanneer u klaar bent met het isoleren van cysten, dient u een verse 10% hypochlorite-oplossing aan te brengen op uw werkoppervlak. Laat dit drogen en spoel het gebied vervolgens meerdere keren af met water. Zodra de juiste veiligheidsmaatregelen zijn getroffen, kunt u verdergaan met uw experimenten.Vóór de collectie van T Guni OYS moeten eerst alle benodigde oplossingen voor de sucrose-, float- en cesiumchloridegradiënt worden klaargemaakt. Centrifugatiestappen. De benodigde oplossingen omvatten een 2,2 M sucrose-oplossing, gesteriliseerd via een cyclus van 20 minuten in de autoclaaf, één liter TE-buffer pH 7,2, een 1 N natriumhydroxide-oplossing, een 2% zwavelzuuroplossing en een cesiumchloride-stockoplossing met een relatieve dichtheid van 1,15.De 1.15 caesiumchloride-stamsoplossing wordt gebruikt om oplossingen A, B en C te maken, die vervolgens worden aangewend voor het bereiden van de caesiumchloridegradiënt. Oplossing A wordt bereid door 30 milliliters TE te mengen met 20 milliliters van de 1.15 caesiumchloride-stamsoplossing. Oplossing B wordt bereid door 20 milliliters TE te mengen met 30 milliliters van de 1.15 caesiumchloride-stamsoplossing, waarna 12.5 µL fenolroodoplossing wordt toegevoegd. Ten slotte wordt oplossing C bereid door 10 milliliters TE te mengen met 40 milliliters van de 1.15 caesiumchloride-oplossing.We beginnen met de voorbereiding van de sucrose-float door 10 milliliter fecale suspensie van T osis in 2% zwavelzuur te nemen en deze over te brengen naar een conische centrifugebuis van 50 milliliter. De fecale materie is afkomstig van feces van geïnfecteerde katten die reeds is verwerkt via een sucrose-floatprocedure zoals eerder beschreven in een tekstboek van Dr. JP Duby, getiteld Toxoplasmosis of Animals and Humans. Deze aanvullende stap vermindert de hoeveelheid fecale resten in het cesiumchloride-zuiveringsproces verder en helpt om de hoogste zuiverheid van de T goi-cysten te bereiken.Vervolgens neutraliseren we het zwavelzuur door drie vijfde van het volume van een een normaal natriumhydroxide-oplossing toe te voegen aan de fecale suspensie. Meng de suspensie goed door te vortexen. Voeg daarna een gelijk volume sucrose toe en meng de suspensie goed door te vortexen.Gebruik een pipette van 10 milliliter om de sucrose-fecesсусpensie voorzichtig te bedekken met 10 milliliter dubbel gedestilleerd water. Plaats de buizen vervolgens voorzichtig in de centrifuge en centrifugeer deze gedurende 20 minuten bij 1200 ×g bij kamertemperatuur, zonder vertraging na het centrifugeren. Trek voorzichtig met de pipette vanaf de lucht-waterinterface om de bovenste water- en interfacelaag op te vangen, waarbij u erop let dat de pipette niet overvult.Het is zeer belangrijk om te proberen de hoeveelheid sucrose-laag die wordt meegenomen te minimaliseren tijdens het verzamelen van de interfacelaag. Breng deze lagen over naar een nieuwe conische centrifugebuis van 50 milliliter. Vortex de buis om de resterende sucrose-fecale pelletoplossing te mengen.Herhaal de vorige wateroverlay bij de centrifugatiestappen nogmaals. Verzamel na het centrifugeren de bovenste waterlaag en de interfacelaag en breng deze over naar een nieuwe buis. Gebruik dubbel gedestilleerd water om het volume van de twee oocyst-interfaceloplossingen aan te vullen tot 50 milliliters.Centrifugeer