Met behulp van de Gene Puiser MXcell Elektroporatie systeem om primaire cellen transfecteren met een hoog rendement

Het algemene doel van dit protocol is het identificeren van de optimale electroporatiecondities voor het transfecteren van primaire cellijnen met behulp van embryonale muis fibroblasten, of mfs. Als voorbeeld worden MF-cellen en het gekozen nucleïnezuur geladen in een electroporatieplaat van 96 putjes die is aangesloten op het Gene Pulser MX-cellsysteem, waardoor het mogelijk is om meerdere electroporatiecondities in één run te testen. Voor optimalisatie-experimenten worden de cellen na electroporatie gekweekt en geanalyseerd op transfectie-efficiëntie.

Met behulp van epi-fluorescentiemicroscopie en flowcytometrie kunnen vervolgens de meest efficiënte electroporatiecondities worden geselecteerd voor toekomstige transfecties. Hallo, ik ben Adam McCoy, senior scientist bij de Gene Expression Division van BioRad Laboratories. Vandaag laten we u een procedure zien om eenvoudig de beste electroporatiecondities te bepalen voor het transfecteren van primaire cellijnen.

Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om genexpressie in deze cellen te bestuderen. Vandaag zal ik drie verschillende passagegetallen van mes of muis embryonale fibroblasten gebruiken. Ik gebruik culturen met verschillende passagegetallen om twee redenen.

Ten eerste zal ik laten zien hoe belangrijk de gezondheid van de cellen is; bij primaire cellijnen kunnen zelfs slechts enkele extra dagen in cultuur al een verschil maken in de transfectie-efficiëntie. Ten tweede wil ik aantonen dat het proces voor het bepalen van de optimale condities hetzelfde blijft, ook al neemt de transfectie-efficiëntie bij oudere cellen af. Uw experiment zal waarschijnlijk geen cellen van verschillende leeftijden bevatten.

U kunt dezelfde procedure volgen met uw eigen experimentele ontwerp. Als u de genexpressie tussen controlecellen en behandelde cellen wilt vergelijken, kunt u eerst de beste condities bepalen en vervolgens uw experiment uitvoeren met de geïdentificeerde condities. Alternatief kunt u de optimalisatie en het experiment gelijktijdig uitvoeren.

Zoals ik vandaag zal demonstreren, gebruik ik een GFP-coderend plasmide om de transfectie-efficiëntie via flowcytometrie te onderzoeken. De electroporatieprocedure blijft echter hetzelfde, zelfs als u iets anders doet, zoals het introduceren van irna en het bestuderen van genexpressie via real-time PCR. Laten we beginnen.

De muis embryonale fibroblasten, of MEF's, die in dit protocol worden gebruikt, zijn adherente cellen. De eerste stap bij het werken met deze cellen is daarom het losmaken van de cellen van de bodem van de kolf met behulp van standaard weefselkweekprotocollen met trypsinisatie. Nadat de cellen zijn losgekomen van de kolf, wordt de trypsine geneutraliseerd met medium dat serum bevat, waarna de cellen worden opgevangen in 50 milliliter conische buizen.

Centrifuge de cellen zodra deze zijn verzameld, totdat de cellen zijn gepelletteerd. Was de cellen vervolgens door ze te resuspenderen in een bekend volume PBS. Tel de cellen zodra ze volledig zijn geresuspendeerd, met het oog op de benodigde concentratie van 1 miljoen cellen per milliliter voor de elektroporatie-experimenten.

Bereken het juiste aantal cellen op basis van de cel telling en breng deze over naar een schone buis. Centrifugeer om de cellen te pelletteren. Verwijder vervolgens voorzichtig het supernatant.

Resuspendeer de cellen in electroporatiebuffer tot een concentratie van 1 miljoen cellen per milliliter en voeg 20 microgram per milliliter van het plasmide toe. De platen zijn verdeeld in 96 wells, met kolommen gelabeld van 1 tot 12 en rijen van A tot H; elke set van vier wells, of wellset, deelt een paar elektrodeplaten, zodat de cellen in deze wells aan dezelfde puls worden blootgesteld. Bijvoorbeeld: cellen 1A, 1B, 1C en 1D zijn elektrisch verbonden in één enkele wellset en zouden allemaal dezelfde puls ontvangen.

