Name: Magnetische Resonantie Spectroscopie van leven Drosophila melanogaster Met behulp van Magic Angle Spinning (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-15T16:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Leer hoe je HRMAS 1H-MRS toepast voor moleculaire karakterisering van levende Drosophila melanogaster. Deze niet-invasieve techniek biedt gedetailleerde inzichten in metabolische processen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd mede ondersteund door een National Institutes of Health (NIH) te verlenen aan AI063433 Laurence G. Rahme, een Nationaal Instituut Institutes of Health (NIH) Center Grant (P50GM021700) naar Ronald G. Tompkins (A. Aria Tzika, directeur van de NMR-core), en een Shriner&#39;s Hospital for Children onderzoek subsidie ​​(# 8893) aan A. Aria Tzika. Wij danken Dionyssios Mintzopoulos Ph.D. voor hulp in de beginfase van de ontwikkeling van dit protocol en Ovidiu C. Andronesi Ph.D. voor hulp bij de TOBSY pulssequentie.

Deel 1: Voorbereiding Drosophila voor HRMAS metingen <ol><li> Met behulp van standaard flylab procedures 1, het verzamelen van nieuwe eclosing vliegt voor 3 dagen en overbrengen naar flacons met verse vliegen eten vliegen. Incubeer de verzamelde vliegt gedurende 5 dagen, zodat de vliegen zal worden 5-8 dagen oud vlak voor het experiment. Slechts een geslacht (meestal mannen) wordt gebruikt voor experimenten. </li><li> Gebruik gezonde, intacte wild type vliegt om te vergelijken met de behandelde bijvoorbeeld getraumatiseerd of genetisch veranderde vliegt 1. </li><li> Plaats single vliegt in 2 ml buisjes met daarin een stuk (~ 0,2 ml) van de vlieg voedsel 24 uur voorafgaand aan het experiment. Deze buizen zijn voorzien van een gat in de buis cup gemaakt met behulp van een vlam verwarmd insuline naald. </li><li> Weeg onmiddellijk de buizen voor en na de vlieg inbrengen met behulp van een hoge precisie balans en om elk vliegt het gewicht door het aftrekken van de eerste waarde van de laatstgenoemde. Een enkele mannelijke vlieg weegt meestal 0,7-1 mg. </li></ol> Deel 2: HRMAS Rotor voorbereiding. <ol><li> Plaats een enkele buis op ijs voor minder dan een minuut aan het vliegen binnen verdoven. </li><li> Leg de vlieg op een laag aluminiumfolie op ijs geplaatst en duw de vlieg in de halfronde holle ruimte van de NMR rotor te voegen met een zachte borstel om te voltooien vliegen plaatsing te zorgen terwijl het vermijden van vliegen letsel. </li><li> Plaats het in te voegen in het zirkonium oxide (ZrO 2) rotorbuis (4 mm diameter, 50 ul) om de vliegen tussen de rotor te voegen en de onderkant van de rotor (zie figuur 1) te vinden. </li><li> Sluit de insert met een schroef en bedek het met parafilm (zie figuur 1) om het contact te voorkomen tussen de vliegen en de TSP standaard-oplossing (TSP: trimethylsilyl-propionzuur-2 ,2,3,3-d4 zuur, Mw = 172, δ = 0,00 ppm, 50 mM in gedeutereerd water-D 2 O, die fungeren als een referentie voor zowel de resonantie chemische verschuiving en kwantificatie). </li><li> Voeg 8 ul van TSP standaardoplossing op de top van de rotor in te voegen. (Zie figuur 1). </li><li> Veilig en draai het geheel in de rotoren met een top kapje (zie figuur 1). </li></ol> Deel 3: HRMAS Data Acquisition <ol><li> Breng de rotor in de HRMAS sonde en plaats deze op de magische hoek van 54,7 ° (zie figuur 1). </li><li> Ingestelde temperatuur op 4 ° C door een BTO-2000 unit in combinatie met de MAS pneumatische unit. Vliegen zijn bewaard bij 4 ° C, terwijl in de spectrometer om de anesthesie te onderhouden. </li><li> Stel de HRMAS 1 H MRS spinning snelheid 2 kHz MAS. </li><li> Het stabiliseren van de MAS rotatie frequentie op 2,0 ± 0.001 kHz door een MAS snelheidsregelaar (Rotation frequentie). </li><li> Voor magneet voorbereiding: afstemmen en overeenkomen met de spoel voor optimale prestaties en vulplaatje de magneet voor optimale kwaliteit van de spectra. </li><li> Verwerven eendimensionale een H spectra met behulp van rotor gesynchroniseerde Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) spin-echo pulssequentie 2, [90 ° - (τ-180 ° - τ) n-acquisitie], dat als een T 2-filter werkt aan Verwijder de spectrale verbreding 1 H NMR single-fly spectra een-dimensionale gegevens verkregen over alle monsters. Synchroniseer de inter-puls vertraging (τ = 500μs) om de MAS rotatie frequentie (2 kHz). Stel het aantal passanten op 256 met 32.768 (32k) data punten. Acquisitie tijd 9 