Name: RNA isolatie van embryonale zebravis en cDNA synthese voor de analyse van genexpressie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-07T16:40:00.000+00:00
Duration: 15 min 21 s
Description: Leer RNA-isolatie van embryonale zebravis en cDNA-synthese voor genexpressieanalyse. Dit protocol levert hoogwaardige RNA voor microarray-toepassingen in moleculair biologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deel 1: Extractie van Totaal RNA met behulp van TRIzol Reagent Bij het werken met RNA is het zeer belangrijk om te werken in een omgeving die vrij is van RNAses. Eenvoudige voorzorgsmaatregelen zoals het hebben gereserveerd pipetten voor gebruik met RNA procedures en spuiten van het werkgebied met een ontsmettend middel reagens (bijv. RNAse Away) voordat het begin van de procedure zijn erg behulpzaam. <ol><li> Om een ​​voldoende hoeveelheid RNA zwembad 50 zebravis embryo&#39;s te bereiken in een 1,5 ml microfugebuisje en verwijder zo veel mogelijk water met een pipet. </li><li> Onmiddellijk voeg 250 ul van TRIzol reagens 1 tot en met de microfugebuis met de embryo&#39;s. TRIzol reagens bevat fenol en mag alleen worden gebruikt onder een zuurkast. </li><li> Lyseren en homogeniseren van de embryo&#39;s met een pellet stamper (ongeveer 20 slagen) totdat het weefsel voldoende is verstoord. </li><li> Wanneer de cellen voldoende gehomogeniseerd, voeg 750 ul TRIzol reagens tot een totaal volume van 1 ml gelijk. </li><li> Toe te staan ​​volledige dissociatie van de nucleoproteïne complexen, incubeer gehomogeniseerde monsters gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. In dit stadium kan het monster worden flash ingevroren in vloeibare stikstof en bewaard bij -80 ° C of het protocol kan worden voortgezet. </li><li> Om door te gaan voegen 0,2 ml chloroform en rock de buis gedurende 15 seconden om te mengen. </li><li> Incubeer het monster gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur en centrifugeer bij 12.000 xg gedurende 15 minuten bij 4 ° C. </li><li> Het mengsel wordt gescheiden in een lagere rode fenol-chloroform fase, een interfase, en een kleurloze bovenste waterige fase. De bovenste waterige fase bevat het RNA. De bovenste laag moet bestaan ​​uit ongeveer 60% van het oorspronkelijke volume van TRIzol (ongeveer 0,6 ml). Breng de bovenste waterlaag in een nieuwe microfugebuis met behulp van een 1 ml pipet dat evenwel niet tot een van de interfase laag over. </li><li> Het neerslaan van de RNA voeg 0,5 ml isopropanol. </li><li> Laat het monster bij kamertemperatuur zitten voor 10 minuten en dan is het monster centrifugeer bij 12.000 xg gedurende 10 minuten bij 4 ° C. RNA vormt een gel-achtige pellet op de bodem van de buis. </li><li> Zonder de pellet te verstoren, de bovenstaande vloeistof met een pipet en was het pellet in 1 ml 75% ethanol. Meng het monster door voorzichtig omkeren en centrifugeer bij 7500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. </li><li> Na het centrifugeren, wordt de ethanol met een pipet en laat monster drogen terwijl het omgekeerde voor 10 minuten. </li><li> Resuspendeer de pellet door het toevoegen van 100 pi van RNAse-vrij water en incubeer het monster bij 55 ° C gedurende 10 minuten. Het wordt aanbevolen om regelmatig de vinger vortex tijdens de incubatie om te helpen bij RNA rehydratatie. Optioneel kunt u controleren sample kwaliteit en hoeveelheid met behulp van een NanoDrop ND-1000 spectrofotometer of direct doorgaan met de volgende stap. </li></ol> Deel 2: RNA opruimen met behulp van de Qiagen RNeasy Mini Kit De Qiagen RNeasy Mini Kit 2 is nuttig in het verwijderen van vuil en onzuiverheden van een RNA monster geïsoleerd van andere methoden. Voor deze procedure zijn de β-mercaptoethanol, ethanol, en nuclease-vrij water die nodig zijn in aanvulling op de onderdelen in de kit. Een optionele DNAse behandeling wordt aanbevolen tijdens deze procedure. <ol><li> Bij het eerste gebruik van de kit, zal Buffer RPE moeten worden voorbereid door het toevoegen van vier volumes van 100% ethanol tot een volume van Buffer RPE. </li><li> Op de dag van de procedure, zal Buffer RLT moeten vers worden bereid. Bereken het totale bedrag van de Buffer RLT die nodig zullen zijn. Een volume van 350 ui is nodig per monster. Ter voorbereiding Buffer RLT, voeg 10 ul van β-mercapto-ethanol voor elke 1 ml buffer. Dit dient te gebeuren onder de zuurkast. </li><li> Aan elk monster toe te voegen 350 pi buffer RLT en 250 pl van 100% ethanol. Meng goed door en neer te pipetteren meerdere malen. </li><li> Breng het monster, die ongeveer 700 ul, worden in een RNeasy kolom die is in een 2 ml collectie buis en centrifugeer geplaatst bij 8.000 xg gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur. </li><li> Na centrifugeren, gooi de stroom door en voeg 700 ul van de Buffer RW1 om een ​​RNeasy draaien kolom. </li><li> Centrifugeer het monster bij 8000 xg gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur en gooi het doorstromen. </li><li> DNAse behandeling met Qiagen RNAse-Free DNAse Kit: DNAse behandeling is optioneel, maar wordt ten zeerste aanbevolen voor de hoogste kwaliteit monsters. <ol style="list-style-type:upper-alpha;"><li> Wanneer u voor het eerst de DNAse behandeling kit te ontvangen, moet u de DNAse I stockoplossing voor te bereiden door het toevoegen van 550 pi nuclease-vrij water aan de DNAse. Meng voorzichtig door het omkeren en niet vortex. Aliquot in injectieflacons voor eenmalig gebruik met 10 ul van de stockoplossing. U kunt de voorraad-oplossing bij -20 ° C gedurende maximaal 9 maanden. Het ontdooide porties kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende 6 weken, indien nodig, maar niet de fracties opnieuw invriezen na het ontdooien. </li><li> Ter voorbereiding op het DNAse I incubatie mix toe te