Name: Neutrofielen Extracellulaire Traps: Hoe te genereren en te visualiseren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-24T17:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 17 s
Description: Leer hoe je neutrofiele granulocyten isoleert uit menselijk bloed en stimuleert tot vorming van Neutrofiele Extracellulaire Vallen (NETs). Visualiseer deze structuren met immunofluorescentie en scanning-elektronenmicroscopie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. PMN Isolatie uit menselijk bloed Gebruik ongeveer 24 ml menselijk bloed met EDTA of heparine (10 U / ml) als antistollingsmiddel. <ol><li> Voeg 6 ml Histopaque 1119 naar een 15 ml Falcon buis en zorgvuldig laag 5 à 7 ml bloed op de top. </li><li> Centrifugeer gedurende 20 minuten bij 800 xg zonder remmen. </li><li> Zuig en gooi gelig en helder toplaag en de overdracht lagere roodachtige fase die granulocyten in de frisse Falcon buizen. </li><li> Was cellen door te tanken Falcon buizen met PBS en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 x g. </li><li> In de tussentijd bereiden een 100% Percoll-oplossing door het mengen van 18 ml Percoll met 2 ml 10x PBS. Met 1x PBS bereiden 4 ml oplossingen van 85%, 80%, 75%, 70% en 65% Percoll. </li><li> Bereid twee Falcon buizen met een Percoll gradiënt door gelaagdheid 2 ml van elk procentpunt boven op elkaar in aflopende volgorde. </li><li> Na het centrifugeren de bovenstaande vloeistof, combineren pellets en resuspendeer gesedimenteerd cellen in 4 ml PBS. </li><li> Voorzichtig laag 2 ml van de resuspensie op elk van de gradiënten. </li><li> Centrifugeer gedurende 20 minuten bij 800 xg zonder remmen. </li><li> Na het centrifugeren verwijderd bovenste laag en de meeste van de 65%-laag met PBMC&#39;s en het verzamelen van de resterende witte interfasen tot 85%-laag in de nieuwe Falcon buizen. </li><li> Was cellen door het opvullen van de Falcon buizen met PBS en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 x g. </li><li> Verwijder supernatant en resuspendeer gesedimenteerd cellen (gewoonlijk&gt; 95% zijn PMN) in 2 ml PBS. </li><li> Tellen cellen met behulp van een hemocytometer. </li></ol> 2. Het activeren van PMN&#39;s <ol><li> Bereid een 24-well plaat celkweek door er een steriele 13 mm ronde glazen dekglas (# 1,5) in elk putje </li><li> Seed 2 x 10 5 cellen in 500μl RPMI (met 2% humaan serumalbumine) per goed en voor 1 uur in CO 2 incubator bij 37 ° C. incubeer </li><li> Ondertussen bereiden een 600 nM PMA-oplossing in RPMI en toe te voegen aan cellen 100μl per well. Incubeer van 15 min tot 4 uur in CO 2-incubator bij 37 ° C. </li><li> Fix cellen in 4% (eind concentratie) paraformaldehyde opgelost in PBS. </li></ol> PMA fungeert als een positieve controle en is tot nu toe de meest krachtige agent NET vorming induceren. Als alternatief kunnen andere stimuli of co-teelt met pathogenen worden gebruikt voor NET-inductie. De respectieve status van de NET-vorming kan worden gecontroleerd, terwijl het tijdsverloop verloopt, als extra parallelle monsters worden voorbereid. Als een niet-permeant DNA kleurstof zoals Sytox Green (Invitrogen) wordt toegevoegd aan de niet-vaste cellen, wordt alleen extracellulaire DNA worden gedetecteerd. Sinds de oprichting van de nieuwe NET&#39;s is een of andere manier aangetast in de aanwezigheid van Sytox, voor elk tijdstip een parallel monster moet worden gebruikt. 3. NET detectie door immunokleuring NET&#39;s zijn erg kwetsbaar, zelfs na fixatie en moeten worden gemanipuleerd met grote zorg, omdat anders de meerderheid zal verloren gaan tijdens de voorbereiding. <ol><li> Verwijder voorzichtig glazen dekglaasjes met aangehechte cellen van 24-well plaat cultuur door op te tillen aan de rand met een gebogen naald en grijpen met een fijne pincet. Plaats het deksel glijden ondersteboven op een daling van PBS. Dit kan worden gedaan op een Parafilm blad die een reageerbuis staan. Wassen als dit 3 keer voor vijf minuten. </li><li> Incubeer dekglaasjes op dezelfde manier in een daling van 0,5% Triton X-100 voor een min bij RT aan cellen permeabilize. Was drie keer in PBS gedurende 1 minuut. </li><li> Bereid een vochtige kamer met