min. </li><li> Acquire tweedimensionale (2D) een H-1 H NMR HRMAS single-fly spectra van alle monsters met behulp van een TOBSY sequentie met adiabatische pulsen 3. Acquisitie parameters zijn: 2k datapunten direct dimensie (11 ppm spectrale breedte), een s water pre-verzadiging tijdens de ontspanning vertraging, 8 scans per increment, 128 stappen, totaal herhaling 2 s tijd, 45 ms mengtijd, en een totale overname tijd van 29 minuten. </li></ol> Deel 4: Data Processing / Analyse <ol><li> Analyseer de MRspectra van monsters met behulp van MestReC software (Mestrelab Research, www.mestrec.com) </li><li> Gebruik een line-verbreding apodization functie van de 0,5 Hz en gelden voor alle HRMAS een H FID voorafgaand aan de Fourier transformatie. </li><li> Verwijzen naar de MR spectra met betrekking tot de TSP bij δ = 0,0 ppm (externe standaard). </li><li> Fase spectra handmatig toe te passen en een Whittaker baseline schatter en de brede onderdelen van de baseline af te trekken voorafgaand aan de piekoppervlak berekeningen. </li><li> Schatting piek gebieden met behulp van MestReC software. Schaal piekhoogten met betrekking tot de TSP voor elke verworven spectrum (TSP piekhoogte = 1). Gebruik t-tests (tweezijdig, p &lt;0,05) naar binnen-groep te vergelijken met tussen-groepen ratio's. </li><li> 2D TOBSY procesparameters zijn: QSINE = 2 window functie in beide dimensies, FT met 2k punten in de directe dimensie en nul-vulling 1k in de tweede dimensie, fase correctie in beide richtingen en de baseline-correctie in de tweede dimensie. </li><li> Maak de 2D-spectra met behulp van het programma (Sparky TD Goddard en DG Kneller, SPARKY 3, USCF, <a href="http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/">http://www.cgl.ucsf.edu/</a>home / sparky /) </li></ol> Deel 5: Vertegenwoordiger Spectra van Live Drosophila melanogaster Flies De hierboven beschreven procedures toe te reproduceerbaar spectra te verzamelen van levende Drosophila melanogaster vliegen. Figuren 2 en 3 tonen vertegenwoordiger MR spectra verworven in wild-type (WT) Oregon-R vliegen. Figuur 2 geeft een 1D H HRMAS CPMG spectra. Belangrijkste lipide componenten [C H 3 (0.89 ppm), (C H 2) n (1.33 ppm), C H 2 C-CO (1.58ppm), C H 2 C = C (2,02 ppm), C H 2 C = O (2,24 ppm), C = C H H (5,33 ppm)], glycerol (1,3-C H 4,10 ppm en 4,30 ppm; 2-CH 2 5.24 ppm), en kleine metabolieten: β-alanine (β-Ala werden 2,57 ppm), acetaat (Ac, 1,97 ppm), fosfocholine (PC, 3,22 ppm) en phophoetanolamine (PE, 3.23ppm) ontdekt en ingedeeld in overeenstemming met eerdere rapporten 4, 5. Signalen op 2,02 ppm werden ingedeeld in methyleen protonen van de C H2-CH = CH-groep van mono-onverzadigde vetzuren (dat wil zeggen palmitoleic). De onverzadigde vetzuren werden geïdentificeerd door een signaal bij 5,33 ppm geproduceerd door protonen van de-CH = CH-groep. Kleine metabolieten die niet konden worden toegewezen of werden niet zichtbaar met behulp van de 1D spectrum werden gedetecteerd met behulp van 2D-1 H-1 H TOBSY HRMAS (zie figuur 3). <img src="/files/ftp_upload/1710/1710fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Experimentele opzet van in vivo HRMAS 1H MRS voor het onderzoek van levende Drosophila op 14,1 T. Externe standaard trimethylsilyl-propionzuur-2 ,2,3,3-d4 zuur in gedeutereerd water (TSP / D 2 O). Op het plein: rotor positie op de magische hoek in HRMAS sonde. <img src="/files/ftp_upload/1710/1710fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. In vivo 1D HRMAS een H CPMG spectra van een live-Drosophila melanogaster gew vliegen. Lipide componenten: C H 3 (0.89 ppm), (C H 2) n (1.33 ppm), C H 2 C-CO (1.58ppm), Acetaat (Ac), C H 2 C = C (2,02 ppm), C H 2 C = O (2,24 ppm), β-alanine (β-Ala), fosfocholine (PC) en phophoetanolamine (PE), Glycerol (1,3-C H 4,10, 4,30 ppm; 2-C H 2 5.22 ppm) , C = C H H (5,33 ppm). <img src="/files/ftp_upload/1710/1710fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. In vivo 2D 1H-1H TOBSY HRMAS spectrum van een live-Drosophila melanogaster wt vliegen op 14,1 T. Kleine metabolieten en lipide componenten werden geïdentificeerd. Metabolieten: alanine (Ala), β-alanine (β-Ala), arginine (Arg), glutamine (Gin), glutamaat (Glu), PC fosfocholine (PC), phophoetanolamine (PE), Taurine (Tau), α-glucose (α-GLC) en glycerol. Lipiden componenten: C H 3 (0.89 ppm), (C H 2) n (1.33 ppm), C H 2 C-CO (1,58 ppm), C H 2 C = C (2,02 ppm), C H 2 C = O (2,24 ppm), C = C H H (5,33 ppm).