voegen 70 ul buffer RDD tot 10 ul DNAse I stock oplossing per monster. Meng door zachtjes te omkering en centrifugebuis kort om de resterende vloeibare vorm het verzamelen van de zijkanten van de buis. Voeg 80 ul DNAse I incubatie mix direct naar de RNeasy draaien kolom. Incubeer de DNAse behandeling gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. </li></ol></li><li> Naar aanleiding van de behandeling toe te voegen DNAse 350 ul buffer RW1 met de spin kolom en centrifugeer bij 8000 xg gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur. </li><li> Na het centrifugeren gooi de stroom door en voeg 500 ul buffer RPE om de spin kolom. Incubeer monster gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Centrifugeer steekproef bij 8.000 xg gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur en gooi de doorstromen. </li><li> Na het centrifugeren voeg 500 ul 75% ethanol om de spin kolom. </li><li> Herhaal centrifugering bij 8.000 xg, maar gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Na het centrifugeren gooi de stroom door en laat de kolom om te drogen gedurende 5 minuten. </li><li> Onmiddellijk centrifuge bij 8.000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur aan een links te verwijderen meer dan sporen van ethanol. </li><li> Na het centrifugeren is volledige overdracht van de spin kolom in een nieuwe 1,5 ml collectie buis en voeg 10 ul nuclease-vrij water. Incubeer gedurende 1 minuut en centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur. Het RNA wordt in de stroom door. </li><li> Voeg nog een 10 ul van nuclease-vrij water aan de spin kolom en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut. Centrifugeer steekproef bij 10.000 xg gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur. </li><li> Na het centrifugeren verwijderd en gooi de spin kolom. RNA zal in het doorstromen. </li><li> Controleer de kwantiteit en kwaliteit van het RNA met behulp van een NanoDrop ND-1000 spectrofotometer volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Daarnaast loopt een denaturerende gel of gebruik een Agilent 2100 bioanalyzer om de integriteit van het RNA te controleren. </li><li> De monsters moeten worden bewaard bij -80 ° C tot cDNA synthese kan worden uitgevoerd. </li></ol> Deel 3: cDNA synthese met behulp van de Invitrogen SuperScript First-Strand-systeem RNA is gemakkelijk vatbaar voor splitsing door RNAses leidt tot de degradatie. Als gevolg hiervan veel genexpressie protocollen zijn ontwikkeld om een ​​meer stabiele cDNA product dat rechtstreeks is gesynthetiseerd uit het RNA te gebruiken. Hier hebben we detail synthese van de eerste streng cDNA met behulp van de Invitrogen SuperScript eerste streng synthese systeem 3. Elke cDNA-synthese reactie kan maximaal 5 ug RNA. <ol><li> Voor aanvang van de procedure mix en een korte centrifuge elke component. </li><li> Bereid RNA / primer mengsel in een steriele 0,5 ml microfugebuisje zoals aangegeven in tabel 1. </li><li> Incubeer het monster bij 65 ° C gedurende 5 minuten. </li><li> Onmiddellijk overdracht monster ijsslurrie gedurende 10 minuten. </li><li> Terwijl het monster is koeling voor te bereiden een master mix met de componenten die in tabel 2. De volumes staan ​​per 1 reactie. Dienovereenkomstig aan te passen volumes voor het totale aantal van de reacties. </li><li> Voeg na afkoelen 9 ul van de master mix bereid in stap 5 voor elke RNA / primer mengsel. Meng voorzichtig en verzamel door korte centrifugeren. Het totale volume van elk monster moet 19 ul worden. </li><li> Incubeer monster op 42 ° C gedurende 2 minuten in een thermocycler. </li><li> Voeg 1 ui (50 stuks) van Superscript II RT aan elke buis, mengen, en incuberen bij 42 ° C gedurende 60 minuten in een thermocycler. </li><li> Beëindig de reactie bij 70 ° C gedurende 15 minuten en dan chill monster tot 4 ° C. Een thermocycler kan geprogrammeerd worden voor de stappen 8 en 9. </li><li> Nadat het monster heeft bereikt 4 ° C en breng de reactie op een ijsbad. </li><li> Op het ijs toe te voegen 1 pl RNAse H aan elke buis en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 ° C. Het totale volume is nu 21 pl. Toevoeging van RNAse H om uw monster zal degraderen de RNA-sjabloon en laat alleen de enkele streng cDNA product. </li></ol> Deel 4: cDNA Isolatie en Neerslag <ol><li> Een 1,5 ml fase lock-gel tube zal worden gebruikt in de isolatie van het cDNA product. Bereid een 1,5 ml fase lock-gel buis door middel van centrifugatie bij 12.000 xg gedurende 2 minuten. De gel moeten allemaal op de bodem van de buis. </li><li> Voeg 81,5 ul fenol (Tris-verzadigd, gebufferd tot pH 8,0), 81,5 ul van 24:1 chloroform isoamylalcohol, en het monster (21 ul) in de fase slot gel buis. Meng een paar keer door voorzichtig omkeren. </li><li> Centrifugeer het monster bij 12.000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> De cDNA moet in de bovenste waterige fase. Breng de bovenste fase over in een schone 1,5 ml microfugebuis. Het totale volume moet rond de 20 pl. </li><li> Voeg 1X volume van 3 M NaOAc, pH 5,2 en meng voorzichtig. Bijvoorbeeld, als het volume van de bovenste waterige fase was gelijk aan 20 ul, moet u twee ui van 3 M NaOAc, pH 5,2 toe te voegen. </li><li> Voeg 7 pl van 5 mg / ml glycogeen en meng voorzichtig. </li><li> Voeg 1X volume isopropanol toe en meng voorzichtig. Meestal is dit ongeveer 30 ul van isopropanol. </li><li> Laat monster incuberen bij kamertemperatuur Temperatuure gedurende 10 minuten en centrifugeer bij 12.000 xg gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Een kleine cDNA pellet moeten vormen op de bodem van de buis. Verwijder voorzichtig het supernatant met een pipet. </li><li> Voeg 500 ul van 70% ethanol en meng door inversie. </li><li> Centrifugeer het monster bij 12.000 