Name: Retro-orbitale injectie in Adult zebravis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-07T18:43:00.000+00:00
Duration: 4 min 50 s
Description: Leer retro-orbitale injectie bij volwassen zebravis voor hematopoëtische stamceltransplantatie. Deze methode maakt visualisatie van bloedceldynamiek mogelijk met fluorescentiemicroscopie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt ondersteund door Howard Hughes Medical Institute en een subsidie ​​van de NIH voor de studie van de embryonale hematopoiese.

Deel 1. De voorbereiding van de injectie materiaal <ol><li> Tg (globine: GFP) cellen: </li><li> Bleed volwassen donor vis met behulp van 10ul pipetpunt coating in heparine (1unit/ul) om het doorprikken vissen achter kieuw. </li><li> Zuig rode bloedcellen en afzien in cel buffer (0,9 x PBS + 5% + 1% FBS Pen / Strep). </li><li> Filter celsuspensie over 40uM mesh en bepaal de concentratie van cellen met behulp van hemocytometer zoals eerder beschreven door Leblanc et al.. </li><li> Spin down en resuspendeer in cel buffer op de gewenste concentratie zodanig dat uiteindelijk injectievolume niet meer dan 5ul. Hier hebben we injecteren 1.5-2 miljoen cellen / ontvanger. </li><li> Voor de dextran, Texas Red ®, Los de kleurstof in DPBS voor een laatste injectie concentratie van 10-12 mg / ml. Van plan om 4 uL per vis injecteren. </li></ol> Deel 2. Injectie <ol><li> Verdoven vis in tricaïne (4.2ml (4mg/ml) tricaine/100ml vis water). </li><li> Was Hamilton spuit 3-4 keer voorafgaand aan de injectie met 70% ethanol. Spoel 3-4 keer met 0.9x DPBS. </li><li> Leg vis dorsale zijde naar boven en naar rechts op vochtige spons. </li><li> Houd de Hamilton spuit met je rechterhand en met je wijsvinger op de zuiger. Voorzichtig stabiliseren het lichaam van de vis met je linkerhand. </li><li> Plaats de naald met de schuine rand naar boven zodanig dat als de vis s oog werden een klok, de naald zou zijn gericht op de 7:00 positie en in een hoek van 45 graden om de vis (figuur 1). </li><li> Steek de naald 1-2 mm in 7:00 positie en langzaam op de zuiger. </li><li> Laat de vis te herstellen in zoet water E3. </li><li> Was naald, zoals hierboven beschreven, tussen de injecties van verschillende reagentia. </li><li> Flick cel oplossing voor hersuspenderen cellen om de paar minuten naar cel klonteren te voorkomen. </li><li> Te houden vis uit stroom voor 1 week met dagelijkse waterverversingen om infectie te voorkomen. We blijven vissen in ICU water voor deze periode (10 ml Stress jas + 5 ml pemafix + 5 ml melafix per 38 liter water E3). </li></ol> Deel 3. Representatieve resultaten Bij het correct wordt uitgevoerd, is het mogelijk om geïnjecteerde materiaal te visualiseren als het is gelabeld of andere manier. Bijvoorbeeld, Tg (globine: GFP) moet de rode bloedcellen te zien onder een tl-dissectie microscoop circuleert in het vaatstelsel van de ontvanger casper vis vlak na injectie zoals weergegeven in figuur 2. Ook kan de injectie van een 70kDa dextran, geconjugeerd met Texas Red ® worden gevisualiseerd in het vaatstelsel van de transparante vis onmiddellijk na retro-orbitale injectie (figuur 3). Fluorescerende niercellen van Tg (β-actine: GFP) donor vis kan ook retro-orbitaal worden geïnjecteerd in bestraald casper ontvanger vis. Deze cellen zullen de thuishaven van de ontvanger beenmerg (figuur 4a) en uiteindelijk kan gaan vervolgens in op de nier herbevolken na enkele weken (figuur 4b). Als de injectie is te ondiep of de hoek van de naald omzeilt de retro-orbitale veneuze sinus holte, kan geïnjecteerde materiaal worden gevisualiseerd bundelen rond de ogen of stromende van te maken. Als alternatief, als de injectie is te diep, kunnen vissen ervaren weefselbeschadiging of overmatig bloeden, hoewel ze nog steeds kunnen herstellen. Wanneer deze wordt uitgevoerd correct, moet mortaliteit na retro-orbitale injectie minder dan 5% van het totaal geïnjecteerde vissen en het succes van levering aan de bloedbaan moet meer dan 90% van het totaal ingespoten vis. <img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="figuur 1"> Figuur 1: Illustratie van retro-orbitale injectietechniek. Het rechter oog van de vis wordt voorgesteld als een analoge klok, waarin de zeven positie komt overeen met de juiste injectie plek. <img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="figuur 2"> Figuur 2: Tg (globine: GFP) rode bloedcellen circuleren in het vaatstelsel van de staart van een volwassen vis casper drie dagen na de retro-orbitale injectie. <img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="figuur 3"> Figuur 3: Succesvolle injectie van een 70kDa dextran geconjugeerd aan Texas Red ® gebruikt als kleurstof produceert fluorescerende bloedvaten in de transparante volwassen vissen, Casper en gemakkelijk bekijken met behulp van standaard hele dier fluorescentie microscopie. <img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig4a.jpg" alt="Figuur 4a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="figuur 4a"> Figuur 4a: Drie dagen na de retro-orbitale injectie van hele nieren beenmerg cellen van Tg (β-actine: GFP) donor vis, de cellen kunnen worden gevisualiseerd homing aan de nieren merg van bestraalde volwassen casper ontvanger vis. <img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig4b.jpg" alt="Figuur 4b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4b"> Figuur4b: Vier weken na de retro-orbitale injectie van hele nieren beenmerg cellen van Tg (β-actine: GFP) donor vissen, de herbevolking van de ontvanger nier met groene donor nier hele beenmerg cellen kunnen worden gevisualiseerd in bestraald volwassen Casper ontvanger vis.