<ol><li>Apidianakis, Y., Rahme, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+as+a+model+host+for+studying+Pseudomonas+aeruginosa+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster as a model host for studying Pseudomonas aeruginosa infection.</a> Nat Protoc. 4, 1285-1294 (2009).</li>
<li>Meiboom, S., Gill, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+spin-echo+method+for+measuring+nuclear+relaxation+time%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Sci+Instrum%22%5BJournal%5D)">Modified spin-echo method for measuring nuclear relaxation time.</a> Rev Sci Instrum. 29, 688-691 (1958).</li>
<li>Andronesi, O. C., Mintzopoulos, D., Struppe, J., Black, P. M., Tzika, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-state+NMR+adiabatic+TOBSY+sequences+provide+enhanced+sensitivity+for+multidimensional+high-resolution+magic-angle-spinning+1H+MR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Magn+Reson%22%5BJournal%5D)">Solid-state NMR adiabatic TOBSY sequences provide enhanced sensitivity for multidimensional high-resolution magic-angle-spinning 1H MR spectroscopy.</a> J Magn Reson. 193, 251-258 (2008).</li>
<li>Astrakas, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton+NMR+spectroscopy+shows+lipids+accumulate+in+skeletal+muscle+in+response+to+burn+trauma-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">Proton NMR spectroscopy shows lipids accumulate in skeletal muscle in response to burn trauma-induced apoptosis.</a> Faseb J. 19, 1431-1440 (2005).</li>
<li>Fan, T. W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolite+profiling+by+one-+and+two+dimensional+NMR+analysis+of+complex+mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Nuc+Magn+Reson+Spec%22%5BJournal%5D)">Metabolite profiling by one- and two dimensional NMR analysis of complex mixtures.</a> Prog Nuc Magn Reson Spec. 28, 161-219 (1996).</li>
<li>Null, B., Liu, C. W., Hedehus, M., Conolly, S., Davis, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution%2C+in+vivo+magnetic+resonance+imaging+of+Drosophila+at+18.8+Tesla%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High-resolution, in vivo magnetic resonance imaging of Drosophila at 18.8 Tesla.</a> PLoS One. 3, e2817-e2817 (2008).</li>
<li>Zektzer, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+signal+to+noise+in+high-resolution+magic+angle+spinning+total+correlation+spectroscopy+studies+of+prostate+tissues+using+rotor-synchronized+adiabatic+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Magn+Reson+Med%22%5BJournal%5D)">Improved signal to noise in high-resolution magic angle spinning total correlation spectroscopy studies of prostate tissues using rotor-synchronized adiabatic pulses.</a> Magn Reson Med. 53, 41-48 (2005).</li>
</ol>

Experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door het Massachusetts General Hospital Institutional Animal Research Review Board Committee in te stellen.