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Na het centrifugeren de bovenstaande vloeistof met een pipet en herhaal de 70% ethanol wassen en centrifugeren (stap 10 en 11). </li><li> Na het centrifugeren de bovenstaande vloeistof met een pipet. Als er vloeistof die op de zijkanten van de buis, kan deze worden verzameld door kort draaien van de buis. Verwijder eventuele overtollige vloeistof en laat de pellet op kamertemperatuur drogen gedurende 5 minuten. </li><li> Voeg 20 ul van nuclease-vrij water op de korrel te hydrateren. Plaats het monster bij 55 ° C gedurende 5 minuten voor rehydratatie van de pellet. </li><li> De kwantiteit en kwaliteit van de cDNA product wordt vervolgens gecontroleerd met behulp van een NanoDrop ND-1000 spectrofotometer volgens de instructies van de fabrikant. De cDNA kan worden opgeslagen bij -20 ° C. </li></ol> Representatieve resultaten Na de RNA opruimen, kan ongeveer 15 microgram van hoge kwaliteit totaal RNA worden verwacht van 50 zebravis embryo&#39;s. Voor de beoordeling van totaal RNA kwaliteit, een spectrofotometer, gel elektroforese, en een Agilent 2100 Bioanalyzer kan worden gebruikt. Een NanoDrop ND-1000 spectrofotometer kan worden gebruikt om de absorptie te beoordelen bij 260 nm in vergelijking met de absorptie bij 280 nm (figuur 1). De A 260 / A-280-verhouding kan onthullen de aanwezigheid van verontreinigingen en geven het bewijs van mogelijke afbraak. Een A 260 / A-ratio van 280 1.9-2.0 wordt aanvaardbaar geacht. Bovendien is het sterk aanbevolen dat een RNA-denaturatie gel worden uitgevoerd om RNA integriteit te beoordelen. RNA-strengen zal scheiden op basis van hun grootte, met kleinere strengen migreren verderop in de gel. Een niet-aangetaste monster zal verschijnen als een uitstrijkje met twee sterke bands. Het uitstrijkje is een gevolg van een populatie van verschillende grootte mRNA strengen en de banden komen overeen met 28S en 18S rRNA. De 28S band moet ongeveer twee keer zo intens als de 18S band (figuur 2). Als alternatief kan totaal RNA integriteit worden beoordeeld met behulp van een Agilent 2100 bioanalyzer. Twee verschillende pieken van de 28S en 18S rRNA wordt verwacht (figuur 3). De 28S piek moet groter zijn dan de 18S piek met het gebied onder de pieken ongeveer 2:1, respectievelijk. Twee verschillende pieken worden niet waargenomen in afgebroken monsters. RNA monsters vertonen degradatie mag niet worden uitgeoefend door middel van de volgende experimentele procedures. Spectrofotometrische analyse kan worden gebruikt om de kwaliteit van het cDNA product (figuur 4) te beoordelen. De A 260 / A-280 moet rond de 1,8. cDNA reacties met een inzet van 5 pg totaal RNA routinematig opbrengst 1-2 ug van cDNA product in ons laboratorium. <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. Een NanoDrop spectrum van RNA monster. Na RNA opruimen, kan RNA hoeveelheid en de kwaliteit worden beoordeeld met behulp van een NanoDrop ND-1000 spectrofotometer. Ongeveer 15 ug van hoge kwaliteit totaal RNA wordt routinematig verkregen van 50 zebravis embryo&#39;s met een A 260 / A-280-ratio rond 1,9-2,0. <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig2.jpg" alt="Figuur 2" /> Figuur 2. Een RNA-denaturatie gel. Om de integriteit van het totale RNA isolatie, kan een RNA-denaturatie gel worden liep. Een uitstrijkje met twee heldere bands die overeenkomen met 28S en 18S rRNA wordt verwacht. De 28S band moet ongeveer twee keer zo intens als de 18S band. <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig3.jpg" alt="Figuur 3" /> Figuur 3. Een spoor van een RNA-monster van een bioanalyzer. Om de integriteit van het totale RNA-isolatie te beoordelen, kan ook monsters worden geanalyseerd op een Agilent 2100 bioanalyzer. Twee scherpe pieken, die overeenkomen met de 28S en 18S rRNA, zichtbaar moet zijn. De 28S piek moet groter zijn dan de 18S piek met het gebied onder de pieken ongeveer 2:1, respectievelijk. <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig4.jpg" alt="Figuur 4" /> Figuur 4. Een NanoDrop spectrum van een cDNA monster. Spectrofotometrisch onderzoek met een NanoDrop ND-1000 kan worden gebruikt om de hoeveelheid en de kwaliteit van het cDNA product te beoordelen. De A 260 / A-280-verhouding moet rond de 1,8. cDNA reacties met een inzet van 5 ug totaal RNA routinematig opbrengst 1-2 ug van cDNA in ons laboratorium. Tabel 1. Componenten om voor RNA / primer mengsels toe te voegen bij stap 2 van de cDNA synthese. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Bestanddeel </td><td> Volume </td></tr><tr><td> Totaal RNA (tot 5 ug) </td><td> 10 pi </td></tr><tr><td> 10 mM dNTP mix </td><td> 1 pi </td></tr><tr><td> Oligo (dT) 12-18 (0,5 pg / pl) </td><td> 1 pi </td></tr><tr><td> DEPC-behandeld water </td><td> n ul </td></tr><tr><td> Totale volume </td><td> 10 pi </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Reactiemengsel voor stap 5 van de cDNA synthese. Vermeld volumes zijn per reactie. Verhoging van volumes van elk bestanddeel voor het totale aantal reacties. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Bestanddeel </td><td> Volume </td></tr><tr><td> 10X RT Buffer </td><td> 2 pi </td></tr><tr><td> 25 mM MgCl2 </td><td> 4 pl </td></tr><tr><td> 0,1 mM DTT </td><td> 2 pi </td></tr><tr><td> RNAseOUT </td><td> 1 pi </td></tr></tbody></table>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22TRIzol+Reagent+Manual%22">TRIzol Reagent Manual</a>. , (2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22RNEasy+Mini+Handbook%22">RNEasy Mini Handbook</a>. , 4th ed, (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22SuperScript+First-Strand+Synthesis+System+for+RT-PCR%22">SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR</a>. , Version E. (2003).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te melden.