Parafilm en een natte doek. Leg de dekglaasjes ondersteboven op een daling van blokkerende buffer (5% ezel serum) en gedurende 30 minuten bij 37 ° C. incubeer </li><li> Verdunnen primaire antilichamen, bijvoorbeeld ms anti Histon en rb anti neutrofiel elastase, in het blokkeren van buffer. </li><li> Overdracht direct dekglaasjes in de vochtige kamer van het blokkeren van buffer op een daling van de primaire antilichaam en gedurende 1 uur bij 37 ° C. incubeer </li><li> Was drie keer voor 5 min met PBS. </li><li> Verdunnen secundaire antilichamen, bijvoorbeeld dk anti ms Cy2 en dk anti rb Cy3, in het blokkeren van buffer. </li><li> Overdracht dekglaasjes in de vochtige kamer op een daling van secundaire antilichaam en gedurende 1 uur incuberen bij 37 ° C. </li><li> Was drie keer voor 5 min met PBS. Afhankelijk van uw fluorescentie microscopie opties, vlekken DNA gedurende 5 minuten, ofwel met Hoechst 33342 (1 ug / ml) die UV-excitatie of met Draq5 voor veel rode excitatie nodig en was twee keer met dist. het water. </li><li> Stel een 20μl druppel Mowiol op een glasplaatje en monteer dekglaasjes met cellen op zijn kop. De cellen moeten worden tussen het dekglas en de glijbaan. De daling van Mowiol vormen een dunne laag van homogene dikte als het dekglas is geplaatst op de drop. Normaal gesproken is er geen noodzaak om het monster te drukken. Als u wilt niet-onderdompeling lenzen te gebruiken, het monster is klaar voor inspectie.Voor de microscopische analyse met onderdompeling lenzen, laat het monster drogen ongeveer 1 uur totdat de Mowiol is gestold aan de rand van het monster. </li></ol> 4. Voorbereiden NET voor Scanning Electron Microscopy (SEM) <ol><li> Bericht fix cellen op de glazen dekglaasjes in 24-wells plaat met 2,5% glutaaraldehyde. </li><li> Verwijder de glazen dekglaasjes met cellen van 24-well plaat en cultuur zetten ondersteboven op een druppel water. Wassen als dit 3 keer voor vijf minuten. </li><li> Terug te zetten dekglaasjes in 24-well celkweek plaat met 0,5% OsO4 en incubeer gedurende 30 minuten. </li><li> Verwijder de glazen dekglaasjes met cellen van 24-well plaat en cultuur zetten ondersteboven op een druppel water. Wassen als dit 3 keer voor vijf minuten. </li><li> Terug te zetten dekglaasjes in 24-well celkweek plaat met 1% looizuur en incubeer gedurende 30 minuten. </li><li> Herhaal de stappen 4,2 tot 4,4 </li><li> Ontwateren door middel van de volgende behandeling (5min elk): <ul><li> 30% ethanol </li><li> 50% ethanol </li><li> 70% ethanol </li><li> 80% ethanol </li><li> 90% ethanol </li><li> 100% ethanol </li><li> 100% ethanol </li><li> 100% ethanol </li></ul></li><li> Overdracht dekglaasjes in kritieke punt droger en droge monsters. </li><li> Laag het oppervlak van het monster met 5nm Platin / carbon laag met behulp van dunne laag verdamper </li></ol> 5. Representatieve resultaten: De isolatie methode levert meestal niet gestimuleerde neutrofielen haalbaar met een zuiverheid van meer dan 95%. Wanneer vastgesteld op verschillende tijdstippen na stimulatie, de immunokleuring protocol geeft de volgorde van de morfologische veranderingen tijdens NETosis cel afvlakking, verlies van nucleaire melkklieren, verlies van korrel en kern integriteit die leidt tot een toenemende overlap van de nucleaire (dat wil zeggen histon) en granulaire (dat wil zeggen neutrofiel elastase) kleuring. Dit protocol kan dienen als een startpunt om de specifieke interacties van pathogenen met een aantal neutrofielen te analyseren. Deze interactie kan worden ontleed in meer detail met behulp van de voorbereiding protocol voor Scanning Electron Microscopy. NET Fluorescentie Voorbeeld van gestimuleerde neutrofielen gekleurd voor NET-componenten (blauw = DNA, rood = histon, groen = neutrofiel elastase). De beelden tonen, naast de NET lokalisatie, de nucleaire lokalisatie van DNA en histonen en de korrelige patroon voor neutrofiel elastase. SEM PMA stimulatie Scanning electronen microscoop toont niet gestimuleerd en PMA-gestimuleerde neutrofielen. Na stimulatie, de neutrofielen plat uit en produceren netten. SEM NET en Shigella Hogere resolutie SEM beeld van Shigella bacteriën gevangen in netten.

