Name: Primaire Cultuur en Plasmide Elektroporatie van de muizen orgaan van Corti. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Leer de primaire cultuur en elektroporatie van het orgaan van Corti bij muizen voor auditief onderzoek. Deze methode maakt genexpressie-analyse en in vitro-studie van haarcelbiologie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag Demêmes Danielle en Douglas Cotanche bedanken en voor hun inzet in het onderwijs ons de methoden voor de isolatie van het orgaan van Corti. Daarnaast willen we bedanken Ismaël Stefanov-Wagner voor engineering van de electroporator elektroden, Sherry Lin voor haar bijdrage kunstwerk aan de video-animatie, en Matthew Chana, Jason Meeker en Kendra Marshall ( <a href="http://www.goodfightproductions.com">www.goodfightproductions.com</a> ) voor het produceren van de video. Dit werk werd gefinancierd door subsidies (R03DC010065-Parker, RO1DC007174-Edge; P30DC05209-MEEI Core Ondersteuning voor Hearing Research) van de NIDCD, toont.

Dag 1. Sterilisatie en coaten van glas dekglaasjes. <ol><li> Droog steriliseren glas microscoop dekglaasjes in een autoclaaf. </li><li> Plaats de gesteriliseerde dekglaasjes in twee putten van een pre-gesteriliseerde vier-en celcultuur schotel. </li><li> Coat de dekglaasjes met 1:1 poly-L-ornithine en laminine aangevuld met 20% foetaal runderserum (FBS) overnacht bij 4 ° C. <ol class="lalpha"><li> 400 pi poly-L-ornithine (0,01% oplossing bewaard bij 4 ° C) </li><li> 400 pi laminine (50 ug / ml stockoplossing opgeslagen in porties bij -20 ° C) </li><li> 200 pi FBS (opgeslagen in porties bij -20 ° C) </li></ol></li><li> Warmte-steriliseren van de dissectie-instrumenten 's nachts in een 150 ° C incubator. </li><li> Maak kweekmedium dat 10% serum en 10 mg / ml ampicilline. <ol class="lalpha"><li> 90 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium </li><li> 5 ml FBS (opgeslagen in porties bij -20 ° C) </li><li> 5 ml paard serum (opgeslagen in porties bij -20 ° C) </li><li> 10 pi ampicilline (10 mg / ml voorraadoplossing bewaard bij 4 ° C) </li></ol></li></ol> Dag 2. Isolatie van het orgaan van Corti. <ol><li> Steriliseer de positieve stroom dissectie kap. <ol class="lalpha"><li> zetten UV-licht gedurende 20 minuten </li><li> spuiten alle oppervlakken met 70% ethanol en wacht 5 minuten voor gebruik. </li></ol></li><li> Onthoofden muis pup (P4) aan de basis van het foramen magnum met behulp van operationele schaar. </li><li> Kort spoel het hoofd in 10 cm schotel met 70% ethanol. </li><li> Verwijder de opperhuid met behulp van een scalpel. </li><li> Open de schedel langs de pijlnaad met behulp van een scalpel en dan halveren de voorhersenen. Bewaar de caudale voorhersenen voor verdere dissectie. </li><li> Verwijder de voorhersenen, de kleine hersenen en de hersenstam met stompe dissectie. </li><li> Verwijder de tijdelijke botten (fig. 2A), dompel ze kort in 70% ethanol, en breng ze naar een 3 mm schotel met steriele HBSS. </li><li> Met behulp van een tang, verwijder de bulla en het omliggende weefsel van de petrous gedeelte van het slaapbeen. </li><li> Zoek de schelp vorm slakkenhuis (fig. 2B) en scheiden van het vestibulaire systeem met behulp van een tang. </li><li> In deze fase van ontwikkeling, is het benige labyrint niet volledig verkalkt en is gemakkelijk te ontleed met behulp van een tang. Verwijder het benige labyrint van het slakkenhuis door een zorgvuldige scheiding te beginnen bij de basale einde en bewegende apicaal met behulp van een tang. </li><li> De spiraal ligament en de bijgevoegde orgaan van Corti is opgerold langs de spiraal van de modiolus (fig. 2C). Verwijder voorzichtig het orgaan van Corti door het veiligstellen van de spiraal ligament aan de haak gebied van de basis met behulp van pincet en tot rust te komen als je beweegt apicaal. </li><li> Beginnend bij de basis, verwijdert u de spiraal ligament van het orgaan van Corti met behulp van # 55 fijn pincet (fig. 2D). Micro-isolatie van het orgaan van Corti sensorische epitheel (optioneel). </li><li> Verwijder het orgaan van Corti haak regio van de bodem met behulp van twee ½ cc insuline-injectiespuiten met permanent bevestigde U-100 28G ½ naalden als tang. </li><li> Vanaf de top, verwijder de spiraal limbus van de rij binnenste haarcellen en ga verder basaal (fig. 2E-F). Plating het orgaan van Corti explantatie </li><li> Haal de poly-L-ornithine/laminin/FBS oplossing uit de cultuur putten en voeg 130 ul van de cultuur medium. </li><li> Breng de ontleed orgaan van Corti aan de gecoate glas dekglaasje in de cultuur goed en oriënteren van de explantatie, zodat de cilia van de haarcellen naar boven wijzen. </li><li> Verwijder het medium in de cultuur goed met behulp van een 200 pi pipet. Zorg ervoor dat het basilair membraan stevig contact maakt met het gecoat glas dekglaasje aan. </li><li> Voeg voorzichtig 130 pi kweekmedium aan het orgaan van Corti met behulp van een 200 ml pipet. Van toepassing zijn twee druppels op het oppervlak van het orgaan van Corti en dan langzaam de resterende volume toe te voegen aan de zijkant van de dekglaasje aan. Zorg ervoor dat het orgaan van Corti niet zweven in de cultuur media, maar blijft aangebracht op het dekglaasje. </li><li> Incubeer overnacht bij 37 ° C in de aanwezigheid van 5% CO 2. </li></ol> Dag 3. Elektroporatie van de reporter-gen in gekweekte orgaan van Corti. <ol><li> Verwijder het kweekmedium van het orgaan van Corti cultuur. </li><li> Voeg 130 uL H 2 O voor 1 minuut en daarna verwijderen met behulp van een 200 pi pipet. </li><li> Voeg 30 ul van DsRed reporter plasmide (2 mg / ml H 2 O opgeslagen bij -20 ° C). </li><li> Vooraf de elektroden van de electroporator met behulp van een micromanipulator, zodat de anode eennd kathode zijn aan beide kanten van de cultuur. </li><li> Genereer een puls (27V, 30 ms duur, 10 pulsreeksen) om het reportergen electroporate in het orgaan van Corti explantatie cultuur. <ol class="lalpha"><li> Optioneel: de polariteit van de pols houden om elektroporatie van het transgen zorgen op zowel de modiolar en de spiraal ligament zijden van de explantatie. </li></ol></li><li> Wacht 5 minuten. </li><li> Voeg 130 ul van de Fugene 6: DNA-oplossing (3 delen Fugene tot 2 delen DNA). Deze oplossing moet voorafgaand aan de start van de elektroporatie procedure (stap 20) met behulp van een 3 ml ronde bodem polystyreen reageerbuis in een laminaire stroming kap worden voorbereid. Om