De kwetsbaarheid van het RNA-molecuul is de meest kritische overweging dat mag niet worden vergeten in dit protocol. Steriel apparatuur die is RNAse-vrij moet altijd worden gebruikt in een RNAse-vrije zone van het laboratorium. Het is nuttig te reserveren een deel van het laboratorium te worden gebruikt voor RNA-procedures alleen. Dit gebied moet regelmatig worden besproeid met een RNAse het verwijderen van product, zoals RNAse Away. De RNA monsters moet altijd worden behandeld met handschoenen en op ijs bewaard tot afb...

<table><tbody><tr><td>Glycogeen (5 mg/ml)</td><td>Ambion</td><td>9510</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop ND-100</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Pelletpestels met microcentrifugebuis</td><td>VWR international</td><td>KT749520-0090</td><td></td></tr><tr><td>Phase Lock Gel Light, 1.5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>2302800</td><td></td></tr><tr><td>Fenol, Tris-verzadigd</td><td>Roche Group</td><td>3117944001</td><td></td></tr><tr><td>RNAse Away</td><td>VWR international</td><td>17810-491</td><td></td></tr><tr><td>RNAse-vrije DNase-set</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>RNEasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript&amp;#174; First-Strand Synthesis System voor RT-PCR</td><td>Invitrogen</td><td>11904-018</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td></td></tr></tbody></table>