<ol><li>Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+lateral+tail+vein+and+the+retro-orbital+venous+sinus+as+route+of+intravenous+drug+delivery+in+a+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal%22%5BJournal%5D)">Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as route of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model.</a> Lab Animal. 37, 26-32 (2008).</li>
<li>Pinkerton, W., Webber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+injecting+small+laboratory+animals+by+the+ophthalmic+plexus+route%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Soc.+Exp.+Bio.+Med%22%5BJournal%5D)">A method of injecting small laboratory animals by the ophthalmic plexus route.</a> Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 116, 959-961 (1964).</li>
<li>White, R. M., Sessa, A. S., Burke, C., Bowman, T., LeBlanc, J., Ceol, C., Bourque, C., Dovey, M., Goessling, W., Burns, C. E., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).</li>
<li>LeBlanc, J., Bowman, T. V., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+whole+kidney+marrow+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Transplantation of whole kidney marrow in adult zebrafish.</a> J. Vis. Exp. , (2007).</li>
</ol>

Retro-orbitale injectie in volwassen zebravissen geeft het hoogste rendement van de levering van het geïnjecteerde materiaal naar de bloedbaan met de laagste incidentie van mortaliteit. Vanwege de aard van de injectie plek, het lek lijkt te snel te genezen, het verminderen van het voorkomen van besmetting en de hoeveelheid bloedverlies. De site kan zelfs meerdere malen geïnjecteerd worden gedurende een korte tijd voor de dagelijkse injecties met medicijnen, bijvoorbeeld. Grote hoeveelheden d...