deze oplossing te maken: <ol class="lalpha"><li> Voeg 2,4 ul van Opti-MEM (opgeslagen bij 4 ° C) om de reageerbuis. </li><li> Voeg 0,6 ul van Fugene 6 reagens (opgeslagen bij 4 ° C) om de reageerbuis. Zorg ervoor dat de Fugene direct toe te voegen aan de Opti-MEM en direct contact met de zijkanten van de reageerbuis te vermijden. </li><li> Vortex gedurende 1 seconde. </li><li> Incubeer 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg 2,0 ul DsRed reporterplasmide dubbelstrengs DNA (opgeslagen bij -20 ° C bij 100 ug DNA / ml H 2 O monsters). </li><li> Vortex gedurende 1 seconde. </li><li> Incubeer 15 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg 200 ul van kweekmedium. </li><li> Vortex gedurende 1 seconde. </li></ol></li><li> Incubeer overnacht bij 37 ° C in 5% CO 2. </li><li> Voeg 2 mL kweekmedium aan de cultuur goed en incubeer 37 ° C gedurende maximaal 10 dagen. </li></ol> Representatieve resultaten We presenteren een methode voor de isolatie van het orgaan van Corti van een perinatale muis. De procedure kan worden gebruikt voor muizen zo jong als embryonale dag 16 tot ongeveer postnatale dag 6, op welk punt de benige labyrint voldoende wordt verkalkte te maken van de dissectie omslachtig. Zodra het orgaan van Corti is ontleed, kan het worden uitgeplaat en gekweekt hetzij in haar geheel (fig 3) of als micro-geïsoleerde sensorische epitheel (fig 4). We hebben verder presenteerde een techniek om exogene genen tot expressie in de gekweekte orgaan van Corti. De organotypische cultuur is geschikt voor veel andere soorten onderzoek, zoals de analyse van het orgaan van Corti genexpressie met behulp van RT-PCR of in situ hybridisatie, het orgaan van Corti co-cultuur met spiraal ganglion cellen of exogene stamcellen met behulp van de micro-isoleren 3, of in vitro analyse van haar cel dood en regeneratie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig1tmb.jpg" alt="Figuur 1" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"></a> Figuur 1. Doorsnede van de P4 muriene orgaan van Corti. (A) Een dwarsdoorsnede van de basale begin van een cryosectioned cochlea verkregen uit een P4 muis illustreert de algemene structuren van de muis cochlea beschreven in dit protocol. De scala media wordt begrensd door de spiraal ligament en stria vascularis lateraal, de Reissner s membraan superiorly, de spiraal limbus mediaal, en het basilair membraan inferiorly. De doos aangegeven de regio uitgebreid in B. (B) Het orgaan van Corti bevindt zich aan de superieure kant van het basilair membraan en bevat een rij binnenste haarcellen, drie rijen buitenste haarcellen, en hun respectieve ondersteunende cellen. Onderbroken lijn 1 geeft de locatie langs het basilair membraan dat is verwijderd tijdens dit orgaan van Corti dissectie. Onderbroken lijn 2 geeft de locatie langs het basilair membraan dat is verwijderd tijdens de micro-isolatie procedure. Groen geeft aan immunohistochemische kenmerken van calbindin, die interdentale cellen van de spiraal limbus, cochleaire haarcellen, spiraal ganglion neuronen, maar ook cellen van de spiraal ligament en stria vascularis 7 labels. DAPI de etikettering van kernen is in het blauw. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig2.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig2tmb.jpg" alt="Figuur 2" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"></a> Figuur 2. Orgaan van Corti dissectie. Beelden uit de bijbehorende video van het orgaan van Corti dissectie highlight A) van de cochlea en het evenwichtsorgaan zich in het geïsoleerde slaapbeen (rood), B), de benige labyrint van het slakkenhuis, C) de spiraal ligament en de bijgevoegde orgaan van Corti na het verwijderen van het benige labyrint, D) het verwijderen van de spiraal ligament en stria vascularis (rood) van het orgaan van Corti, E) micro-isolatie van de sensorische epitheel van de spiraal limbus (rood), en F) van de geïsoleerde spiraal limbus (links) en sensorische epitheel (rechts). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig3.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig3tmb.jpg" alt="Figuur 3" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"></a> Figuur 3. Gekweekte orgaan van Corti explant. DIC afbeelding met het orgel vanCorti van een P4 Atoh1-nGFP muis die geïsoleerd, verzilverd, en gekweekt werd vijf dagen zoals beschreven. Deze muis is genetisch zo gebouwd dat cellen die de pro-haarcel gen Atonal homoloog 1 (Atoh1 aka Math1) vertonen een groen fluorescerend eiwit dat is gelokaliseerd aan de kern 8. De organen van Corti van deze muizen vertonen een nucleaire GFP label in alle haar celkernen en daardoor zorgen voor eenvoudige visualisatie van de sensorische epitheel met behulp van een epifluorescerende microscoop. De relatief grote spiraal limbus kan worden gezien lateraal van de sensorische epitheel. Mesenchymale cellen die afkomstig zijn van het orgaan van Corti zijn weg gemigreerd van het explantatie. Blauwe nucleaire label is DAPI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig4.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig4tmb.jpg" alt="Figuur 4" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"></a> Figuur 4. Micro-geïsoleerde sensorische epitheel. Epifluorescerende beeld verkregen van de zintuiglijke epitheel dat is geïsoleerd uit een P4 muriene orgaan van Corti, zoals beschreven en overnacht gekweekt. De micro-isolaat werd vervolgens in 4% paraformaldehyde en verwerkt voor immunokleuring van myosine 7a die cochleaire haarcellen labels. Let op de afwezigheid van de relatief grotere spiraal limbus uit de figuur 3. Blauwe nucleaire label is DAPI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig5.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig5tmb.jpg" alt="Figuur 5" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 5"></a> Figuur 5. Elektroporatie van DsRed reportergen in de gekweekte orgaan van Corti. Hele organen van Corti van P4 Atoh1-nGFP muis pups werden geïsoleerd, beplaat, en vervolgens geëlektroporeerd met de DsRed reporter-gen, zoals beschreven en vervolgens bekeken onder een microscoop epifluorescerende. Cellen van het orgaan van Corti Explantatie dat de transgene DsRed reporter eiwit uitgedrukt vertonen een rode fluorescentie en endogene cellen van de sensorische epitheel vertonen een groene nucleaire fluorescentie. Transgene cellen kan worden gezien in de spiraal limbus en sensorische epitheel.