rna isolatie van embryonale zebravis en cdna synthese voor de analyse van genexpressie

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Veel belangrijke en complexe laboratorium procedures vereisen een inzet van hoge kwaliteit, intact RNA. Een gedegradeerde monster of de aanwezigheid van onzuiverheden kan leiden tot rampzalige resultaten in downstream experimentele toepassingen. Het is daarom van het grootste belang om solide technieken te gebruiken met tal van waarborgen en kwaliteitscontroles voor een superieure steekproef te waarborgen. Hierin hebben we detail een protocol om totaal RNA te isoleren uit embryo&#39;s met behulp van hele zebravis een commercieel verkrijgbare chemische denatureringsmiddel en de daaropvolgende opruimen om sporen van DNA en onzuiverheden met behulp van een commercieel RNA isolatie kit te verwijderen. Als RNA is relatief onstabiel en gemakkelijk vatbaar zijn voor splitsing door RNAses, de meeste protocollen test expressie van genen met behulp van een cDNA-product dat rechtstreeks wordt gesynthetiseerd uit een RNA template. We detail een procedure om RNA om te zetten in de meer stabiele cDNA product met behulp van een commercieel verkrijgbare kit. Gedurende deze procedures zijn er tal van kwaliteitscontroles om ervoor te zorgen dat het monster niet wordt afgebroken of verontreinigd is. Het eindproduct van deze protocollen is cDNA die geschikt is voor microarray analyse, RT-PCR of lange-termijn opslag.

De isolatie van hoge kwaliteit, intact RNA is een essentiële stap in veel laboratoria protocollen. Hier laten we zien RNA-extractie uit hele zebravis embryo&#39;s en cDNA synthese voor verdere toepassing in de verschillende experimentele procedures, zoals het gen expressie microarray analyse.

RNA isolatie van embryonale zebravis en cDNA synthese voor de analyse van genexpressie

Veel belangrijke en complexe laboratoriumprocedures vereisen de input van intact RNA van hoge kwaliteit. Een gedegradeerd monster of de aanwezigheid van onzuiverheden kan leiden ...