<table><tbody><tr><td>Natriumzout van heparine uit varkensdarmslijmvlies</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2106</td><td>Vooraf gewogen flacon van 300 USP-eenheden</td></tr><tr><td>Tricaine-S</td><td>Western Chemical</td><td></td><td>MS-222</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;fosfaatgebufferde zoutoplossing</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Texas Red&amp;#174;</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>D1830</td><td></td></tr><tr><td>E3</td><td></td><td></td><td>5mM NaCl&lt;br/&gt;0,17 mM KCl&lt;br/&gt;0,33 mM CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt;0,33 mM MgSO₄&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Microliterspuit</td><td>Hamilton Co</td><td>80300</td><td>701N 10uL SYR (26s/2&amp;#8221;/2)</td></tr></tbody></table>

retro-orbitale injectie in adult zebravis

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Medicamenteuze behandeling van hele dieren is een essentieel instrument in een modelsysteem voor farmacologische en chemische genetische studies. Intraveneuze (IV) injectie is vaak de meest effectieve en niet-invasieve vorm van levering van een agent van belang. Bij de zebravis (<em&gt; Danio rerio</em&gt;), Is intraveneuze injectie van drugs al lang een uitdaging vanwege de kleine bloedvaten. Dit heeft ook bewezen een belangrijke hindernis voor de injectie van de cellen tijdens hematopoeitic stamceltransplantatie. Historisch gezien werden injecties in de bloedbaan direct uitgevoerd via het hart. Echter, deze intra-cardiale procedure heeft een zeer hoog sterftecijfer als het hart is vaak doorboord tijdens de injectie het verlaten van de vissen vatbaar voor infecties, massaal bloedverlies of fatale schade aan organen. Op basis van onze ervaring met de muis, hebben we een nieuwe injectie procedure in de zebravis, waarin de plaats van injectie is achter het oog en in de retro-orbitale veneuze sinus. Deze retro-orbitale (RO) injectie-techniek is met succes toegepast in zowel de injectie van drugs in de volwassen vissen als de transplantatie van nieren gehele beenmerg cellen. RO injectie heeft een veel lager sterftecijfer dan de traditionele intra-cardiale injectie. Vissen die retro-orbitaal ingespoten hebben de neiging om minder bloeden na de injectie en zijn op een veel lager risico op letsel van een belangrijk orgaan als het hart. Verder, mits goed uitgevoerd, geïnjecteerde cellen en / of drugs snel in de bloedbaan waardoor verbindingen om hun effect hebben op de hele vis en de niercellen om naar huis te gemakkelijk aan hun niche. Zo werd deze nieuwe injectietechniek minimaliseert sterfte terwijl efficiënte levering van materiaal in de bloedbaan van volwassen vis. Hier hebben we illustreren deze techniek door retro-orbitale injectie van Tg (<em&gt; Globine</em&gt;: GFP) cellen in volwassen<em&gt; Casper</em&gt; Vis en de injectie van een rood fluorescerende kleurstof (dextraan, Texas Red<em&gt;</em&gt;) Tot volwassen<em&gt; Casper</em&gt; Vis. Vervolgens hebben we visualiseren een succesvolle injecties door de hele dier fluorescentie microscopie.

Hier laten we zien hoe retro-orbitale injectie te doen in volwassen zebravissen.

Retro-orbitale injectie in Adult zebravis

Farmacologische behandeling van volledige organismen is een essentieel instrument in elk modelsysteem voor farmacologische en chemische genetische studies. Intraveneuze (IV) injectie is ...

