Murine Colitis Modeling met dextraansulfaat Natrium (DSS)

Muizen krijgen gedurende vier dagen 3% DSS in het drinkwater. Terwijl het gewicht en de aanwezigheid van diarree en bloed in de feces dagelijks worden geregistreerd, wordt het DSS na de vierde dag vervangen door autoclaafwater. Na drie dagen op water worden de muizen geëuthanaseerd en worden hun colons verwijderd.

De dikke darmen worden gemeten en gewogen. Vervolgens worden de dikke darmen gevormd tot Swiss rolls of worstjes en onder een microscoop onderzocht. In dit videoartikel wordt het oogsten en verwerken van dikke darmen in een muismodel van colitis gedemonstreerd.

Deze procedure wordt gebruikt om colitis te bestuderen in het laboratorium van Dr. Christopher Williams van de afdeling Cancer Biology aan de Vanderbilt University voorafgaand aan de start van de behandeling met dextrannatriumsulfaat. Baseline-gewichten worden gedurende het gehele experiment vastgesteld. Dagelijkse gewichten worden bepaald nadat de muizen zijn gewogen; maak een 3% gewicht-per-volumeloplossing van dextrannatriumsulfaat, of DSS, in water.

Voor de effectiviteit van dit model moet de DSS een laag molecuulgewicht hebben; maak voldoende DSS-oplossing om een waterfles voor elke kooi muizen te vullen en filter de oplossing met een cellulose-acetaatfilter van 0,45 micrometer. Vervang de drinkwaterfles in de kooi met muizen door een fles met 3% DSS-oplossing. Als uw instelling gebruikmaakt van een geautomatiseerd waterdozingsysteem, plaats dan blokkeringstips op de wateruitlaten om ervoor te zorgen dat de muizen geen toegang hebben tot enige andere waterbron.

Na vier dagen worden de muizen opnieuw gewogen om de systemische gevolgen van colitis te kwantificeren. Gewichtsverlies komt vaak voor bij ernstige letsels, maar is mogelijk pas na enkele dagen zichtbaar op dezelfde dag. Vervang op dag vier de DSS-oplossing door water voor nog eens drie dagen om enig herstel van het colonepitheel mogelijk te maken.

Drie dagen later, op dag zeven, worden de muizen opnieuw gewogen. De dikke darm kan vervolgens worden geoogst van de geëuthanaseerde muizen, zoals weergegeven in de volgende sectie. Om de dikke darm te oogsten, legt u de ventrale zijde van de geëuthanaseerde muis bloot om een ongehinderde toegang tot de buikholte te garanderen.

Bevocht de buik volledig met 70% ethanol. Pak de middellijn van de buik vast met weefselpincetten en til deze op. Trek zo de huid strak om deze met fijngepunte scharen in te snijden.

Maak een incisie in de buikwand om de buikinhoud bloot te leggen. Breid de incisie in de middellijn uit tot aan de punt van het xiphoïd-proces, en vervolgens langs de inferieure zijde van de costale randen aan beide zijden. Identificeer het caecum van de dunne darm en het colon.

Dissekeer of ontward voorzichtig de colon van het omringende mesenterium. Transecteer daarna de colon dieper in het bekken om de distale colon van het rectum te bevrijden.

Er moet zorgvuldig worden gewerkt om te voorkomen dat er slagaders of aders worden doorgesneden. Houd er daarnaast rekening mee dat de dikke darm gemakkelijk kan scheuren. Verwijder de dikke darm daarom voorzichtig van het mesenterium.

Transecteer de colon bij de Colona sequel-marge om de proximale colon vrij te maken. Verwijder de colon en intubeer deze vervolgens met een voedingsnaald van 20 gauge en een spuit van 10 milliliter; spoel de colon met ijskoud PBS totdat de EIT volledig vrij is van feces. Het is belangrijk om de juiste oriëntatie van de colon te behouden door het distale uiteinde van de colon het dichtst bij u te houden.

Begin met het meten van de colonlengte met een digitale schuifmaat. De colonlengte is een andere indicator voor de ernst van het letsel. Colitis verhoogt het oedeem en verkort de totale lengte van de colon.

Op dit punt kunnen de geoogste colons ofwel worden verwerkt als worstjes voor macroscopische analyse, of worden gemaakt tot een Swiss roll voor histologische analyse van acute colitis. We zullen deze technieken in de volgende secties demonstreren om de colon als een worstje te verwerken. Voor macroscopische analyse van de gehele colon is het belangrijk om de juiste oriëntatie van de colon te behouden. Houd daarom het distale uiteinde van de colon het dichtst bij u.

Knip twee stukjes niet-absorbeerbare hechtdraad af, één van ongeveer één inch en de andere van twee inch lang. Gebruik het stuk hechtdraad van twee inch om het distale uiteinde van het colon zo dicht mogelijk bij de rand af te binden, terwijl een goede afdichting behouden blijft. Plaats vervolgens een voedingsnaald van 20 gauge met vijf milliliter 10% gebufferde formalinefosfaat in het proximale uiteinde van het colon.

