Digitale Microfluidics voor Geautomatiseerde Proteoom verwerking
November 6th, 2009
Digitale Microfluidics is een techniek die gekenmerkt wordt door de manipulatie van discrete druppels (~ nL - ml) op een reeks van elektroden door de toepassing van elektrische velden. Het is goed geschikt voor het uitvoeren van een snelle, sequentiële, geminiaturiseerde geautomatiseerde biochemische assays. Hier melden wij een platform in staat is het automatiseren van een aantal proteoomanalyse processtappen.
Klinische proteomics is een belangrijke nieuwe discipline die belooft de ontdekking van biomarkers die nuttig zullen zijn voor vroege diagnose en prognose van ziekten. Hier rapporteren we een nieuwe digitale microfluïdische of DMF-methode die verschillende verwerkingsstappen integreert die worden gebruikt in klinische proteomics, waaronder eiwitextractie, resolubilisatiereductie, alkylering en enzymatische vertering. DMF gebruikt discrete micro druppels van steekproef eiwitten op een reeks elektroden en kan bij kamertemperatuur worden uitgevoerd, waardoor parallelle geautomatiseerde analyse van monsters mogelijk is.
Deze methodologie vertegenwoordigt een aanzienlijke vooruitgang ten opzichte van conventionele methoden en heeft het potentieel om een nuttig nieuw hulpmiddel in klinische proteomics te zijn. Hallo, ik ben Steve Sche van Laboratorium Professor Erin Wheeler in de afdeling Chemie en Instituut voor Biomaterialen en Biomedische Technologie aan de Universiteit van Toronto. Hallo, ik ben is Gabriel van het Wheeler Lab aan de Universiteit van Toronto.
En ik ben Vivian Luke, ook van het Wearer lab aan de Universiteit van Toronto. Ik ben Erin Wheeler. Ik heb het geluk om met Steve Mace en Vivian te werken.
Vandaag laten we je een procedure zien voor proteomische verwerking met behulp van digitale microfluïdica. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om eiwitten en biologische monsters te bestuderen. Dus laten we beginnen.
Start de procedure in de afzuigkap door de glazen substraten in Piranha-oplossing te reinigen. Terwijl u voldoende bescherming draagt, bestaat piranha-oplossing uit drie tot één geconcentreerd zwavelzuur tot 30% waterstofperoxide. Dus zorgvuldigheid is geboden bij het werken met het.
Incubeer de glazen substraten gedurende 10 minuten in piranha en spoel ze na het reinigen af en gedeïoniseerd of gedeïoniseerd water en droog de substraten met stikstofgas. Plaats de substraten in de elektronenbundel-evaporatiekamer voor chromiumdepositie tot een dikte van 250 nanometer. Verwijder de substraten uit de kamer zodra deze dikte is bereikt en spoel af met isopropanol en droog vervolgens gedurende vijf minuten op een hotplate bij 115 graden Celsius.
Prime de gedrooide substraten met hexamethylxylazine of HMDS door 30 seconden te spin coaten. 3000 RPM spin code opnieuw met Shipley S 1811 foto. Weerstand met identieke parameters.
Pre-bakken het substraat direct op een hotplate bij 100 graden Celsius gedurende enkele minuten. Bepaal vervolgens het fotoweerstandspatroon door blootstelling aan ultraviolette of UV-bestraling gedurende vijf seconden via een fotomasker. Ontwikkel vervolgens de UV-blootgestelde substraten in Shipley MF 3 21-ontwikkelaar Genoeg om het substraat drie minuten na te onderdompelen.
Spoel het substraat na in DI-water. Bak direct op een hotplate bij 100 graden Celsius gedurende één minuut. Ets het blootgestelde chroom door de substraten 30 seconden onder te dompelen in net genoeg chroom-etsen om ze volledig te bedekken.
Spoel de substraten met DI-water en dompel ze onder in een Z 300 T-stripper genoeg om het substraat 10 minuten lang te onderdompelen. Om de resterende fotoweerstand te verwijderen. Spoel in DI-water en droog in stikstofgas.