de buisjes vervolgens 10 minuten bij 2000 ×g op kamertemperatuur. Aspireer tot slot het supernatant uit elke buis. Resuspendeer de pellets in vijf milliliter theebuffer en centrifugeer de suspensies.De osomen zijn nu klaar voor de cesiumchloride-gradiëntstap. We beginnen met het voorbereiden van een discontinue cesiumchloride-gradiënt in een polycarbonaat Oak Ridge-buis van 50 milliliter. Voeg 10 milliliter van de suspensie met TE en osomen toe aan de polycarbonaatbuis met behulp van een spuit van 50 milliliter met een autocleefbare stalen naald met stomp uiteinde van 18 gauge.Voeg met een tweeweg-stopkraan langzaam de volgende oplossingen direct aan de bodem van de buis toe: 8 mL van oplossing A, 8 mL van oplossing B en 8 mL van oplossing C. Zorg ervoor dat de stroomsnelheid 0,5 mL per seconde niet overschrijdt. Het is ook belangrijk op te merken dat het fenolrood in oplossing B helpt om de gradiëntlagen te onderscheiden.U kunt nu de Oak ridge-buis centrifugeren bij 12,000 ×g gedurende 60 minuten bij vier graden Celsius zonder remactie, met gebruik van een rotor met vaste hoek en hoge snelheid. Nu de centrifugatie is voltooid, verzamelen we de ondoorzichtige witte band tussen oplossing A en B. Deze band bevat de oocyten. Gebruik een pipet van 10 ml om rechtstreeks naar de band met oocyten te gaan zonder de gradiënt te verstoren en verzamel de oocyten.Probeer de hoeveelheid cesiumchloride-oplossing die u aspireert tijdens het verzamelen van de cysten te minimaliseren, omdat een overmaat aan cesiumchloride het pelletteren van de cysten tijdens de wasstap kan bemoeilijken. Breng de OSIS vervolgens over naar een nieuwe conische centrifugebuis van 50 milliliter. Was de O-cysten nu met 30 tot 40 milliliters dubbel gedestilleerd water en centrifugeer de buis daarna 10 minuten bij 2000 ×g bij kamertemperatuur zonder remming; aspireer voorzichtig het supernatant, waarbij u erop let dat de pellet van O-cysten niet wordt verstoord.Herhaal de wasbeurt nog twee keer. Zodra de laatste wasbeurten zijn voltooid, wordt het supernatant voorzichtig afgezogen en wordt het pellet geresuspendeerd in 10 milliliters 2% zwavelzuur. Controleer de OSIS onder de microscoop om er zeker van te zijn dat alle fecale resten succesvol uit het monster zijn verwijderd.De oöcysten zijn nu klaar voor verdere manipulatie, of u kunt ze bewaren bij vier graden Celsius totdat u ze wilt gebruiken. Hier ziet u hoe ongezuiverde oöcysten eruitzien met een differentiaal-interferentiecontrastmicroscoop bij een 400 x vergroting. Let op de aanwezigheid van grote hoeveelheden fecale contaminanten in het gezichtsveld, waardoor het zeer moeilijk is om de oöcysten te identificeren.Hier is hoe de OISS eruitzien onder 400 x na het zuiveringsprotocol met een cesiumchloridegradiënt. Let op de afwezigheid van fecaal debris. We hebben u zojuist laten zien hoe u Toxoplasma gondii kunt zuiveren uit de feces van laboratoriumgeïnfecteerde katten met behulp van een discontinue cesiumchloridegradiënt.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om alle veiligheidsrichtlijnen te volgen en altijd voorzichtig te zijn bij het aanleggen van de cesiumchloride-gradiënt door elke laag zeer langzaam toe te voegen en te voorkomen dat de gradiënt wordt verstoord of vermengd. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