Knoop het resterende stuk hechtdraad losjes vast, direct proximaal van de bol van de voedingsnaald. Pak nu de dikke darm stevig vast bij de bol van de voedingsnaald en infuseer een voldoende hoeveelheid formaline, waarbij u ervoor zorgt dat de dikke darm uitzet. Trek de knoop van de hechtdraad aan terwijl u de voedingsnaald verwijdert, zodat de geïnfuseerde, uitgezette dikke darm behouden blijft.

Vul een conische buis van 15 milliliter met 10% gebufferde formol-fosfaatoplossing en label de buis. Plaats de dikke darm in de buis en fixeer deze gedurende 24 uur. Giet na 24 uur de formol in een geschikte afvalbak en vervang deze door 70% ethanol voor nog eens 24 uur.

Dikkedarmen kunnen onbeperkt worden bewaard in 70% ethanol bij kamertemperatuur. Wanneer u klaar bent om de dikkedarm te analyseren, haalt u deze uit de conische buis. Snijd de draden aan beide uiteinden door met een scalpel, waarbij u er voorzichtig op let dat de dikkedarm niet beschadigd raakt.

Onthoud dat het distale uiteinde het langste stuk touw heeft. Snijd de dikke darm in de lengterichting open van het distale naar het proximale uiteinde, zodat er een lang vel ontstaat. De dikke darm kan nu onder een dissectiemicroscoop worden bekeken.

Snijd de dikke darm in de lengte open en spreid de dikke darm uit als een plat blad. Het oprollen van de dikke darm vereist twee paren pincetten en een techniek met twee handen. Pak beide zijranden van de distale rand van de dikke darm vast met pincetten en rol de dikke darm vervolgens sequentieel op door de pincetten te draaien en los te laten in de richting van de proximale rand, waardoor een spiraal met een derde dimensie of een 'Swiss roll' ontstaat.

Indien de dikke darm aan het watmanpapier kleeft, bevochtig het papier en de dikke darm dan met een kleine hoeveelheid PBS om de vorm te behouden. Pak de rol stevig vast met een pincet en doorsnij deze met een naald van 27,5 gauge. Zet de rol vast door de naald te buigen zodra deze uit de rol komt.

Plaats de rol nu in een gelabelde weefselcassette en zet de cassette in een pot met 10% gebufferde fosfaatformaline. Laat dit 24 uur op kamertemperatuur staan om het weefsel te fixeren. Giet na 24 uur de formaline af en vervang deze door 70% ethanol voor nog eens vier uur.

Colons kunnen onbeperkt worden bewaard in 70% ethanol bij kamertemperatuur. Dit model stelt de onderzoeker in staat om colons te verkrijgen, te fixeren en te analyseren, waardoor de ernst van de colitis kan worden bepaald. Voor macroscopische analyse van het gehele colon kan het colon worden verwerkt als een worst die is geïnfuseerd met formaline en volledig is uitgezet.

De geopende darm moet plat liggen. Als de worstmethode correct is uitgevoerd, zal de gefixeerde dikke darm gedilateerd zijn en kan het gehele slijmvliesoppervlak eenvoudig worden gemanipuleerd en bekeken onder de dissectiemicroscoop. Voor histologische analyse kan de dikke darm worden verwerkt als een Swiss roll.

De rol wordt met een naald vastgezet en in een weefselcassette geplaatst voor fixatie. Wanneer de rol wordt gesneden en gemonteerd, moet deze een representatieve doorsnede van de gehele dikke darm vormen als deze correct is opgerold; secties van de Swiss roll kunnen worden gekleurd met hematine en ASIN om de omvang van het letsel aan de dikke darm te bepalen. Houd er rekening mee dat het distale uiteinde van de dikke darm zich in het centrum van de rol op de objectglas bevindt.

In dit voorbeeld zijn ontsteking en schade aan de crypten duidelijk zichtbaar in de met DSS behandelde colon in vergelijking met een met water behandelde controle. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe colons geoogst en verwerkt moeten worden vanuit een muismodel voor acute colitis. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk dat u goed georganiseerd bent voorafgaand aan het opofferen.

Zorg er bijvoorbeeld voor dat alle buisjes en cassettes voor elke muis zijn gelabeld en dat alle instrumenten en reagentia direct beschikbaar zijn. Houd daarnaast gedetailleerde verslagen bij van het lichaamsgewicht van de muizen en de darmlengte. Zorg tot slot dat u voldoende tijd heeft ingeruimd voor de verwerking.

Gewoonlijk duurt het 15 minuten per muis voor een beginner en zes tot acht minuten voor iemand die meer ervaren is in deze techniek.