<ol><li>Sobkowicz, H. M., Bereman, B., Rose, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+Development+of+the+Organ+of+Corti+in+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurocytology%22%5BJournal%5D)">Organotypic Development of the Organ of Corti in Culture.</a> Journal of Neurocytology. 119 (4), 543-543 (1975).</li>
<li>Zheng, J. L., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Math1+induces+robust+production+of+extra+hair+cells+in+postnatal+rat+inner+ears%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Math1 induces robust production of extra hair cells in postnatal rat inner ears.</a> Nature Neuroscience. 3 (6), 580-580 (2000).</li>
<li>Martinez-Monedero, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((THE+POTENTIAL+ROLE+OF+ENDOGENOUS+STEM+CELLS+IN+REGENERATION+OF+THE+INNER+EAR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">THE POTENTIAL ROLE OF ENDOGENOUS STEM CELLS IN REGENERATION OF THE INNER EAR.</a> J Neurobiol. 66 (4), 319-319 (2006).</li>
<li>Saffer, L. D., Gu, R., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RT-PCR+analysis+of+mRNA+for+growth+factor+receptors+in+damaged+and+control+sensory+epithelia+of+rat+utricles%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">An RT-PCR analysis of mRNA for growth factor receptors in damaged and control sensory epithelia of rat utricles.</a> Hearing Research. 94 (1,2), 14-14 (1996).</li>
<li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+growth+and+differentiation+of+hair+cell+progenitors+from+the+newborn+rat+cochlear+greater+epithelial+ridge%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation, growth and differentiation of hair cell progenitors from the newborn rat cochlear greater epithelial ridge.</a> Journal of Neuroscience Methods. 164 (2), 271-271 (2007).</li>
<li>Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+Differentiation+and+DNA+Binding+%28Ids%29+Regulate+Math1+and+Hair+Cell+Formation+during+the+Development+of+the+Organ+of+Corti%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of Differentiation and DNA Binding (Ids) Regulate Math1 and Hair Cell Formation during the Development of the Organ of Corti.</a> J. Neurosci. 26 (2), 550-550 (2006).</li>
<li>Daniela, B., Josef, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calbindin+and+S100+protein+expression+in+the+developing+inner+ear+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Calbindin and S100 protein expression in the developing inner ear in mice.</a> The Journal of Comparative Neurology. 513 (5), 469-469 (2009).</li>
<li>Helms, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoregulation+and+multiple+enhancers+control+Math1+expression+in+the+developing+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system.</a> Development. 127 (6), 1185-1185 (2000).</li>
<li>Zheng, J. L., Wei-Qiang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Damage+to+Auditory+Neurons+and+Hair+Cells+by+Ototoxins+and+Neuroprotection+by+Specific+Neurotrophins+in+Rat+Cochlear+Organotypic+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Differential Damage to Auditory Neurons and Hair Cells by Ototoxins and Neuroprotection by Specific Neurotrophins in Rat Cochlear Organotypic Cultures.</a> European Journal of Neuroscience. 8 (9), 1897-1897 (1996).</li>
</ol>