De volgende set van vier wells, 2A, 2B, 2C en 2D, zouden allemaal de tweede puls ontvangen wanneer het protocol wordt gestart. Hoewel de parameters hetzelfde kunnen zijn, is de 96-wells electroporatieplaat zo ingesteld dat de bovenste en onderste helft van de plaat zijn verdeeld. Dus wells 1E, 1F, 1G en 1H onderaan de plaat ontvingen allemaal één puls. Deze is echter verschillend van de puls die door wells 1A, 1B, 1C en 1D bovenaan is ontvangen.

In dit experiment zal slechts de helft van de plaat worden gebruikt. De eerste drie putjes van elke putjeset bevatten cellen van verschillende leeftijden. De cellen in de bovenste rij, rij A, zijn vijf keer gepasseerd.

De cellen in rij B zijn negen keer gepassaged en de cellen in rij C zijn 13 keer gepassageerd. Rij D bevat vóór de elektroporatie alleen elektroporatiebuffer. Het is raadzaam om uw protocol te controleren om er zeker van te zijn dat de instellingen correct zijn.

Dit protocol levert zes pulsen met exponentiële afname, gevolgd door zes blokgolfpulsen. De pulsen met exponentiële afname lopen op van 200 volt tot 450 volt en maken allemaal gebruik van slechts 350 micro farads, vanwege de lage weerstand van de gebruikte genpuls- of electroporatiebuffer.

De blokgolfpulsen variëren in zowel spanning als pulsduur. De capaciteitsinstelling van het instrument moet worden afgestemd op de geleidbaarheid van het elektroporatiemengsel. Indien er een buffer met een hogere weerstand voor de elektroporatie wordt gebruikt, zoals DMEM, kan hetzelfde spanningsbereik worden gehanteerd, maar met een grotere capaciteit, zoals 950 µF voor de exponentiële vervalpulsen.

Als de optimale capaciteit van de door u gebruikte buffer niet bekend is, moet u ook de capaciteit variëren in de electroporatiecondities die u test. De volgende stap is om 150 µL van het mengsel van cellen en plasmiden in elke put te laden die voor dit experiment wordt gebruikt. De vierde put van elke gebruikte set putten wordt gevuld met electroporatiebuffer.

Plaats de plaat na het laden in de MXL-plaatkamer en sluit het deksel. Druk vervolgens op pulse om de cellen te electroporeren. De electroporator levert de elektrische pulsen sequentieel aan elke well, ingesteld volgens de voorwaarden die zijn gespecificeerd in het gekozen protocol.

Het duurt enkele seconden om alle cellen te electroporeren. Zodra de puls is voltooid, verwijdert u de plaat uit de plaatkamer. Draag de cellen uit elke well over naar een kweekschaal met voorverwarmd kweekmedium.

Deze cellen worden gekweekt in DMEM aangevuld met 10% FBS. Controlemonsters die niet zijn ge-electroporeerd, worden genomen uit het resterende cel-plasmide mengsel en toegevoegd aan kweekschalen die het voorverwarmde medium bevatten van dezelfde samenstelling als het medium dat voor de ge-electroporeerde cellen is gebruikt. Draai tot slot zachtjes rond.

Tik vervolgens op de plaat om de cellen te verdelen voordat deze gedurende 24 uur bij 37 °C en 5% carbon dioxide in de incubator wordt geplaatst, alvorens de transfectie-efficiëntie te analyseren en te bepalen welke elektroporatiecondities het best zijn voor uw experiment. Zodra de optimale elektroporatiecondities zijn geïdentificeerd, is er een keuze uit twee elektroporatiemethoden voor toekomstige experimenten. De onderzoeker kan ervoor kiezen om cellen in 96-wells platen te behandelen of cellen in cuvetten per enkel sample te behandelen.

Cuvetten kunnen slechts één monster tegelijk bevatten en vereisen vier keer het volume dat nodig is voor één putje van de 96-wells platen, maar individuele cuvetten zijn goedkoper en eenvoudig in gebruik wanneer slechts een klein aantal monsters nodig is. Het Gene Pulse- of MX-cellsysteem is zo ontworpen dat men dezelfde electroporatie-instellingen kan gebruiken voor zowel de platen als de cuvetten. Gebruik in plaats van de plaatkamer de MX1 shock pod voor cuvetten.

Koppel de plaatkamer los van de achterzijde van het instrument en sluit de shock pod aan. Aangezien de shock pod alleen de puls afgeeft die is geprogrammeerd voor well set A, B, C, D 1, moet er mogelijk een ander programma worden geselecteerd. Om een eerder opgeslagen programma te selecteren, drukt u op home.

Select vervolgens optie drie, gebruikersprotocollen. Als u zich al in de juiste gebruikersmap bevindt, drukt u op enter om gebruikersprotocollen te selecteren en scrolt u naar beneden. Druk op enter om het juiste programma te selecteren zodra dit is gemarkeerd.