<ol><li>Brinkmann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303, 1532-1535 Forthcoming.</li>
<li>Urban, C. F., Reichard, U., Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+capture+and+kill+Candida+albicans+yeast+and+hyphal+forms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps capture and kill Candida albicans yeast and hyphal forms.</a> Cell Microbiol. 8, 668-676 (2006).</li>
<li>M, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leishmania+amazonensis+promastigotes+induce+and+are+killed+by+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Leishmania amazonensis promastigotes induce and are killed by neutrophil extracellular traps.</a> PNAS. 106, 6748-6753 (2009).</li>
<li>Buchanan, J. T., Simpson, A. J., Aziz, R. K., Liu, G. Y., Kristian, S. A., Kotb, M., Feramisco, J., Nizet, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNase+expression+allows+the+pathogen+group+A+Streptococcus+to+escape+killing+in+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">DNase expression allows the pathogen group A Streptococcus to escape killing in neutrophil extracellular traps.</a> Curr Biol. 14, 396-400 (2006).</li>
<li>Fuchs, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176, 231-241 (2007).</li>
<li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beneficial+suicide%3A+why+neutrophils+die+to+make+NETs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs.</a> Nat Rev Microbiol. 5, 577-582 (2007).</li>
<li>Aga, E., Katschinski, D. M., van Zandbergen, G., Laufs, H., Hansen, B., Muller, K., Solbach, W., Laskay, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+the+spontaneous+apoptosis+of+neutrophil+granulocytes+by+the+intracellular+parasite+Leishmania+major%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of the spontaneous apoptosis of neutrophil granulocytes by the intracellular parasite Leishmania major.</a> J Immunol. , 169-898 (2002).</li>
</ol>

De verstrekte protocol zal de isolatie van niet-gestimuleerde neutrofielen tot grote zuiverheid, de inductie van NET vorming en de analyse van de morfologische veranderingen tijdens NETosis. Bij het hanteren van de monsters met zorg, dat wil zeggen het wassen barre omstandigheden die zal resulteren in het verlies van de meeste van de los bijgevoegde NET te vermijden, kan het bedrag van de netto formatie onder verschillende omstandigheden stimulatie (duur, stimulus) worden vergeleken. In dit opzicht kan de bijgeleverde protocollen dienen als een startpunt om methoden te ontwikkelen om meer geavanceerde scenario&#39;s te analyseren: neutrofielen / pathogeen interacties, volgorde van stimuli, wisselwerking met andere immuuncellen.

neutrofielen extracellulaire traps: hoe te genereren en te visualiseren

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrofiele granulocyten zijn de meest voorkomende groep van leukocyten in het perifere bloed. Als professionele fagocyten, zij overspoelen bacteriën en intracellulair doden wanneer hun antimicrobiële granules versmelten met het fagosoom. Wij vonden dat neutrofielen een extra manier van het doden van micro-organismen hebben: bij activering, geven ze granule eiwitten en chromatine die samen extracellulaire vezels die zich binden ziekteverwekkers. Deze nieuwe structuren, of neutrofielen extracellulaire Traps (NET), af te breken virulentiefactoren en doodt bacteriën 1, 2 schimmels en parasieten 3. De structurele ruggengraat van NET is DNA, en ze worden snel afgebroken in de aanwezigheid van DNases. Zo, bacteriën uitdrukken DNases zijn meer virulent 4. Met behulp van correlatieve microscopie combinatie van TEM, SEM, immunofluorescentie en live cell imaging technieken, kunnen we zien dat bij stimulatie, de kernen van neutrofielen hun vorm verliezen en de eu-en heterochromatine homogeniseren. Later, de nucleaire envelop en de korrel membranen desintegreren waardoor de menging van NET-componenten. Tot slot worden de netten vrijgegeven als het celmembraan breekt. Dit celdood programma (NETosis) onderscheidt zich van apoptose en necrose en is afhankelijk van de generatie van zuurstofradicalen door NADPH oxidase 5. Neutrofielen extracellulaire vallen zijn overvloedig op plaatsen van een acute ontsteking. NET lijkt een vorm van aangeboren immuunrespons zijn die zich binden micro-organismen, verbreiding ervan te voorkomen, en zorgen voor een hoge lokale concentratie van antimicrobiële stoffen teneinde virulentiefactoren af ​​te breken en zo te doden pathogenen waardoor neutrofielen aan hun antimicrobiële functie te vervullen, zelfs boven hun levensduur. Er is bewijs toe, echter dat NET ook betrokken bij ziekten die variëren van auto-immune syndromen tot onvruchtbaarheid 6. Beschrijven we methoden om neutrofiele granulocyten isoleren uit perifeer menselijk bloed 7 en hen stimuleren om NET te vormen. Ook hebben we onder andere protocollen om de netten te visualiseren in licht-en elektronenmicroscopie.