Er zijn verschillende details die essentieel zijn voor het succes van deze procedure. Hoe korter de tijd van slaapbeen isolatie tot orgaan van Corti incubatie, hoe groter de kans dat de organen zal hechten aan het dekglaasje en resulteren in levensvatbare orgaan culturen. Daarom is het belangrijk om de hoeveelheid van de termijn tussen de dissectie en het plaatsen van de organen in de couveuse. De keuze van antibiotica is ook van cruciaal belang, omdat veel aminoglycoside-antibiotica zijn ototoxische en zal resulteren in het haar celdood. Hoewel het de voorkeur om het gebruik van antibiotica helemaal af te zien, dit laat de mogelijkheid open voor de verontreiniging. Daarom raden we het gebruik van 10 ug / ml ampicilline als algemene regel om mogelijke besmetting problemen te overwinnen. Het meest lastige aspect van deze, en andere procedures voor de primaire cultuur van het orgaan van Corti, is de neiging van de organen te drijven af ​​van de platen tijdens de incubatie. Hoewel de drijvende orgel culturen kunnen levensvatbaar blijven voor 5-7 dagen, zijn er nadelen van het kweken van drijvende organen. Bijvoorbeeld, drijvende orgel culturen vaak folden op zich na 4-5 dagen rendering microscopie problematisch. Vervolgens kan de structurele integriteit van het orgaan worden aangetast in vergelijking met de organen die zijn aangebracht op het dekglaasje. We hebben gevonden dat de volgende technieken helpen om ervoor te zorgen dat het orgaan van Corti niet zweven in de cultuur media, maar blijft aangebracht op de dekglaasje aan. De eerste, de vacht van de glazen dekglaasjes in 1:1 polyornithine / laminine aangevuld met 20% FBS zoals beschreven. De overnacht incubatie gevraagd in dit protocol is de minimale tijd dat de plaat zou moeten worden bekleed. In ons laboratorium hebben we vaak jas al de platen die we nodig hebben voor een week en houd ze bij 4 ° C tot de dag voorafgaand aan het gebruik als we ze naar de incubator voor een incubatie gedurende de nacht. Ten tweede, na de organen worden getransporteerd naar de gecoate dekglaasjes, oriënteren de explantatie, zodat de cilia van de haarcellen naar boven. Deze oriëntatie zal de hechting van het basilair membraan naar de cultuur schotel. Ten derde, verwijdert u de media in de put aan te brengen de explantatie aan de beklede schaal. Dit zal zorgen voor contact tussen de cultuur schotel en het basilair membraan en vergroten het vermogen van de explantaten zich te houden aan het glas. Dit zal ook helpen bij het handhaven van de structurele integriteit van de rijen van de haarcellen. Ten slotte is zorgvuldig drip twee druppels kweekmedium op het oppervlak van het orgaan van Corti met behulp van een 200 pi capaciteit pipet en dan langzaam de put te vullen door druppelen de resterende volume (van de totaal 130 pi) aan de kant van het dekglaasje. Het is belangrijk om snel te werken aan de bevestiging van het orgaan van Corti, verzekeren het gecoate dekglaasje aan. Uit de inleiding van de dissectie van de incubatie van de explantaten, duurt het normaal gesproken 10 minuten voor een geoefend operator klaar zijn met dit orgaan van Corti isolatie procedure. In dit protocol, presenteren we ook een methode voor de micro-isolatie van de sensorische epitheel van de spiraal limbus van het orgaan van Corti. In deze procedure is de spiraal limbus weg ontleed van de zintuiglijke epitheel met behulp van 28G ½ insuline naalden als dissectie-instrumenten. De resulterende micro-isoleren bestaat uit de rijen van de haarcellen en de bijbehorende ondersteunende cellen (fig 3). De geïsoleerde sensorische epitheel kan dan worden gekweekt, zoals beschreven in dit protocol. Deze micro-isolatie procedure moet worden vergeleken met de enzymatische scheiding van de sensorische epitheel van het omringende weefsel 4. Bij zoogdieren, maar ook niet-zoogdieren, zoals kippen, thermolysine vertering van geïsoleerde vestibulaire organen resulteert in de isolatie van sensorische epitheel van de kelder mesenchymale cellen 4. In de rat slakkenhuis, thermolysine spijsvertering resulteert in de scheiding van de grotere epitheliale nok, in mindere epitheliale nok en bijbehorende sensorische epitheel van de kelder membraan 5. Het is echter onduidelijk of de cochleaire sensorische epitheel kan hechten aan de gecoate platen zonder de bijbehorende mesenchymale cellen. Terwijl zowel de mechanische micro-isolatie-methode en enzymatische vertering methode resulteert in de scheiding van de sensorische epitheel van de spiraal limbus, de voordelen van de micro-isoleren dissectie over de thermolysine spijsvertering zijn een relatief kortere protocol, goedkoper reagentia, en mogelijk minder stress de explantaat als gevolg van enzymatische werking van de spijsvertering. Daarnaast is de basale membraan intact gelaten in deze aanpak, die bevestiging van de sensorische epitheel van de cultuur plaat te verbeteren. Nadelen van deze methode zijn de noodzaak om de vaardigheden te ontwikkelen voor deze delicate dissectie en mogelijke mechanische schade aan de sensorische epitheel als gevolg van de micro-dissectie. Als voorbeeld van het nut van deze procedure, presenteren we ook een voorbeeld van het gebruik van het orgel van deCorti culturen, de elektroporatie van exogene genen in de explantaat cultuur. De elektroporatie hierboven beschreven procedure is gebaseerd op de vorige methoden van orgaan van Corti elektroporatie. Met name Zheng en Gao (2000) beschrijven de elektroporatie van geïsoleerde rat organen van Corti, waar de explantaten op hun plaats gehouden voor elektroporatie door een gevormde groef van agarose en vervolgens uitgeplaat op collageen gecoate 8-goed LabTek slide in serum-vrij medium 2. Een voordeel van hun aanpak is dat de organen zo zijn gericht dat de bovenste oppervlakken van de explantaten de kathode, die theoretisch zou moeten resulteren in een gelijkmatige verdeling van geëlektroporeerde cellen over de explantatie gezicht. In onze handen echter, de methode die we beschrijven verbeterd op deze procedure, omdat het orgaan van Corti bleef aangebracht op de dekglaasje gedurende de procedure waardoor de manipulatie van de explantaat na elektroporatie. Daarnaast bleef een hoger percentage van organen van Corti aan de dekglaasjes het gebruik van deze methode gepresenteerd. Onze methode is afkomstig uit Jones, et al.. (2006), die de toevoeging van de Fugene 6 reagens gebruikt om de efficiëntie van genexpressie toenemen na de elektroporatie. In de Jones et al.. (2006) protocol, zijn de organen geëlektroporeerd, geïncubeerd gedurende 5 minuten met 100 pi van Fugene 6 transfectiereagens, en vergulde 6. Onze methode verschilt in het gebruik van een 3:2 verhouding van Fugene 6 reagens om plasmide DNA, die vonden we empirisch een optimale transgene expressie te bieden met een minimum aan orgaantoxiciteit. Wij gebruiken geen onverdund Fugene 6 reagens, wat kan leiden tot toxiciteit voor de culturen. De elektrode configuratie in ons protocol, evenals Jones et al.. (2006), resulteert in een lagere expressie van genen in zowel de spiraal limbus of zintuiglijke epitheel, afhankelijk van de positie van de kathode. Hoewel er DsRed positieve cellen aan de kant van de cultuur verre naar de kathode, is er een hogere concentratie van de transgene cellen dichter bij de kathode. Om ervoor te zorgen een volledige expressie van het transgen in beide zijden van het orgaan van Corti Explantatie, kan de stroom worden omgekeerd voor een tweede puls trein door simpelweg het omkeren van de leads. De gepresenteerde protocol resulteert in een robuuste expressie van het transgen door het orgaan van Corti (fig. 5).