Om te beginnen met de RNA-isolatie en om voldoende opbrengsten te verkrijgen, worden 50 zebravis-embryo's overgebracht naar een vijzel met een micro-fuseerbuisje. Het RNA wordt eerst geëxtraheerd met TRIzol-reagens en chloroform, nadat de monsters grondig zijn gehomogeniseerd. Vervolgens wordt het RNA gereinigd en gezuiverd met de Qiagen RNeasy Mini Kit om hoogwaardig, niet-gedegradeerd totaal RNA te verkrijgen voor toekomstige toepassingen en langdurige bewaring.Het RNA wordt gesynthetiseerd tot het stabielere cDNA-product. Het cDNA wordt gezuiverd om de oorspronkelijke RNA-matrijsstreng te verwijderen. Hallo, mijn naam is Sam Peterson van het laboratorium van Dr. Jennifer Freeman van de afdeling Health Sciences aan de Purdue University.Vandaag laten we u zien hoe u hoogwaardig RNA extraheert uit volledige zebravisembryo's en dit omzet in het cDNA-product. Doorgaans gebruiken we deze procedure om genexpressieprofielen te bestuderen. Laten we beginnen.Bij het werken met RNA is het zeer belangrijk om in een omgeving te werken die vrij is van RNases. Neem eenvoudige voorzorgsmaatregelen, zoals het reserveren van pipetpunten die uitsluitend voor RNA-procedures worden gebruikt en het bespuiten van het werkveld met RNase-away voordat u begint met de extractie van totaal RNA. Om te beginnen met de extractie, brengt u 50 zebravisembryo's in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis in de zuurkast. Verwijder zoveel mogelijk water en voeg onmiddellijk 250 microliters trizol-reagens toe, dat fenol bevat.Gebruik een pelletstamper om de embryo's ongeveer 20 keer te vermalen en te homogeniseren totdat het weefsel voldoende is afgebroken. Voeg vervolgens 750 µL triazolreagens toe en incubeer vijf minuten bij kamertemperatuur om een volledige dissociatie van nucleaire proteïnecomplexen mogelijk te maken. Wanneer de vijf minuten voorbij zijn, voegt u 0,2 ml chloroform toe, mengt u dit door de buis 15 seconden te schudden en incubeert u het monster twee minuten bij kamertemperatuur; centrifugeer vervolgens 15 minuten bij 12.000 G en 4 °C.Het mengsel zal scheiden in een onderste rode fenol-chloroformfase, een interfase en een kleurloze bovenste waterige fase. De bovenste laag is ongeveer 0,6 millimeter en bevat het RNA; overdracht de gehele bovenste waterige laag, ongeveer 0,6 millimeter, naar een nieuwe micro-FUZE buis. Wees voorzichtig om geen deel van de interfase over te dragen; voeg vervolgens 0,5 milliliter isopropanol toe om het RNA neer te slaan.Laat dit 10 minuten op kamertemperatuur staan en centrifugeer het monster vervolgens 10 minuten bij 12.000 G bij vier graden Celsius. Het RNA zou een gel-achtige pellet moeten vormen. Verwijder het supernatant zonder de pellet te verstoren en was deze door één milliliter 75% ethanol toe te voegen, meng door voorzichtig om te keren en centrifugeer 5 minuten bij 7.500 G bij vier graden Celsius.Verwijder na centrifugatie de ethanol en keer de buis om om deze 10 minuten te laten drogen. Resuspendeer het pellet door 100 µL RNAse-vrij water toe te voegen en 10 minuten te incuberen bij 55 °C. Vortex regelmatig kort met de vinger om de rehydratatie van het RNA te bevorderen.Nu het RNA uit de embryo's is geëxtraheerd, volgt de RNA-zuivering en de behandeling van D a. Gebruik voor de zuivering van het RNA een Rogen RN easy mini kit. Voeg bij het eerste gebruik, werkend in de zuurkast, vier volumes 100% ethanol toe aan één volume buffer RPE.Voeg 10 µL beta-mercaptoethanol toe voor elke 1 mL buffer RLT. Voeg vervolgens 350 µL buffer RLT en 250 µL 100% ethanol toe aan het monster, meng dit door meerdere keren te pipetteren en breng het volledige monster over naar een RNeasy-kolom die is geplaatst in een opvangbuisje van 2 mL. Centrifugeer 1 minuut bij 8.000 ×g bij kamertemperatuur. Gooi na het centrifugeren het doorstromingsvolume weg en voeg 700 µL buffer RW1 toe aan de spin kolom.Centrifugeer opnieuw bij 8.000 G gedurende één minuut en verwijder het doorstroomvolume om DA uit het monster te verwijderen. Behandel het DNA vervolgens met de RNAs free DNA's kit. Voeg, na ontvangst van de kit, 550 µL nuclease-vrij water toe aan de DNA's en meng dit voorzichtig door te inverteren om de stockoplossing te bewaren, verdeeld in aliquots van 10 µL, en vries deze in bij -20 °C.Voeg 70 µL buffer RDD toe aan 10 µL van de DNA-voorraadoplossing; meng door voorzichtig om te keren, centrifugeer kort en voeg dit direct toe aan de R and easy spin column A. Incubeer de DNA-behandeling 30 minuten bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 350 µL buffer RW1 toe aan de spincolumn, centrifugeer 1 minuut bij 8.000 G bij kamertemperatuur, verwijder het doorstroomvolume en voeg 500 µL buffer RPE toe aan de spincolumn. Incubeer het monster vijf minuten bij kamertemperatuur.Centrifugeer opnieuw bij 8,000 G gedurende één minuut bij kamertemperatuur, gooi het filtraat weg en voeg 500 µL 75% ethanol toe aan de spincolumn. Herhaal de centrifugatie bij 8,000 G, maar nu gedurende twee minuten bij kamertemperatuur; gooi na de centrifugatie het filtraat weg en laat de column onmiddellijk vijf minuten drogen. Centrifugeer bij 8,000 G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur om eventuele resterende sporen van ethanol te verwijderen.Sluis de spin kolom nu over naar een nieuwe collectiebuis van 1,5 