Het instrument is nu gereed. Nu het programma is geselecteerd, kunnen de cuvetten worden klaargemaakt. Het mengsel van plasmide en MEF's wordt op dezelfde wijze bereid als eerder getoond.

Vul elke 0,4 centimeter vet met hetzelfde volume dat werd gebruikt voor een volledige set putjes in de 96-putjesplaten. Aangezien een set vier putjes bevat en er 150 microliters van ofwel de buffer of het celmengsel per putje werd gebruikt, bedroeg dit 600 microliters van het plasmide-celmengsel per vete.

Plaats vervolgens de cuvet in de shock pod-kamer en druk op 'pulse' om de elektrische schok aan de cellen toe te dienen. Ga na de electroporatie verder zoals bij de plaatmethode: meng de cellen en breng vervolgens aliquoten over naar celkweekplaten gevuld met voorverwarmd medium, inclusief een set controles. Voor de wells die niet zijn ge-electroporeerd, wordt de plaat rondgedraaid en agetikt.

Laat de cellen vervolgens 24 uur herstellen bij 37 °C en 5% koolstofdioxide voordat de transfectie-efficiëntie wordt geanalyseerd na het transfecteren van de cellen en het herstelproces. Analyseer de transfectie-efficiëntie kwalitatief met behulp van epifluorescentiemicroscopie en kwantitatief met behulp van flowcytometrie; cellen die succesvol zijn geëlectroporeerd en nu het GFP-gen tot expressie brengen, verschijnen groen onder epifluorescentiemicroscopie; hier wordt een typisch succesvol resultaat getoond. Het bekijken van de cellen onder fasecontrast maakt de visualisatie van zowel getransfecteerde als niet-getransfecteerde cellen mogelijk.

Hier worden de cellen getoond die zijn blootgesteld aan de electroporatiepuls met het laagste voltage van 200 volts. De cellen zijn grotendeels confluent vanwege de hoge celdichtheid. Hetzelfde gezichtsveld onder epi-fluorescentie laat zien dat een aantal cellen de GFP-marker tot expressie brengt, maar dit is slechts een klein percentage van de cellen die zichtbaar waren in de vorige afbeelding bij 250 volts.

Het totale aantal levende cellen dat onder fasecontrast zichtbaar is, neemt licht af onder epi-fluorescentie. We kunnen zien dat het aantal GFP-expresserende cellen is toegenomen bij de hoogste toegepaste spanning van 375 volts. Er zijn minder levende cellen zichtbaar, maar een groot percentage van de resterende cellen is GFP-expresserend.

Welke conditie optimaal is, hangt af van het experimentele ontwerp. In sommige experimenten kan het grootste aantal getransfecteerde cellen optimaal zijn. In andere experimenten kan het hoogste transfectiepercentage het beste zijn.

Wij zijn geïnteresseerd in het percentage cellen dat GFP-positief is onder elke conditie en hoe deze percentages variëren met de celleeftijd. Flowcytometrie kan kwantitatieve informatie verschaffen over de transfectieresultaten onder elk van de verschillende electroporatiecondities. Hier wordt het percentage cellen getoond dat GFP-positief is in de passage.

Vijf cellijnen. Onder elk van de 12 electroporatiecondities was het maximale transfectiepercentage ongeveer 80% bij de hoogste spanning met exponentieel verval. Pulsconditie zes en 70 bij de sterkste geteste vierkante golfpuls, conditie 12, waarbij de cellen negen keer waren gepasseerd voorafgaand aan de electroporatie.

Het algemene patroon van het transfectiepercentage is vrijwel identiek, maar met een zeer lichte afname in de getoonde transfectiepercentages. Hier zijn de percentages GFP-cellen in de passage 13-cellen, die een duidelijke afname in het transfectiepercentage vertonen ten opzichte van de jongere cellen. De hoogste transfectiepercentages waren ongeveer de helft van wat met de jongere cellen werd bereikt, wat het belang aantoont van het gebruik van gezonde cellen zo kort mogelijk na isolatie.

Ik heb u zojuist laten zien hoe u het MXL-elektroporatiesysteem gebruikt om de optimale omstandigheden te bepalen voor het elektroporeren van MAPK's of andere primaire cellijnen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat u gezonde cellen gebruikt zo kort mogelijk na isolatie en dat u elektroporatiecondities hanteert die zijn afgestemd op de elektroporatiebuffer. Dat is alles.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.