Volgend op deze afzetting, twee tot vijf micrometer Paraline C.Een isolerend polymeer op het substraat door chemische dampdepositie 50 nanometer Teflon AF te deponeren om het oppervlak hydrofoob te maken door een oplossing te spin coaten. 1%gewicht per gewicht in flora nerve FC 40 bij 2000 RPM gedurende 60 seconden. Op het substraat.
Herhaal met ongepasseerd indiumtinoxide of ITO-glassubstraat om de bovenplaat post te maken. Bak beide substraten op een hotplate bij 160 graden Celsius. 10 minuten om het digitale microfluïdische apparaat op te zetten.
Verwijder de polymeercoatings van de contactpads van een ondersubstraat door te schrapen met een scalpel. Koppel de blootgestelde pads van het ondersubstraat met 40 pin connectoren power op een computer die lab view draait. We gebruiken een zelfgebouwde controlebox die relais bevat met signalen gecontroleerd door dpad.
De computercontrolebox vergemakkelijkt de gebruikerscontrole over de toepassing van 100 volt RMS per 18 kilohertz signalen naar het apparaat via de 40 pin connectoren. Schakel ook een functiegenerator en versterker in. Monteer het apparaat door twee stukken dubbelzijdig plakband van 140 micrometer totale dikte op de randen van het ondersubstraat te plaatsen.
Pipetteer vier microliter DI-water in een van de reservoirs en sluit het apparaat af door de niet-gepatroonde indiumtinoxide-schuif op de bovenkant van het apparaat te plaatsen met de Teflon-gecoate kant naar beneden. Bevestig een grondconnector aan de topplaat run. Het lab gemaakte initialisatieprogramma in lab view om de feedback control te kalibreren, is het apparaat nu klaar voor experimenten.
In dit protocol zullen we bovijn serumalbumine of BSA als een eiwitmonster gebruiken om ons digitale microfluïdische ontwerp en gebruik te demonstreren. BSA wordt verdund in werkbuffer of WB gemaakt van 100 millimolair tris HCL pH 7.8 met 0.08%onic F1 27 gewicht per volume. Bereid één milliliter van elk monster en reagensoplossing voor en noteer het reservoir waarin het zal worden toegevoegd.
Na de bereiding van het reagens, verwijdert u de bovenplaat van het apparaat en pipetteert u vier microliter oplossing in het toegewezen reservoir. Nadat de reservoirs zijn gevuld, plaatst u de bovenplaat terug op het apparaat. Gebruik het in-house lab view-programma om de volgende stappen uit te voeren.
Onthoud dat de computerinterface de gebruiker toestaat om ongeveer 600 nanoliter druppels uit reservoirs te doseren en de druppels op de reeks elektroden te manipuleren. Doseer eerst een druppel van een eiwitbevattend monster uit R een en een druppel precipitant uit R twee. Voeg de twee druppels samen en laat de gecombineerde druppel vijf minuten incuberen zodat eiwitten op het oppervlak precipiteren.
Activeer het supernatant weg van het geprecipiteerde eiwit naar het afvalreservoir. R drie, om het geprecipiteerde eiwit te wassen, doseer drie druppels wasbuffer uit R vier en drijft ze over het geprecipiteerde eiwit en het afvalreservoir in. Laat het precipitaat drogen en doseer een druppel resolubilisatiebuffer uit R vijf op het eiwit.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel bespreekt een nieuwe digitale microfluïdica (DMF) methode die meerdere verwerkingsstappen voor klinische proteomics integreert. De techniek maakt het mogelijk om microdruppels op een array van elektroden te manipuleren, waardoor geautomatiseerde biochemische analyses bij kamertemperatuur worden vergemakkelijkt.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Klinische proteomics
- Biochemische analyses
- Digitale microfluïdica
Achtergrond
- Klinische proteomics heeft tot doel biomarkers voor ziektediagnose en prognose te ontdekken.
- Digitale microfluïdica maakt de behandeling van discrete druppels voor biochemische analyse mogelijk.
- De methode kan bij kamertemperatuur draaien, wat de monsterverwerking verbetert.
- Automatisering van proteomische verwerkingsstappen is cruciaal voor efficiëntie.