Met uitzondering van het recente verslag van de haalbaarheid van in vivo MRI in fruitvliegen 6, hebben in vivo MRS studies in Drosophila nog niet gemeld. In het huidige protocol beschrijven we de implementatie van een nieuw in-vivo-HRMAS 1 H-MRS aanpak voor de detectie van biologisch belangrijke moleculen. Concreet hebben we ontdekt lipiden en kleine metabolieten in levende Drosophila vliegt op 14,1 T in ongeveer 45 min, wat voldoende overname de tijd he...

<table><tbody><tr><td>Deuteriumoxide</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7789-20-0</td><td></td></tr><tr><td>3-(trimethylsilyl)propionzuur-2,2,3,3-d&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; zuur</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>24493-21-8</td><td></td></tr><tr><td>agar, sucrose, gist, maïsmeel</td><td>Voeding</td><td>Genesee Scientific</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.flystuff.com/&quot;&gt;http://www.flystuff.com/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Oregon RS- of Canton-S-vliegen</td><td>Volwassen vliegenlijnen</td><td>Bloomington Stock Center</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://flystocks.bio.indiana.edu/&quot;&gt;http://flystocks.bio.indiana.edu/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Schilderkwast</td><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td>(grootte 0)</td></tr><tr><td>buisjes van 2 ml</td><td>Apparatuur</td><td>Fisher Scientific</td><td>K749521-1590</td><td></td></tr><tr><td>Vliegenincubators</td><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td>hoge luchtvochtigheid (60-75%), instelbare temperatuur en een licht-donkercyclus van 12 u:12 u.</td></tr><tr><td>Bruker Bio-Spin Avance NMR-spectrometer (600,13 MHz) 4 mm triple resonance (&lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt;H, &lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C, &lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;H) HRMAS-sonde </td><td>Apparatuur</td><td>Bruker Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BTO-2000 unit in combinatie met een MAS-pneumatische unit</td><td>Apparatuur</td><td>Bruker Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 mm zirkoniumoxiderotor (capaciteit 50 ul)</td><td>Apparatuur</td><td>Bruker Corporation</td><td>B3829 (Bruker store)</td><td></td></tr><tr><td>MestReC (Mestrelab Research) </td><td>Software</td><td></td><td></td><td>Analyse van 1D NMR-spectra&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://mestrelab.com/&quot;&gt;http://mestrelab.com/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>SPARKY 3, USCF</td><td>Software</td><td></td><td></td><td>Analyse van 2D-NMR-spectra&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/&quot;&gt;http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

magnetische resonantie spectroscopie van leven drosophila melanogaster met behulp van magic angle spinning

Magnetic Resonance Spectroscopy of live Drosophila melanogaster using Magic Angle Spinning

High-Resolution Magic Angle Spinning (HRMAS) proton magnetische resonantie spectroscopie (<sup&gt; 1</sup&gt; H-MRS) is een nieuwe niet-destructieve techniek die spectraallijn-breedtes verbetert en maakt een hoge resolutie spectra te worden verkregen uit extracten, intacte cellen, celculturen, en nog belangrijker intact weefsel om te onderzoeken relaties tussen metabolieten en cellulaire processen.<em&gt; In vivo</em&gt; HRMAS<sup&gt; 1</sup&gt; H-MRS studies moeten nog worden gemeld in de live-fruitvlieg<em&gt; Drosophila melanogaster.</em&gt;<em&gt; Drosophila,</em&gt; Als een eenvoudiger genetische organisme, maakt het mogelijk meerdere biologische functies en verschillende evolutionair geconserveerd signaalwegen te worden onderzocht op het hele organisme-niveau en het is een bruikbaar model voor het onderzoeken van genetica en fysiologie. Daartoe hebben we ontwikkeld en geïmplementeerd een<em&gt; In vivo</em&gt; HRMAS<sup&gt; 1</sup&gt; H-MRS methode om te onderzoeken wonen<em&gt; Drosophila</em&gt; Op 14,1 T. Hier schetsen we een HRMAS<sup&gt; 1</sup&gt; H-MRS protocol voor de moleculaire karakterisering van<em&gt; Drosophila</em&gt; Met een conventionele MR spectrometer uitgerust met een HRMAS sonde. Deze techniek is een roman,<em&gt; In vivo,</em&gt; Niet-destructief<em&gt; Drosophila</em&gt; Metaboliet meting aanpak, die de identificatie van biomarkers kunnen de ziekte en zo kan bijdragen tot nieuwe therapeutische ontwikkeling.