Donorrode bloedcellen worden eerst verzameld uit transgene globin GFP-vissen door het hart van het donordier te puncteren en de rode bloedcellen te aspireren. Zodra de cellen klaar zijn voor injectie, worden de recipientvissen retro-orbitaal geïnjecteerd en vervolgens gefotografeerd met standaard fluorescentiemicroscopie van het gehele dier om de succesvolle injectie van fluorescent gelabelde cellen vast te stellen. Op dezelfde manier wordt een gekleurde kleurstof, dextrine geconjugeerd aan Texas red, klaargemaakt en retro-orbitaal geïnjecteerd, waarna het geïnjecteerde dier wordt gefotografeerd om de succesvolle injectie te bevestigen.Hoi, ik ben Emily Atch van het laboratorium van Leonard Zan van de afdeling Hematologie en Oncologie van het Children's Hospital Boston. Vandaag laten we u een procedure zien voor retro-orbitale injectie bij volwassen zebravisjes. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om hematopoëtische stamceltransplantatie te bestuderen.Laten we beginnen. We gaan de retro-orbitale injecties demonstreren van transgene globin GFP-cellen en een rood fluorescerende kleurstof, dextrine geconjugeerd aan Texas Red, in volwassen Casper-vissen, een transparant ras zebravis. Om transgene lobin GFP-cellen voor te bereiden, worden volwassen donorvissen gebloed door een 10 µL pipetpunt gecoat met heparine te gebruiken om de vis achter de kieuwen te doorprikken, rode bloedcellen te aspireren en deze in een celbuffer over te brengen.Filter vervolgens de celsuspensie door een 40 micrometer mesh. Nadat de celconcentratie is bepaald met een hemocytometer zoals eerder beschreven door LeBlanc et al., worden de cellen vijf minuten lang gecentrifugeerd bij 1500 RPM. Resuspendeer de cellen in celbuffer tot de gewenste concentratie, zodanig dat het uiteindelijke injectievolume niet meer dan vijf microliters bedraagt.In deze demonstratie zullen we 1,5 tot 2 miljoen cellen per ontvanger injecteren. Om de rood fluorescerende kleurstof voor te bereiden, lossen we deze op in DPBS voor een uiteindelijke injectieconcentratie van 10 tot 12 milligram per milliliter. We zullen vier microliters per vis injecteren, aangezien de injectieprocedure hetzelfde is. Ongeacht het geïnjecteerde materiaal, zullen we enkel de injectie van de rood fluorescerende kleurstof demonstreren.Voordat de vissen worden geïnjecteerd, dient de Hamilton-spuit drie tot vier keer te worden gewassen met 70% ethanol. Spoel vervolgens drie tot vier keer met 0,9 XDPS. Nadat de vissen in Trica zijn gebouteuzeerd, worden ze met de rugzijde naar boven en naar rechts gericht op een vochtige spons geplaatst.Houd de gevulde Hamilton-spuit met uw rechterhand vast en stabiliseer met uw linkerhand voorzichtig het lichaam van de vis, terwijl u uw wijsvinger op de zuiger houdt. Plaats de naald met de schuin geslepen opening naar boven, zodanig dat als het oog van de vis een klok zou zijn, de naald naar de positie van zeven uur zou wijzen. Steek de naald vervolgens onder een hoek van 45 graden ten opzichte van de vis voorzichtig één tot twee millimeter in de positie van zeven uur en druk langzaam de zuiger in.Laat de vissen herstellen in vers E3-water. Houd de vissen gedurende één week uit de stroming met dagelijkse waterverversingen om infecties te voorkomen; we houden de vissen tijdens deze periode in ICU-water. Wanneer retro-orbitale injecties correct worden uitgevoerd, is het mogelijk om het gelabelde geïnjecteerde materiaal te visualiseren.Bijvoorbeeld, transgene globin GFP rode bloedcellen kunnen onder een fluorescent dissectiemicroscoop worden waargenomen terwijl ze circuleren in het vaatstelsel van de staart van een volwassen Casper-ontvanger drie dagen na injectie; op dezelfde wijze produceert een succesvolle injectie van een 70 kilodalton dextrine geconjugeerd aan Texas red onmiddellijk een fluorescent vaatstelsel. In de transparante volwassen Casper-vis, die gemakkelijk gevisualiseerd kan worden met standaard fluorescentiemicroscopie van het gehele dier, kunnen fluorescenten niermergcellen van transgene beta actin GFP donorvissen ook retro-oraal worden geïnjecteerd in een bestraalde Casper-ontvanger. Deze cellen zullen uiteindelijk migreren naar het merg van de ontvanger, zoals hier getoond drie dagen na injectie; vier weken later kunnen deze groene donorcellen het niermerg van de ontvanger herbevolken.We hebben zojuist gedemonstreerd hoe retro-orbitale injecties bij volwassen zebravisjes worden uitgevoerd. Bij deze procedure is het belangrijk om eraan te denken de naald in een hoek van 45 graden ten opzichte van het vlak van de vis in te brengen. Dat is alles.Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

retro-orbital-injection-in-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Tonen we intraperitoneale injectie in volwassen zebravissen. We maken gebruik van een 10 ul NanoFil injectiespuit bestuurd door een Micro4 controller en UltraMicroPump III. Deze demonstratie omvat het gebruik van koud water als een verdoving.