obtaining-highly-purified-toxoplasma-gondii-oocysts-discontinuous

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Forward genetica is een krachtige methode om moleculair niveau te ontrafelen van...

Een genetische screen te isoleren Toxoplasma gondii Host-cel Egress Mutants

Dit protocol beschrijft het gebruik van een tangentiële stroming holle-fiber ultrafiltratie monsterconcentratie en een warmte dissociatie als andere stappen voor het detecteren van...

Een aangepaste EPA-methode 1623, dat tangentiële Flow holle-vezel ultrafiltratie en warmte Dissociatie stappen gebruikt om te detecteren op waterbasis<em&gt; Cryptosporidium</em&gt; En<em&gt; Giardia spp.</em

This video demonstrates the cation exchange chromatography technique to isolate recombinant protein from the insect cell protein lysate.

Cation Exchange Chromatography: A Technique to Isolate Target Recombinant Protein from Insect Cell Lysate Based on Net Surface Charge

In this video, we demonstrate an in vitro method to purify sporozoites from thick-walled oocysts of the pathogenic parasite Cryptosporidium parvum. The isolated sporozoites can be used for infection studies.

In Vitro Sporozoite Isolation from Cryptosporidium parvum Oocysts

This video demonstrates a microinjection technique to develop a human intestinal organoid infection model. The infectious sporozoite stage of the parasite Cryptosporidium parvum is microinjected into the organoid lumen. Upon invading the epithelial cells of the organoid, it undergoes asexual and sexual reproduction to complete its life cycle and spreads the infection.

A Technique to Develop a Parasite Infection in Intestinal Organoids via Microinjection

Het meten van antilichaam-functie is de sleutel tot het begrijpen van immuniteit tegen Plasmodium falciparum malaria. Deze methode beschrijft de zuivering van levensvatbare merozoïeten en meting van opsonisatie-afhankelijke fagocytose door flowcytometrie.

High Yield Zuivering van<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoïeten Voor gebruik in opsoniserende antilichaamassays

Deze methode van trypanosoom afscheiding van bloed is afhankelijk van hun oppervlakte lading minder negatief dan bloed zoogdiercellen. Geïnfecteerd bloed is geplaatst en worden behandeld op een anionenwisselaar kolom. Deze methode, de meest passende diagnose voor slaapziekte, biedt gezuiverde parasieten voor immunologische, biologische, biochemische, farmaceutische en moleculaire biologie onderzoek.

Zuivering van extracellulaire trypanosomen, met inbegrip van Staten in Afrika, van bloed door Anion-wisselaars (Diethylaminoethyl-gemengd met cellulose kolommen)

Dit papier is een protocol voor de voorbereiding van een co-cultuur van crypto Kokken cellen en eencellige die wordt bestudeerd met behulp van stilstaand, fluorescerende beelden en hoge-resolutie transmissie elektronen microscoop beelden. Hier wordt geïllustreerd hoe kwantitatieve gegevens dergelijke kwalitatieve informatie kunnen aanvullen.

Aanvullend gebruik van microscopische technieken en fluorescentie lezen in het bestuderen van interacties Cryptococcus-amoeba

We beschrijven protocollen voor het bereiden van oöcysten en zuiveren sporozoieten voor het bestuderen van infectie van menselijke intestinale en luchtweg organoïden door Cryptosporidium parvum. We demonstreren de procedures voor micro injectie van parasieten in het intestinale organoïde lumen en immunokleuring van organoïden. Tot slot beschrijven we de isolatie van gegenereerde oöcysten uit de organoïden.

Het bestuderen van Cryptosporidium infectie in 3D-weefsel-afgeleide menselijke Organoid cultuur systemen door Microinjection

Hier beschrijven we in vitro kweekomstandigheden, isolatie en verhoogde aanmaak van extracellulaire blaasjes (EV's) van Echinococcus granulosus. De kleine EV's werden gekenmerkt door dynamische lichtverstrooiing en transmissie-elektronenmicroscopie. De opname door beenmerg-afgeleide dendritische cellen en hun fenotypische modulatie werden bestudeerd met behulp van confocale microscopie en flowcytometrie.

Isolatie en dendritische celopname van kleine extracellulaire blaasjes van Echinococcus granulosus

Leer een gemodificeerde CsCl-methode voor het zuiveren van Toxoplasma gondii-oöcysten uit kattenfeces. Deze techniek levert hoogzuivere oöcysten geschikt voor moleculairbiologisch en weefselkweekonderzoek.

Het verkrijgen van zeer zuivere Toxoplasma gondii Oöcysten door een discontinue Cesium Chloride Gradient

Meer video's verkennen