<table><tbody><tr><td>Glazen microscoopdekglasjes</td><td>DYNALAB Corporation</td><td>2010</td><td>10mm diameter, cirkel #1, 1mm dikte, 1 ounce</td></tr><tr><td>4-ringse celkweekschaal</td><td>Greiner Bio-One</td><td>627170</td><td>Gesteriliseerde 35 X 10 mm celkweekschaal met 4 binnenringen</td></tr><tr><td>Poly-L-ornithine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td>0,01% oplossing</td></tr><tr><td>Laminine</td><td>BD Biosciences</td><td>354232</td><td>geproduceerd in muis</td></tr><tr><td>Foetaal runderserum</td><td>Invitrogen</td><td>26140-095</td><td>Qualified</td></tr><tr><td>Operatieschaar</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-6806</td><td>Recht, scherp-stomp lengte 5&quot;</td></tr><tr><td>#11 Scalpelblad</td><td>BD Biosciences</td><td>372611</td><td></td></tr><tr><td>#4 Dumoxel pincet</td><td>Fine Science Tools</td><td>11241-30</td><td></td></tr><tr><td>#55 Dumostar fijn pincet</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle Medium </td><td>Invitrogen</td><td>10564-011</td><td>Hoge glucose</td></tr><tr><td>Paardenserum</td><td>Invitrogen</td><td>2605088</td><td>Hitte-geïnactiveerd</td></tr><tr><td>Ampicilline natriumzout </td><td>Invitrogen</td><td>11593-027</td><td>Bestraald</td></tr><tr><td>&amp;frac12; cc Lo-Dose insulinespuit </td><td>BD Biosciences</td><td>329465</td><td>U-100 28G&amp;#189;</td></tr><tr><td>Fugene 6 transfectiereagens</td><td>Roche Group</td><td>11-815-091-001</td><td></td></tr><tr><td>Polystyreen reageerbuis</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-956-5A</td><td></td></tr><tr><td>Laminaire flowkast</td><td>The Baker Company (Stanford, ME)</td><td>Model SG603a</td><td>SterileGARD III&lt;br/&gt;Advanced Class II&lt;br/&gt;Biologische veiligheidskast</td></tr><tr><td>Opti-MEM I serumarm medium</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>Reporterplasmid</td><td>Clontech Laboratories</td><td>632539</td><td>pCMV DsRed-Express 2</td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>Bio-Rad</td><td>165&amp;#8211;2662</td><td>BioRad Gene Pulser Xcell</td></tr></tbody></table>