Deze techniek maakt het gebruik van hoge-resolutie magic angle spinning proton MR spectroscopie (HRMAS 1H-MRS) voor de moleculaire karakterisering van levende<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Met een conventionele 14,1 tesla spectrometer uitgerust met een HRMAS sonde.

Magnetische Resonantie Spectroscopie van leven Drosophila melanogaster Met behulp van Magic Angle Spinning

High-Resolution Magic Angle Spinning (HRMAS) proton magnetische resonantiespectroscopie (1H-MRS) is een innovatieve, niet-destructieve techniek die de spectrale ...

24 uur vóór het experiment wordt een mannelijke vlieg in een buisje van twee milliliter geplaatst. Na een korte anesthesie met ijskoud gas wordt de vlieg in de NMR-rotorinsert geduwd en vervolgens in de rotorbuis geplaatst. Er wordt TSP-standaardoplossing bovenop de rotorinsert toegevoegd, waarna de rotors met een bovenkap worden gesloten.De rotor wordt in de H-R-M-A-S-probe geplaatst en gepositioneerd onder de magische hoek van 54,7 graden. De spectrometer wordt ingesteld voor het uitvoeren van één- en tweedimensionale experimenten. Tot slot worden de Mr.Spectra van de monsters geanalyseerd.Ik ben Valeria Rigi van het NMR Surgical Laboratory van de afdeling Chirurgie van het Massachusetts General Hospital en de Harvard Medical School. Hoi, ik ben Y AB van het Laboratory of Molecular Surgery van de afdeling Chirurgie van het Massachusetts General Hospital en de Harvard Medical School. Hallo, ik ben Lawrence Achman, directeur van het Molecular Surgical Laboratory en de afdeling Chirurgie van het Massachusetts General Hospital en de Harvard Medical School.Ik ben Mario Zika, directeur van het NMR Surgical Laboratory bij het Massachusetts Journal Hospital en verbonden aan het Aula Martin Center van de Harvard Medical School. Vandaag laten we u een procedure zien voor de moleculaire karakterisering van grote Melanogaster met behulp van in vivo spin-echo magnetische resonantiespectroscopie. In ons laboratorium gebruiken we deze procedure om in vivo metabolieten te bestuderen om ziektebiomarkers te identificeren die bijdragen aan de ontwikkeling van nieuwe therapieën. Laten we beginnen.Begin de voorbereiding door gedurende drie dagen pas uitgekomen vliegen te verzamelen en breng deze vervolgens over naar vliegflacons met vers vliegvoer. Incubeer de verzamelde vliegen gedurende vijf dagen, zodat ze vlak voor het experiment vijf tot acht dagen oud zijn. Voor onze experimenten gebruiken we uitsluitend mannelijke vliegen.Bereid experimentele buisjes van twee milliliter voor voor de vliegen door met een vlamverhitte insuline-naald een gaatje in de dop van het buisje te maken. Plaats vervolgens 24 uur voor het experiment individuele vliegen in de buisjes die een stukje vliegvoeding bevatten. Gebruik een precisiebalans om de buisjes direct voor en na het plaatsen van de vlieg te wegen en bepaal het gewicht van elke vlieg door de twee waarden van elkaar af te trekken.Een enkele mannelijke vlieg weegt meestal rond de 0,7 tot 1 milligram wanneer de vliegen zijn geprepareerd. Laten we kijken naar de preparatie van de high resolution magic angle spinning of H-R-M-A-S rotor. Om te beginnen.Plaats een enkele buis minder dan een minuut lang op ijs. Om de vlieg binnenin te anesthetiseren, legt u de vlieg op een laag aluminiumfolie die op ijs is geplaatst en gebruikt u een zachte kwast om deze voorzichtig in de halfbolvormige holte van de NMR-insert te duwen. Zorg ervoor dat de vlieg volledig is ingebracht zonder letsel te veroorzaken.Plaats de insert in de zirkoniumoxide-rotorbuis om de vliegen tussen de rotorinsert en de bodem van de rotor te positioneren. Sluit de insert nu met een schroef en dek deze af met parafilm om elk contact tussen de vlieg en de TSP-standaardoplossing te voorkomen, welke dient als referentie voor zowel de chemische