Intraperitoneale injectie in de Adult zebravis

Een methode om een ​​doelwit eiwit expressie voorwaardelijk knockdown in de volwassen zebravissen netvlies wordt beschreven, wat inhoudt intravitreally injecteren van antisense morpholinos en electroporating ze in het netvlies. De daaruit resulterende eiwitten neergeslagen voor meerdere dagen, waardoor het testen van de eiwit rol in de regenereren of intact netvlies.

In vivo Elektroporatie van Morpholinos in de Adult zebravis Retina

We introduceren een efficiënte methode om retinale ganglioncellen (RGC's) bij volwassen zebravissen retrograad te labelen.

Retrograde Labeling van retinale ganglioncellen in Adult zebravis met fluorescente kleurstoffen

Hier presenteren we een protocol voor celtransplantatie van zebravis skeletspier en embryonaal rabdomyosarcoom (ERMS) in volwassen immuungecompromitteerde rag2E450fs homozygoot mutante zebravissen. Dit protocol maakt een efficiënte analyse van regeneratie en maligne transformatie van spiercellen mogelijk.

Normale en maligne Muscle Cell Transplantation in immuungecompromiteerde Adult zebravis

Deze methode baseert zich op de injectie van 0.5 − 3 l van oplossing in de thorax van volwassen zebravis. De procedure levert efficiënt proteïnen en chemische samenstellingen in de nabijheid van het zebravis hart zonder het orgaan te beschadigen. De aanpak is geschikt voor het testen van effecten van exogene factoren op verschillende weefsels van het hart.

Intrathoracale injectie voor de studie van volwassen zebravis hart

Het artikel legt uit hoe de ogen chirurgisch kunnen worden verwijderd van levende zebravislarven als de eerste stap om te onderzoeken hoe retinale input de groei en ontwikkeling van het optische tectum beïnvloedt. Daarnaast biedt het artikel informatie over larvale anesthesie, fixatie en hersendissectie, gevolgd door immunohistochemie en confocale beeldvorming.

Oogverwijdering bij levende zebravislarven om innervatie-afhankelijke groei en ontwikkeling van het visuele systeem te onderzoeken

Een nieuwe intraperitoneale (IP) injectiemethode bij volwassen zebravissen wordt beschreven. Bij het hanteren van giftige stoffen zoals doxorubicine is deze procedure effectiever dan de twee eerder gerapporteerde IP-methoden. De techniek is zo ontworpen dat het gemakkelijk kan worden toegepast door onderzoekers met beperkte ervaring in het zebravismodel.

Een intraperitoneale injectietechniek bij volwassen zebravissen die lichaamsschade en bijbehorende sterfte minimaliseert

Hier presenteren we een geoptimaliseerd en effectief protocol voor de intraveneuze injectie van cellen of farmacologische middelen in volwassen zebravissen, wat resulteert in verbeterde celtransplantatie en verhoogde overlevingskansen van de behandelde zebravissen.

Geoptimaliseerde intraveneuze injectie bij volwassen zebravissen

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor geautomatiseerde implantatie van tumorxenotransplantaat in zebravislarven met behulp van een state-of-the-art robotinjectiesysteem. Bovendien presenteren we injectievideo's en validatiegegevens die de succesvolle prestaties van het systeem aantonen.

Automatisering van tumorimplantatie in zebravislarven voor kankeronderzoek en geneeskunde

Transplantatie van Whole nier Marrow in Adult zebravis

Leer retro-orbitale injectie bij volwassen zebravis voor hematopoëtische stamceltransplantatie. Deze methode maakt visualisatie van bloedceldynamiek mogelijk met fluorescentiemicroscopie.

Retro-orbitale injectie in Adult zebravis

Meer video's verkennen