primaire cultuur en plasmide elektroporatie van de muizen orgaan van corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In alle zoogdieren, is de sensorische epitheel voor auditie gelegen langs de spiraalvormige orgaan van Corti, dat zich bevindt binnen de schelp gevormd slakkenhuis van het binnenoor (fig. 1). Haarcellen in het slakkenhuis te ontwikkelen, die de mechanosensorische cellen van het auditieve systeem, zijn afgestemd op een rij binnenste haarcellen en drie (in de basis-en mid-bochten) tot vier (in de apicale beurt) rijen buitenste haarcellen dat overspanning de lengte van het orgaan van Corti. Haarcellen transduceren sound-geïnduceerde mechanische trillingen van het basilair membraan in de neurale impulsen die de hersenen kunnen interpreteren. De meeste gevallen van perceptief gehoorverlies worden veroorzaakt door dood of disfunctie van cochleaire haarcellen. Een steeds belangrijker instrument in auditieve onderzoek is de isolatie en in vitro cultuur van het orgel explantaat 1,2,9. Eenmaal geïsoleerd, kan de explantaten worden gebruikt in verschillende manieren om informatie met betrekking tot normatieve, afwijkend, of therapeutische fysiologie te geven. Genexpressie, stereocilia motiliteit, cel-en moleculaire biologie, evenals biologische benaderingen voor haar celregeneratie zijn voorbeelden van experimentele toepassingen van orgaan van Corti explantaten. Dit protocol beschrijft een methode voor de isolatie en de cultuur van het orgaan van Corti van neonatale muizen. De bijgaande video bevat stapsgewijze aanwijzingen voor de isolatie van het slaapbeen van muis pups, en de daaropvolgende isolatie van de cochlea, spiraal ligament, en orgaan van Corti. Eenmaal geïsoleerd, kan de zintuiglijke epitheel worden uitgeplaat en gekweekt in vitro in zijn geheel, of als een verdere ontleed micro-isolaat dat mist de spiraal limbus en spiraal ganglion neuronen. Met behulp van deze methode kan de primaire explantaten worden gehandhaafd voor 7-10 dagen. Als voorbeeld van het nut van deze procedure, zal orgaan van Corti explanten worden geëlektroporeerd met een exogene DsRed reportergen. Deze methode biedt een verbetering ten opzichte van andere gepubliceerde methoden omdat het reproduceerbaar, eenduidig, en stapsgewijze aanwijzingen voor de isolatie, microdissectie, en primaire cultuur van het orgaan van Corti.

Deze procedure beschrijft een methode voor de isolatie en de cultuur van het muriene orgaan van Corti, met of zonder de spiraal limbus en spiraal ganglion neuronen. We tonen ook aan een methode voor de expressie van een exogeen reportergen in het orgaan van Corti explant door elektroporatie.

Primaire Cultuur en Plasmide Elektroporatie van de muizen orgaan van Corti.

Bij alle zoogdieren bevindt het sensorische epitheel voor het gehoor zich langs het spiraalvormige orgel van Corti, dat is gelegen in de schelpvormige cochlea van de ...