Doel van de studie
- Om een nieuwe DMF-methode voor klinische proteomics te presenteren.
- Om eiwitextractie, solubilisatie, reductie, alkylering en vertering te integreren.
- Om de voordelen van DMF ten opzichte van conventionele methoden te demonstreren.
Gebruikte methoden
- Integratie van meerdere proteomische verwerkingsstappen met behulp van DMF.
- Gebruik van discrete microdruppels op een elektrodearray.
- Automatisering van monsteranalyse.
- Het uitvoeren van experimenten bij kamertemperatuur.
Belangrijkste resultaten
- De DMF-methode automatiseert met succes verschillende proteomische stappen.
- Parallelle analyse van monsters wordt efficiënt bereikt.
- De methodologie vertoont significante verbeteringen ten opzichte van traditionele technieken.
- Het potentieel voor brede toepassing in klinische proteomics wordt benadrukt.
Conclusies
- De nieuwe DMF-methode vertegenwoordigt een belangrijke vooruitgang in klinische proteomics.
- Het biedt een veelzijdige en efficiënte aanpak voor biomarkerontdekking.
- Toekomstige toepassingen kunnen vroege ziektediagnose en prognose verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Digital microfluidics (DMF) addresses a key bottleneck in clinical proteomics by automating multi-step protein processing workflows, reducing manual handling and associated variability. This enables reproducible, high-throughput preparation of samples for biomarker discovery, directly supporting early-stage target validation and assay development. By integrating extraction, solubilization, reduction, alkylation, and digestion on a single platform, DMF enhances predictive confidence in proteomic data generation for downstream R&D decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through automated, reproducible protein sample preparation from complex biological fluids.
- Operational Value: Reduces manual pipetting steps, minimizing sample loss and contamination during upstream processing.
- Predictive Value: Supports biomarker identification with high sequence coverage and confidence scores, improving target selection reliability.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitatively processable protein digests suitable for mass spectrometry-based screening campaigns.
- Operational Value: Facilitates parallel processing of multiple samples, increasing throughput for hit confirmation and lead profiling.
- Assay Readiness: Produces consistent enzymatic digestion outputs, enabling reliable compound evaluation in proteomic screens.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase proteomics with preclinical validation by ensuring consistent sample preparation across study stages.
- Mechanistic De-risking: Reduces variability in post-translational modification analysis, supporting confident pathway elucidation.
- Predictive Confidence: Enables reproducible generation of proteomic datasets used to inform go/no-go decisions in target advancement.
Pipeline & Workflow Integration
DMF fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis-driven proteomics from initial target engagement through lead identification by delivering standardized, automation-ready sample inputs.
- Discovery Biology: Supports functional target validation by enabling reproducible processing of disease-relevant protein samples from serum or cell lysates.
- Screening: Delivers assay-ready peptide mixtures with consistent digestion efficiency, enabling reliable LC-MS/MS readouts for compound screening.
- Analytics: Generates quantitative, high-confidence proteomic outputs (e.g., sequence coverage >30%, probability scores <1e-3) that facilitate comparative condition analysis.
- Translational Research: Ensures sample preparation consistency from discovery through preclinical stages, supporting biomarker alignment and validation.
- Enterprise Reuse: Provides a reusable platform for automated proteomic processing across multiple projects, reducing revalidation burden.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in protein sample preparation.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability of proteomic workflows through automated droplet manipulation.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by minimizing reagent waste and enabling parallel sample processing.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through reliable, high-quality proteomic data for target validation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device fabrication, surface chemistry, and electrode-based fluid control.
- Depends on access to microfabrication tools (e.g., spin coater, UV exposure system) and instrumentation for electrochemical actuation.
- Necessitates cross-team standardization of device preparation protocols to ensure inter-laboratory reproducibility.
- Involves adaptation considerations when applying the method to diverse sample types (e.g., serum, whole blood, cell lysates) due to varying viscosity and protein content.
- Practical limitations include the need for cleanroom-compatible fabrication steps and careful handling of hydrophobic surfaces to maintain droplet integrity.