milliliter en voeg 10 µL nucleasevrij water toe. Incubeer één minuut om het RNA te elueren en centrifugeer vervolgens gedurende één minuut bij 10.000 G bij kamertemperatuur; het RNA bevindt zich in het flow-through. Herhaal de elutie met nog eens 10 µL water.Controleer de hoeveelheid en kwaliteit van het RNA met een NanoDrop ND 1000 spectrofotometer volgens de instructies van de fabrikant. Voer daarnaast een denaturerende gel uit of gebruik een Agilent 2100 bioanalyzer om de integriteit van het RNA te controleren. Als de kwaliteit en hoeveelheid van het RNA bevredigend zijn, ga dan over naar de cDNA-synthese.Bewaar het RNA tot slot bij -80 °C tot de cDNA-synthese kan worden uitgevoerd. Begin de cDNA-synthese door elk component van de RNA-primer te mengen en kortstondig te centrifugeren. Meng de RNA DN NTP's en oligo dT.Voeg elke component toe aan een steriele naut 0,5 milliliter microfused buis tot een totaalvolume van 10 µL. Raadpleeg het bijbehorende schriftelijke protocol voor de specifieke volumes. Incubeer het monster vervolgens gedurende vijf minuten bij 65 °C.Breng het monster onmiddellijk 10 minuten over naar een ijsbad; terwijl het monster afkoelt, bereidt u een buffermastermix met een totaalvolume van 9 µL voor, zoals beschreven in het bijbehorende geschreven protocol. Combineer na het koelen de buffermastermix met het RNA-primer-mengsel, meng dit voorzichtig en verzamel het door middel van een korte centrifugatie. Plaats het gecombineerde monster vervolgens in de thermocycler om 2 minuten te incuberen bij 42 °C.Voeg om de omgekeerde transcriptie te starten één µL superscript two RT toe aan de buis en meng dit. Zet de incubatie voort bij 42 °C gedurende een uur. Beëindig de reactie bij 70 °C gedurende 15 minuten.Koel het monster vervolgens af tot 4 °C en breng het over naar een ijsbad op ijs. Voeg 1 µL RNase H toe aan het monster en incubeer dit gedurende 20 minuten bij 37 °C; RNase H degradeert de RNA-template, waardoor alleen het enkelstrengs cDNA-product overblijft. De cDNA-synthese is nu voltooid en vereist enkel nog een aanvullende zuiverings- en concentratiestap. Om het cDNA-product te isoleren, bereidt u een 1,5 ml Phase Lock Gel-buis door centrifugatie bij 12.000 ×g gedurende twee minuten.Alle gels moeten zich onderin de buis bevinden. Voeg 81,5 µL tris-verzadigd fenol gebufferd tot pH 8,0, 81,5 µL chloroform-isoamylalcohol (24:1) en het monster toe aan de phase lock gelbuis. Meng dit enkele keren door voorzichtig om te keren en centrifugeer het monster bij 12.000 ×g gedurende vijf minuten. Bij kamertemperatuur moet het cDNA zich in de bovenste waterige fase bevinden.Breyng de bovenste fase, die ongeveer 20 µL moet zijn, over naar een schone 1,5 mL microcentrifugebuis. Voeg om het cDNA te precipiteren twee µL van 3 M natriumacetaat bij pH 5,2 toe en meng voorzichtig. Voeg zeven µL van 5 mg/mL glycogeen toe en meng voorzichtig.Voeg vervolgens 30 µL isopropanol toe, meng voorzichtig en laat het monster 10 minuten incuberen bij kamertemperatuur. Centrifugeer daarna gedurende 20 minuten bij 12 000 G bij kamertemperatuur. Na centrifugatie verschijnt er een klein cDNA-pellet op de bodem van de buis.Verwijder voorzichtig het supernatant met een pipet. Was het pellet door 500 µL 70% ethanol toe te voegen en meng door inversie. Centrifugeer het monster bij 12.000 G gedurende vijf minuten. Verwijder na centrifugatie het supernatant met een pipet.Herhaal de wasstap, voeg ethanol toe, centrifugeer en verwijder het supernatant. Na de tweede wasbeurt kortstondig centrifugeren om alle resterende vloeistof te verzamelen. Verwijder eventuele overtollige vloeistof en laat het pellet vijf minuten drogen bij kamertemperatuur.Voeg vervolgens 20 µL nucleasevrij water toe om het pellet te rehydrateren. Plaats de sample vijf minuten lang bij 55 °C. Na rehydratatie kan het CD NA worden bewaard bij -20 °C.Controleer slutend de kwantiteit en kwaliteit van het cDNA-product met een NanoDrop ND 1000-spectrofotometer volgens de instructies van de fabrikant. Extractie en zuivering van RNA uit 50 zebravisembryo's levert routinematig ongeveer 15 microgram hoogwaardig totaal RNA op, beoordeeld met een NanoDrop ND 1000-spectrofotometer, waarbij de absorptieratio bij 260 nm ten opzichte van 280 nm rond de 1,9 tot 2,0 ligt. De integriteit van het geëxtraheerde RNA wordt geëvalueerd met een denaturerende RNA-gel. Het RNA verschijnt als een smear met twee heldere banden die overeenkomen met 18 S en 28 S ribosomaal RNA.De 28 s-band moet ongeveer twee keer zo intens zijn als de 18 s-band. Als alternatief wordt de RNA-integriteit geëvalueerd met een Agilent 2100 bioanalyzer. Er zijn twee scherpe pieken zichtbaar die overeenkomen met het 18 s- en 28 s-ribosomaal RNA.De 28 s piek moet groter zijn dan de 18 s piek. Reverse transcriptie van vijf microgram totaal RNA levert routinematig één tot twee microgram cDNA op, zoals vastgesteld met een NanoDrop ND 1000. De absorptieratio van 260 naar 280 voor het cDNA ligt rond de 1,8.We hebben zojuist laten zien hoe u totaal RNA kunt isoleren uit volledige zebravisembryo's en dit RNA kunt omzetten in het cDNA-product. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om eraan te denken een omgeving te behouden die vrij is van RNases. Dat is alles.Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