Hallo, ik ben Mark Parker. Welkom in het Eaton Peabody Laboratory van de Massachusetts Eye and Ear Infirmary in Boston, Massachusetts. Vandaag presenteren we een protocol voor de isolatie en primaire kweek van het mariene orgaan van kti.Dit protocol is fundamenteel in ons werk omdat het de in vitro analyse mogelijk maakt van het orgaan dat essentieel is voor het gehoor. Om het nut van deze aanpak te benadrukken, demonstreren we ook een van de vele toepassingen van de organen in ons laboratorium: de elektroporatie van exogene genen in de gekweekte explantaten. Laten we aan de slag gaan.De opzet van deze procedure is als volgt: pasgeboren muizen worden gedecapiteerd en hun slaapbeenderen worden met behulp van botte dissectie verwijderd. Vervolgens wordt de cochlea met behulp van botte dissectie uit het slaapbeen geïsoleerd. Het benige labyrint van de cochlea wordt daarna met een pincet geopend en het spiraalband wordt uit de modiolus van de cochlea verwijderd.Ten slotte wordt het spiraalbandje met een pincet gescheiden van het Corti-orgaan; doorschijnende rozetten van haarcellen zijn zichtbaar langs de gehele lengte van het Corti-orgaan. Een deel van het membraan van de Reissner-membraan, dat tijdens het verwijderen van het spiraalbandje is gescheurd, is zichtbaar langs de modulaire zijde. Als voorbeeld van het nut van deze procedure worden explantaten van het Corti-orgaan gedurende 24 uur gekweekt en vervolgens geëlectroporeerd met een exogeen fluorescent reportergen.De eerste stappen van deze procedure omvatten het voorbereiden van de kweekplaten. Plaats een gesteriliseerd glazen dekglas dat in 70%ethanol is bewaard in twee putjes van een vooraf gesteriliseerde vierringse celkweekschaal. Door slechts twee van de vier putjes te gebruiken, wordt de tijd dat de kweken buiten de incubatorkist zijn beperkt.De dekglasjes met de oplossing bestaande uit poly-L-ornithine en laminine in een verhouding van één-op-één, aangevuld met 20% foetaal runderserum, werden in de kweekschaal geplaatst. Deze kweekschaal werd vervolgens in een grotere schaal van 10 centimeter geplaatst om het transport te vergemakkelijken en daarna gedurende de nacht geïncubeerd bij 37 °C. Tot slot werden de dissectie-instrumenten hittegesteriliseerd in een incubator bij 150 °C gedurende de nacht.Steriliseer de dissectiekap met positieve luchtstroom door het UV-licht 20 minuten voor aanvang van de dissectie in te schakelen. Steriliseer de werkruimte in de dissectiekap door alle oppervlakken te bespuiten met 70% ethanol. Plaats de kop van een gedecapiteerde muizenwelp in een Petrischaal met 70% ethanol en verwijder vervolgens de epidermis met een scalpelblad.Open de schedel langs de sagittale naad met een scalpelblad en verdeel vervolgens de voorhersenen. Bewaar de voorhersenen voor verdere dissectie. Verwijder de voorhersenen, het cerebellum en de hersenstam middels botte dissectie.Noteer de locatie van het parametaalvormige slaapbeen aan de inferolaterale zijde van het schedeldak. Breng de TAL-botten over naar een schaal van drie millimeter die steriele hanks balanced salt solution bevat. De resterende dissectie dient te worden uitgevoerd onder een dissectiemicroscoop.Verwijder al het omliggende weefsel van het slaapbeen. Lokaliseer de schelpvormige cochlea en verwijder deze met een pincet uit het vestibulaire systeem. In dit ontwikkelingsstadium is het benige labyrint nog niet volledig verkalkt en is het gemakkelijk te dissekeren.Verwijder het benige labyrint van de cochlea door zorgvuldige separatie, beginnend bij het basale uiteinde en bewegend in apicale richting. Gebruik een pincet om het spiraalligament en het daaraan gehechte sensorische epitheel voorzichtig van de modius te verwijderen door dit met een pincet vast te zetten bij de haakregio van de basis en het vervolgens af te wikkelen. Verwijder, beginnend bij de basis en bewegend naar apicaal, het spiraalligament van het sensorische epitheel met een fijn pincet nummer 55.In sommige van onze experimenten is het wenselijk om de spiraalvormige limbus van het sensorisch epitheel te verwijderen. In deze procedure voor micro-isolatie wordt het Corti-orgaan gescheiden van de spiraalvormige limbus met behulp van twee insulinespuiten van een halve cc als pincetten. Eerst wordt het haakvormige gebied van het Corti-orgaan verwijderd met de insulinespuiten.Vervolgens wordt de spiraallimbus gescheiden van de rij binnenste haarcellen, beginnend bij de apex en basaal voortgaand, waarbij ofwel het gehele Corti-orgaan met de aangehechte spiraallimbus wordt meegenomen. Het micro-geïsoleerde sensorische epitheel of de micro-geïsoleerde spiraallimbus kan als volgt worden gekweekt: verwijder de coatingoplossing uit de kweekwells en vervang deze door 130 µL kweekmedium met 10% serumtransfer; plaats het gedissecteerde Corti-orgaan op het gecoate glazen dekglas in de kweekwell. Wij hebben vastgesteld dat de volgende technieken helpen te waarborgen dat het Corti-orgaan niet in het kweekmedium blijft drijven, maar gefixeerd blijft aan het dekglas.Ten eerste worden de glazen dekglasjes verschoven zoals beschreven. Ten tweede wordt het medium verwijderd om het explantaat aan de gecoate schaal te bevestigen. Dit waarborgt het contact tussen de kweekschaal en het X-explantaat.Ten derde, oriënteer het explantaat zodanig dat de cilia van de haarcellen naar boven wijzen. Deze oriëntatie vergemakkelijkt de hechting van het explantaat aan de kweekschaal. Voeg tot slot 130 µL serumrijk kweekmedium toe met een 200 µL pipette door voorzichtig twee druppels op het oppervlak van het orgaan te laten vallen, en vervolgens het resterende volume langzaam langs de wand van de put te toevoegen. Verplaats het explantaat voorzichtig naar een incubator en incubeer dit bij 37 °C in de aanwezigheid van 5% CO2.Deze culturen kunnen zeven tot 10 dagen worden onderhouden. Er zijn talrijke toepassingen voor het geïsoleerde organ van Corti. Enkele voorbeelden zijn de analyse van genexpressie met behulp van R-T-P-C-R of NC twee hybridisatie, organ van Corti-culturen met spiraalganglioncellen of exogene stamcellen, of de in vitro analyse van haarceldood. Om het nut van deze procedure aan te tonen, laten we u een techniek zien die in ons laboratorium veelvuldig wordt gebruikt om exogene genen tot expressie te brengen in de explantaatculturen.Voor deze demonstratie zal het geïsoleerde orgaan van Corti geëlectroporeerd worden met een expressievector die constitutief het DS red reportergen tot expressie brengt. Na electroporatie worden de culturen 24 uur geincubeerd met een few gene six transfectiereagens om de transfectieprocedure te verbeteren. Met dit systeem zullen de getransfecteerde cellen binnen 24 uur een cytoplasmatische rode fluorescentie vertonen.Bereid eerst een verhouding van drie op twee FU gene six transfectiereagens ten opzichte van het doel-DNA voor in een polychlooretheen reageerbuis met ronde bodem van 3 mL. Verwijder in een laminaire flowkast het kweekmedium uit het horticultuur-orgaan. Voeg 130 µL water toe gedurende één minuut en verwijder dit vervolgens met een pipet met een capaciteit van 200 µL.Voeg vervolgens 30 µL van het DS red reporter-plasmide toe, dat bewaard wordt in een voorraadoplossing van 2 mg plasmide-DNA per mL water. Voor elektroporatie gebruiken we een BioRad gene Pulser Excel om de elektrische puls op te wekken. De elektroden zijn door onze werkplaats op maat gemaakt voor onze doeleinden; de elektroden bestaan uit blanke draad die in een hoek van 90 graden is gebogen en is geperst tot een peddelvorm.Beweeg de elektroden van de elektroporator met een micromanipulator zodanig dat de anode en kathode zich aan weerszijden van de cultuur bevinden. Genereer 10 pulstreinen van 27 volt met een duur van 30 milliseconden om het reportergen in de organ-explantcultuur te elektroporeren. Wacht vervolgens vijf minuten.Voeg vervolgens 130 µL van de FU gene six DNA-oplossing toe aan de explant en incubeer deze vervolgens gedurende de nacht bij 37 °C in de aanwezigheid van 5% CO2. Voeg de volgende dag twee milliliter serum toe aan het kweekmedium van elke plaat. De explantculturen kunnen na 24 uur gedurende zes of meer dagen worden onderhouden.Getransfecteerde cellen kunnen worden bekeken met een SI drie-filter op een epifluorescentiemicroscoop. We hebben zojuist een methode gedemonstreerd voor de isolatie en primaire kweek van het organ van Corti. Deze methode werkt bij muizen vanaf embryonale dag 16 tot aan de postnatale dag, het punt waarop de cochlea voldoende is verkalkt waardoor de dissectie moeizaam wordt.Daarnaast hebben we een methode gedemonstreerd voor de expressie van exogene genen in het gekweekte orgaan van corde. Dit is een voorbeeld van een type experiment dat kan worden uitgevoerd op het gekweekte explantaat. Er zijn ongetwijfeld talloze toepassingen voor deze techniek.Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

primary-culture-plasmid-electroporation-murine-organ

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze procedure wordt beschreven hoe de primaire hematopoietische celculturen te zetten vanaf knaagdier beenmerg en wordt gevolgd door transfectie met de Gene Puiser MXCell elektroporatie systeem.