shift van de resonantie als voor de kwantificering. Voeg 8 µL TSP-standaardoplossing toe bovenop de rotorinsert, bevestig en draai de gehele rotoropstelling vast met de bovenkap; laten we nu kijken hoe H-R-M-A-S-gegevens worden verzameld.Plaats de rotor in de H-R-M-A-S-probe en positioneer deze in de magische hoek van 54,7 graden. Stel vervolgens de H-R-M-A-S-H one MRS spintoerental in op 2 kHz MAS en gebruik een MAS-snelheidsregelaar om dit te stabiliseren. Stel de temperatuur in op 4 °C met een BTO 2000-unit.In combinatie met de MAS-pneumatische unit. Vliegen worden op vier graden Celsius gehouden terwijl ze zich in de spectrometer bevinden om de anesthesie te handhaven, de magneet voor te bereiden, de spoel af te stemmen en aan te passen voor optimale prestaties en de magneet te shimmen voor een optimale spectrale kwaliteit. Zodra het shimmen is voltooid, wordt de INTERPULSE-vertraging gesynchroniseerd met de MAS-rotatiefrequentie.Stel het aantal transients in op 256 met 32.768 datapunten. Neem een eendimensionaal single-fly spectrum op met behulp van een rotorsynchronisatie-car, Purcell-Meiboom-Gill (PMFG) of CPMG spin-echo pulssequentie. Deze sequentie fungeert als een T₂-filter om spectrale verbreding te verwijderen.Verwerf nu het tweedimensionale spectrum van één enkele vlieg voor alle monsters met behulp van een topsy-sequentie met atic-pulsen. Open de rotor en haal de vlieg eruit. Laten we nu kijken hoe de gegevens geanalyseerd moeten worden.We gebruiken mare-software om de MR-spectra van onze monsters te analyseren. Begin met het gebruik van een lijnverbredingsfunctie van 0.5 hertz en pas deze toe op alle HRM A SH one fis voorafgaand aan de four year-transformatie. Referentieer de MR-spectra ten opzichte van TS P bij delta equals 0.0 parts per million.Faseer het spectrum handmatig en pas een Whitaker baseline-estimator toe om de brede componenten van de basislijn af te trekken voorafgaand aan de berekeningen van de piekruimte. Schat de piekruimtes met mastre-software. Schaal de piekhoogtes ten opzichte van TSP voor elk verkregen spectrum.Laten we nu kijken naar enkele representatieve MRS-resultaten; hier wordt een representatief DH1 H-R-M-A-S-C-P-M-G spectrum getoond dat is verkregen in een well-type Oregon R-vlieg. De belangrijkste lipidcomponenten glycerol en kleine metabolieten zoals bèta-alanine, acetaat, fosfocholine en fosfoethanolamine werden gedetecteerd en toegewezen in overeenstemming met eerdere rapporten. Signalen bij 2,02 parts per million werden toegewezen aan methyleenprotonen van de propaancomponent van mono-onverzadigde vetzuren. De onverzadigde zuren werden geïdentificeerd door een signaal bij 5,33 parts per million, geproduceerd door protonen van de alkeencomponent.Kleine metabolieten die niet konden worden toegewezen of niet zichtbaar waren in het 1D-spectrum werden gedetecteerd met behulp van twee DH one H one top Z-H-R-M-A-S. We hebben u hiermee voor het eerst laten zien hoe u het biochemische profiel van levende drosophila kunt bestuderen met behulp van hoge-resolutie magic angle spinning magnetische resonantiespectroscopie. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om een zachte pincet te gebruiken om de vliegen in te brengen zonder hen te verwonden.Zorg ervoor dat u de schroef niet te strak aandraait om te voorkomen dat het insect wordt beschadigd, en neem niet langer dan een uur lang spectra op, omdat de vliegen mogelijk niet overleven. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experiment.

magnetic-resonance-spectroscopy-live-drosophila-melanogaster-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Drosophila hemocytes verspreiden over het geheel van de zich ontwikkelende embryo. Dit protocol laat zien hoe te monteren en het imago van deze migraties met behulp van embryo's met fluorescent gelabelde hemocytes.