rna-isolation-from-embryonic-zebrafish-cdna-synthesis-for-gene

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Gen microarrays zijn krachtige tools in gen expressie profilering bij een genoom-brede niveau. Deze technologie heeft toepassing in een verscheidenheid van biologische disciplines, waaronder ontwikkelingsbiologie en toxicologie. In deze video, we detail een protocol voor de wereldwijde genexpressie analyse met behulp van een uitgebreid oligonucleotide microarray platform voor de zebravis.

Global analyse van genexpressie met behulp van een zebravis oligonucleotide microarray platform

Hier presenteren we een systematische aanpak voor het ontwikkelen van fysiologisch relevante, gevoelige en...

In vivo modellering van de Morbid Human Genome behulp Danio rerio

De zebravis, een kleine tropische vissen, is uitgegroeid tot een populair model voor het bestuderen van gen-functie tijdens gewervelde ontwikkeling en ziekte. De ruimtelijke en temporele expressie van de doelwitgenen worden...

Hoge resolutie Hele Mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie in zebravis embryo&#39;s om genexpressie en functie te bestuderen

Cardiale genexpressie profielen te analyseren tijdens zebravis ontwikkeling van het hart, heeft totaal RNA worden geëxtraheerd uit geïsoleerde harten. Hier presenteren we een protocol voor het verzamelen van functionele / kloppende harten door snelle handmatige dissectie van de zebravis embryo's tot cardiale-specifieke mRNA te verkrijgen.

Grootschalige de zebravis embryonale Hart Dissection voor Transcriptionele Analyse

Dit protocol beschrijft een methode voor het isoleren van enkele cellen uit zebravis-embryo's, het verrijken van cellen van belang, het vastleggen van zebraviscellen in microfluïdische gebaseerde enkelcellige multiplexsystemen en het beoordelen van genexpressie uit enkele cellen.

Isolatie en karakterisering van enkele cellen van zebravis embryo&#39;s

Mitose is cruciaal voor elk levend organisme en defecten leiden vaak tot kanker en ontwikkelingsstoornissen. Met behulp van dit beeldvormingsprotocol en zebravissen als modelsysteem, kunnen onderzoekers mitose visualiseren in een levend gewerveld organisme en de veelvoud aan defecten die ontstaan wanneer mitotische processen defect zijn.

Observeren mitotische deling en Dynamiek in een live zebravis embryo

Dit protocol biedt een aanpak voor de hele transcriptome analyse van zebravis embryo's, larven, of cellen gesorteerd. Wij omvatten isolatie van RNA, pad analyse van RNASeq gegevens en qRT-PCR-gebaseerde validatie van gen expressie veranderingen.

Bereiding van de monsters en de analyse van de RNASeq gebaseerde gen expressie gegevens uit de zebravis

We presenteren een protocol om te isoleren van neuronen, macrofagen en microglia van larvale zebrafish hersenen onder fysiologische en pathologische omstandigheden. Op isolatie, wordt RNA gewonnen uit deze cellen te analyseren hun genexpressie profiel. Dit protocol voorziet voor de verzameling van kwalitatief hoogwaardige RNA downstream analyse zoals qPCR en transcriptomics uitvoeren.

Isolatie en RNA extractie van neuronen, macrofagen en Microglia van larvale Zebrafish hersenen

Hier presenteren we een protocol voor fluorescerende antilichaamgemedieerde detectie van eiwitten in hele preparaten van zebravissen embryo's en larven.

Hele mount immunohistochemie in zebravissen embryo's en larven

Dit protocol beschrijft hoe beelden kunnen worden verkregen door in situ hybridisatie en immunohistochemie van embryonale secties van zebravissen te combineren. In situ hybridisatie werd uitgevoerd voorafgaand aan cryosectie, gevolgd door antilichaamkleuring. Het is nuttig om de expressiepatronen van twee genen in zebravissen te detecteren als er een tekort aan antilichamen is.

Ter plaatse Hybridisatie gecombineerd met immunohistochemie in cryosectie zebravisembryo's

Hier presenteren we een protocol om eiwitten te labelen met een fluorescentie-eiwitlabel in zebravislarven, een nieuw ontwikkeld en aangepast in vivo systeem dat vooral nuttig is voor het visualiseren van eiwitten met een lage abundantie in zebravissen.

Fluorescentielabeling om eiwitten met een lage expressie in zebravissen te visualiseren

Leer RNA-isolatie van embryonale zebravis en cDNA-synthese voor genexpressieanalyse. Dit protocol levert hoogwaardige RNA voor microarray-toepassingen in moleculair biologisch onderzoek.

RNA isolatie van embryonale zebravis en cDNA synthese voor de analyse van genexpressie

Meer video's verkennen