De vervaardiging van primaire hematopoietische cellen culturen uit Murine Bone Marrow voor Elektroporatie

Dit protocol beschrijft de stappen die nodig zijn om te ontleden, transfecteren via elektroporatie en cultuur muis hippocampus en corticale neuronen. Op korte termijn culturen kan worden gebruikt voor studies van axon uitgroei en begeleiding, terwijl de lange-termijn culturen kunnen worden gebruikt voor onderzoek naar synaptogenese en dendritische rug analyse.

Nucleofection en Primaire Cultuur van de embryonale Mouse hippocampus en de corticale neuronen

This video describes the electroporation protocol for transfecting large plasmids into three-dimensional gastrointestinal organoids to prove its universal functionality in different entities, namely pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC), colorectal cancer (CRC), cholangiocarcinoma (CCC), and gastric cancer (GC) organoids.

Organoid Electroporation: A Method to Transfect Plasmid DNA into Gastrointestinal Organoids

Source: Keener, D. G., et al. Single-Cell Electroporation across Different Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Excitatory and Class-Specific Inhibitory Neurons. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates the process of single-cell electroporation to introduce plasmid DNA into neurons within mouse hippocampal slice cultures. The procedure involves precise pipette positioning, pressure adjustments, and electroporation pulses to transiently permeabilize the neuronal membrane,...

Gene Expression via Single-Cell Electroporation in Mouse Hippocampal Slice Cultures

This video demonstrates the protocol for single-cell electroporation of genes in both excitatory and inhibitory neurons across a range of in vitro hippocampal slice cultures. The technique is useful to examine specific molecular and physiological functions of neurons, including cell autonomous mechanisms and transsynaptic protein interactions.

Single Cell Electroporation in Organotypic Brain Slice Cultures: An In Vitro Technique to Deliver Plasmids Inside Targeted Neurons in Brain Hippocampal Slices

We presenteren een methode die de isolatie en kweek van cochleaire explantaten van het binnenoor van embryonale muizen beschrijft. We demonstreren ook een methode voor genoverdracht naar cochleaire explantaten via vierkantgolfelektroporatie. De in vitro explantaatkweek gekoppeld aan de genoverdrachtstechniek stelt onderzoekers in staat om de effecten van het veranderen van genexpressie tijdens de ontwikkeling te bestuderen.

Cultuur van embryonale Mouse Cochlear Explantaten en Gene Transfer door elektroporatie

Hier presenteren we een protocol, ontworpen om gebruik te maken van chemogenetische hulpmiddelen om de activiteit van corticale Interneuron voorlopercellen getransplanteerd in de cortex van vroege postnatale muizen te manipuleren.

Transplantatie van Chemogenetisch gemanipuleerde corticale Interneuron progenitors in vroege postnatale Muizenhersenen

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor eencellige elektroporatie dat genen kan leveren in zowel excitatory als remmende neuronen in een reeks in vitro hippocampale slice-cultuurleeftijden. Onze aanpak zorgt voor een nauwkeurige en efficiënte expressie van genen in individuele cellen, die kunnen worden gebruikt om cel-autonome en intercellulaire functies te onderzoeken.

Eencellige elektroporatie over verschillende organotypische slicecultuur van hippocampale excitatory en klassespecifieke remmende neuronen

Het kuiken is een kosteneffectief, toegankelijk en algemeen beschikbaar modelorganisme voor verschillende onderzoeken. Hier wordt een reeks protocollen beschreven om de moleculaire mechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling en regeneratie van het aviaire binnenoor.

In Ovo en Ex Ovo methoden om aviaire binnenoorontwikkeling te bestuderen

Het huidige protocol is een update van eerdere protocollen en bevat relatief eenvoudige benaderingen voor het kweken van hoogwaardige cochleaire explantaten. Dit zorgt voor betrouwbare data-acquisitie en beeldvorming met hoge resolutie in levende en vaste cellen. Dit protocol ondersteunt de voortdurende trend om binnenoorcellen te bestuderen.

Volledige neonatale cochleaire explantaten als een in vitro model

Hier presenteren we de acute genetische manipulatie van gesneden menselijke corticale organoïden door elektroporatie. Deze corticale organoïdemodellen zijn bijzonder vatbaar voor injectie, aangezien ventrikelachtige structuren gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd na het snijden, waardoor functioneel onderzoek naar de ontwikkeling van de menselijke corticale ontwikkeling, neurologische ontwikkelingsstoornissen en corticale evolutie mogelijk is.

Elektroporatie van gesneden menselijke corticale organoïden voor onderzoek naar de genfunctie

Leer de primaire cultuur en elektroporatie van het orgaan van Corti bij muizen voor auditief onderzoek. Deze methode maakt genexpressie-analyse en in vitro-studie van haarcelbiologie mogelijk.

Primaire Cultuur en Plasmide Elektroporatie van de muizen orgaan van Corti.

Meer video's verkennen