Live-beeldvorming van Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migraties

Dit protocol beschrijft een methode voor micronschaal drie-dimensionale beeldvorming van zuurstofconcentratie in de directe omgeving van levende cellen door electron spin resonantie microscopie.

Electron Spin Resonantie Micro-imaging van Live Species voor zuurstof in kaart brengen

Hier we illustreren hoe enkel molecuul foto-geactiveerde lokalisatie microscopie kan worden uitgevoerd op de motorische zenuw-terminal van een levende Drosophila melanogaster derde instar larve.

In Vivo Single-molecuul volgen bij de Terminal van de presynaptische motorische zenuw Drosophila

Dit protocol beschrijft een methode om vast te leggen van de aflopende elektrische activiteit van het centrale zenuwstelsel van Drosophila melanogaster zodat de kosten-efficiënte en handige testen van farmacologische agenten, genetische mutaties van neurale eiwitten, en/of de rol van onontgonnen fysiologische trajecten.

Elektrofysiologische opname van de activiteit van het centrale zenuwstelsel van derde-Instar Drosophila Melanogaster

Hier presenteren we een protocol voor de visualisatie, detectie, analyse en tracking van endogene mRNA-handel in levende Drosophila melanogaster Eier kamer met behulp van moleculaire bakens, draaiende schijf confocale microscopie en open-source analyse Software.

Visualisering en opvolging van endogene Mrna's in levende Drosophila melanogaster Eier kamers

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor cryogene overdracht van bevroren monsters in de dynamische nucleaire polarisatie (DNP) magic angle spinning (MAS) nucleaire magnetische resonantie (NMR) sonde. Het protocol bevat aanwijzingen voor rotoropslag voorafgaand aan het experiment en aanwijzingen voor levensvatbaarheidsmetingen voor en na het experiment.

Cryogene monster laden in een magische hoek spinnen nucleaire magnetische resonantie spectrometer die cellulaire levensvatbaarheid behoudt

De moleculaire structuren en dynamiek van vaste stoffen, vloeistoffen, gassen en mengsels zijn van cruciaal belang voor verschillende wetenschappelijke gebieden. Hoge temperatuur, hoge druk in situ MAS NMR maakt detectie van de chemische omgeving van bestanddelen in gemengde fase systemen onder strak gecontroleerde chemische omgevingen mogelijk.

Hoge temperatuur en hoge druk in situ magische hoek spinnen nucleaire magnetische resonantie spectroscopie

Hier bieden we een gedetailleerd protocol om live beeldvorming uit te voeren van de asymmetrische deling van germinale stamcellen (GSC's) in de Drosophila ovarium-niche. We gebruiken een transgene lijn die ubiquitair een groen fluorescent eiwit (GFP) tot expressie brengt, een fusie van het spectrosoom-eiwit Par-1.

Uitgebreide live beeldvorming van vrouwelijke Drosophila melanogaster kiembaanstammecellen niches

Magnetic resonance imaging (MRI) is uitgegroeid tot een steeds populairder middel voor de behandeling van het fenotype van genetisch veranderde muizen. Dit artikel illustreert de methoden die nodig zijn om high-throughput fenotypering van genetisch veranderde muizen met behulp van meerdere MRI-muis te bereiken.

Multiple-muis neuroanatomische Magnetic Resonance Imaging

Genetisch gecodeerd optogenetic tools kunnen niet-invasieve manipulatie van specifieke neuronen in...

Optogenetic Stimulatie van Escape Gedrag in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Leer hoe je HRMAS 1H-MRS toepast voor moleculaire karakterisering van levende Drosophila melanogaster. Deze niet-invasieve techniek biedt gedetailleerde inzichten in metabolische processen.

Magnetische Resonantie Spectroscopie van leven Drosophila melanogaster Met behulp van Magic Angle Spinning

Meer video's verkennen