Mesoscopische Fluorescentie Tomografie voor In-vivo Imaging van de ontwikkelingslanden Drosophila

Om de reconstructies van zich ontwikkelende organen binnen de Drosophila melanogaster uit te voeren, moeten we het voorwaartse model bepalen dat de verspreiding van licht binnen de pop het beste beschrijft. De procedure begint met het selecteren van een witte pre-pop en het lijmen op het uiteinde van een capillaire buis zodat de voor-achter-as van de pop parallel aan de buis is georiënteerd. Een kleine capillaire buis wordt gevuld met wat fluorescerende kleurstof en in de pupilcase gestoken.

Na zorgvuldig afstellen van de as, wordt de pop 360 graden geroteerd. Er worden afbeeldingen gemaakt onder verschillende hoeken. De verkregen fluorescente transverlichtingsgegevens worden gebruikt om het voorwaartse model te bepalen dat zal worden gebruikt om de ontwikkeling van organen af te beelden.

Hallo, mijn naam is Claudia en ik ben bij het Center for Assistance Biology aan Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School. Ik ben Ula Petou van het Paramount Lab aan Harvard Medical School, En ik ben Daniel Rozanski van het Institute for Biological and Medical Imaging aan de Technische Universiteit van München en Heliman Center Munich. Vandaag laten we u een procedure zien voor driedimensionale reconstructie van een hele lichaam in Oph Melano Casta.

We gebruiken deze procedure in ons lab voor in vivo visualisatie van zich ontwikkelende organen tijdens de popstatus. Dus laten we beginnen. Voordat we beginnen. Let op dat er geen bijbehorende video is die voorafgaand aan deze moet worden bekeken, waar enkele technische aspecten van optische projectietomografie in meer detail worden uitgelegd dan hier.

Daarnaast legt de andere video de beeldvorming van voorbereide weefsels of organen van grotere dieren uit. Voor alle experimenten in deze video worden drosophila transgenen gebruikt. Ze zijn EL A gal vier die in de speekselklieren tot expressie worden gebracht, apteris gal vier, die tot expressie wordt gebracht in de larvale voorloperweefsels van de volwassen vleugel en borststuk, het transgen dat fluorescerend eiwit maakt.

In reactie op gal vier genaamd U-A-S-G-F-P en wit 1118, worden niet-fluorescerende controle mannetjes die de UAS-transgenen dragen, gekruist met maagden die de GAL vier transgenen dragen om weefsel te verkrijgen. Specifieke expressie van GFP-kruisingen wordt ingesteld van acht tot tien maagden en mannetjes op standaard vliegmedium met een snuifje bakkersgist. Aan de oppervlakte worden de flesjes gehuisvest bij 25 graden Celsius in een bevochtigde incubator onder een cyclus van 12 uur licht en duisternis.

Twee dagen na het begin van de kruising worden de ouders overgebracht naar een nieuw flesje en vijf tot zes dagen later zal PUI het flesje beginnen te bevolken met witte PrepU. I wordt geselecteerd op GFP-expressie onder een fluorescente disserterende scope. Selectie van witte pre pui zorgt voor goed stadia van de dieren omdat ze ongeveer een uur wit blijven.

Na de pupilatie worden ze gepigmenteerd of bruin. GFP-uitdrukkende pui worden voorzichtig uit de flesjes verzameld met behulp van een natte verfkwast en in een druppel water of PBS in een petrischaal geplaatst, maar moeten worden schoongeveegd van autofluorescente materialen. Met behulp van de verfkwast moeten ze nu klaar zijn voor tomografische beeldvorming.

Als de PrepU I nog verder moeten verouderen om het juiste ontwikkelingsstadium te bereiken, kunnen ze in een petrischaal met een natte papieren handdoek of in een schone voedselfles worden achtergelaten. Dit zorgt voor voldoende vochtigheid en goede ontwikkeling voor beeldvorming. De PrepU moet worden bevestigd aan de binnenkant van een glazen capillaire buis met een diameter van 800 micron.

Verf het achterste uiteinde van de pupil met superlijm, richt de gelijmde oppervlakte van de pre-pop in de buis zodat de voor-achter-toegang van de vlieg parallel is met de buis. Het voorste deel van het dier zal over de capillaire buis hangen. De capillaire buis wordt nu bevestigd op de draaifase van de microscoop.

In een verticale positie, pas de kantelas van de draaitafel aan zodat de rotatieas van de buis parallel is aan de pixelkolommen van de beeldvormings-CCD. Met de positie van de vlieg aangepast, gaat u verder met beeldvorming. In dit voorbeeld moeten dieren met fluorescerende speekselklieren worden afgebeeld om oph te genereren die GFP tot expressie brengen in hun speekselklieren kan worden verkregen uit een kruising tussen EAG vier en U-A-S-G-F-P-stammen.

We beginnen met een gemonteerde pre-pop, verlichten de pre-pop met een excitatiebundel en verzamelen het GFP-fluorescente signaal. Bij transverlichting draaien we de PrepU 360 graden langs zijn verticale as en verwerven we de transverlichtingsbeelden. Elke afbeelding komt overeen met 10 graden rotatie.

De totale verwervingstijd hangt af van de hoeveelheid fluorescentie en de intensiteit van de excitatiebundel. Typische tijden zijn in de orde van één minuut. In dit voorbeeld wordt een DSO-pop die GFP tot expressie brengt in de vleugelimaginale schijven, afgebeeld.

Deze pop kan worden verzameld uit een fles met een kruising tussen Aus GAL vier en U-A-S-G-F-P-stammen. De pre-pop wordt gemonteerd zoals eerder beschreven. Echter, aangezien de beeldvormingstijd voor dit experiment ongeveer acht uur is, is het van cruciaal belang dat de omgeving vochtig en op kamertemperatuur blijft. Om uitdroging en de dood van het dier te voorkomen, wordt er een sluiter over de excitatiebundel geplaatst om het blussen van flora viers in het weefsel van belang te voorkomen, evenals om ervoor te zorgen dat het dier niet wordt verbrand door de laserstraal zoals eerder, verlicht met de excitatiebundel en verzamel het GFP-fluorescente signaal door transverlichting.

De pre-pop wordt volledig geroteerd langs zijn verticale as. Tijdens de gegevensverzameling duurt de rotatie slechts één minuut en wordt deze herhaald op verschillende tijdsintervallen. Om een tijdsverloopserie van afbeeldingen van de vleugels tijdens de ontwikkeling te creëren, kunnen gegevens worden verzameld gedurende minimaal zes uur met een snelheid van 100 afbeeldingen per uur.

Het is van vitaal belang dat de totale lichtblootstelling wordt gecontroleerd met deze sluiter om schade of fotobleking te