Neutrofielen extracellulaire Vallen (NET&#39;s) zijn een belangrijk aangeboren immuun mechanisme om pathogene bacteriën, schimmels en parasieten te bestrijden. Hier beschrijven we methoden om neutrofiele granulocyten isoleren uit menselijk bloed en ze te activeren om netten te vormen. We presenteren bereidingstechnieken aan netten in licht-en elektronenmicroscopie te visualiseren.

Neutrofielen Extracellulaire Traps: Hoe te genereren en te visualiseren

Neutrofiele granulocyten vormen de meest talrijke groep leukocyten in het perifere bloed. Als professionele fagocyten omsluiten zij bacteriën en doden deze ...

Neutrofiele extracellulaire traps of nets zijn een onlangs geïdentificeerd mechanisme voor de door neutrofielen gemedieerde klaring van pathogenen door het vrijgeven van een combinatie van cytoplasmatische eiwitten en granulae-eiwitten, evenals chromatine; neutrofielen vormen extracellulaire vezels die pathogenen vangen. In deze video worden granulocyten geïsoleerd uit menselijk volbloed via histopath dichtheidsgradiëntcentrifugatie. Neutrofielen worden uit de granulocyt-preparatie geïsoleerd via een percoll-gradiënt.Na centrifugatie worden de cellen op dekglasplaatjes gezaaid en gestimuleerd om nets te vormen middels chemische of biologische stimuli; vervolgens worden de cellen verwerkt voor immunolabeling of EM om de nets te visualiseren. Hallo, ik ben Christian Gosman van de microscopy core facility van het Max Planck Institute for Infection Biology. Vandaag laten we u een procedure zien om neutrofiele granulocyten uit menselijk bloed te zuiveren en ze te stimuleren om neutrofiele extracellulaire traps, oftewel nets, te genereren.Vervolgens zullen we de nets visualiseren met immunofluorescentie en scanning elektronenmicroscopie. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de mechanismen te bestuderen die leiden tot netvorming en om de antimicrobiële eigenschappen van nets te analyseren. Laten we beginnen.Begin dit protocol in een laminaire flowkast door zes milliliter histo 1119 in elk van vier 15 milliliter Falcon-buizen te prepareeren. Breng voorzichtig vijf tot zeven milliliter volbloed in een laag over het histo in elke buis aan en centrifugeer de buizen gedurende 20 minuten bij ongeveer 800 ×g, waarbij u er zeker van bent dat de rem uitgeschakeld is zodra de centrifugatie is voltooid. Verwijder de buizen voorzichtig uit de centrifuge.De buis zal van boven naar beneden vier duidelijk gescheiden lagen bevatten. Dit zijn een donkerrode laag met erytrocyten, een lichtrode laag met neutrofiele granulocyten en enkele erytrocyten, een witgeelachtige laag met leukocyten en serum, en een heldergele laag serum.Werk opnieuw in de laminaire flowkast. Gebruik de pipet die is aangesloten op een vacuümsysteem om de bovenste gele laag voorzichtig af te zuigen. Draag vervolgens met een pipet de roodachtige fase die granulocyten bevat vanuit elke buis over naar een nieuwe Falcon-buis.Vul daarna de buisjes met PBS om de granulocyten te wassen. Pellet deze vervolgens door centrifugatie gedurende 10 minuten bij ongeveer 300 ×g terwijl de cellen centrifugeren. Bereid een 100% percoll-oplossing door 18 milliliters percoll te mengen met twee milliliters 10 × PBS.Gebruik vervolgens de 100% coll-oplossing en één keer PBS om vier milliliter van elk van de 65%, 70%, 75%, 80% en 85% coll-oplossingen te bereiden. Gebruik deze oplossingen om coll-gradiënten te maken door voorzichtig twee milliliter van elke oplossing in elk van de twee buizen te laagjes. Begin met het toevoegen van twee milliliter van de 85% oplossing in elke buis.Breng vervolgens voorzichtig twee milliliter van de 80%per co aan als laag bovenop de 85%per coll. Ga door met het aanbrengen van twee milliliter van elke oplossing in aflopende volgorde, zodat de 65%solution als bovenste laag wordt aangebracht. Verwijder de gesedimenteerde leukocyten uit de centrifuge onder de zuigkast.Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in één milliliter PBS. Combineer vervolgens de geresuspendeerde cellen in een nieuwe buis. Breng voorzichtig twee milliliter van de geresuspendeerde granulocyten in een laag aan op elk van de Percoll-gradiënten.Centrifuge vervolgens 20 minuten bij ongeveer 800 ×g, waarbij u er zeker van bent dat de rem na centrifugatie is uitgeschakeld. De interfaces zouden duidelijk zichtbaar moeten zijn vanwege de hoogste celdichtheid. Verwijder de bovenste laag en het grootste deel van de 65%-laag, waarin perifere mononucleaire bloedcellen of pBMC's zich bevinden.Verzamel de 65%70%interface samen met de 70%75% en 80%85%interface van elke gradiënt en breng deze over naar nieuwe, schone falcon tubes. Was de cellen door de tube te vullen met PBS en centrifugeer 10 minuten bij ongeveer 300 ×g om de cellen na centrifugatie te pelletteren. Verwijder het supernatant en resuspendeer de gesedimenteerde polymorfnucleaire leukocyten of PMN's in twee milliliter PBS.Op dit punt zal 95% of meer van de cellen in de preparatie mns zijn. Gebruik een hemocytometer om de celgetallen te bepalen, en breng vervolgens 200.000 cellen in 500 µL RPMI aan op steriele ronde dekglasjes die zijn geplaatst in cultuurplaten met wells van 15 mm. Incubeer gedurende één uur in een 5% CO2-incubator bij 37 °C om de cellen de gelegenheid te geven zich aan de dekglasjes te hechten.Voeg 100 µL RPMI toe dat het gewenste stimulerende middel bevat. Voor een tijdreeksexperiment dient het stimulerende middel sequentieel te worden toegevoegd, beginnend met de langste stimulatietijd voor elk conditioneel tijdspunt. Zorg ervoor dat er een positieve controle wordt klaargezet door 600 nM PMA in RPMI toe te voegen.Bereid daarnaast voor elke conditie of tijdstip een negatieve controle voor door enkel RPMI toe te voegen en vier uur lang te incuberen in een CO2-incubator bij 37 °C. Tijdens de stimulatie kan de vorming van nets worden gevolgd met bright-field microscopie. Kort na de stimulatie veranderen de kernen drastisch van vorm. Ze verliezen hun lobulatie, worden rond en zetten vervolgens uit. Voeg op het gewenste tijdstip 600 µL van een paraformaldehydeloplossing van 8% op kamertemperatuur toe aan elke well.Om de uiteindelijke concentratie op 4% te brengen, wordt er voor immunolabeling twee tot vier uur geïncubeerd. Plaats een paraformvel op een reageerbuisrek met drie bij acht gaten van ongeveer 15 millimeter diameter. Vul de putjes met PBS om putjes te vormen.Gebruik een gebogen naald om elk dekglas van het paraldehyde op de kweekplaat op te tillen. Pak vervolgens met een pincet het dekglas vast en keer het om op het oppervlak van een druppel PBS op de paraform. Op dit punt zijn neutrofiele extracellulaire traps zeer fragiel en moet er during de manipulatie uiterste zorg worden betracht om celverlies te voorkomen.Herhaal na vijf minuten de wasstap door de dekglasjes over te brengen naar nieuwe druppels PBS. Herhaal dit voor een totaal van drie wasbeurten. Breng de dekglasjes vervolgens gedurende één minuut over naar een druppel 0,5% Triton X 100 op kamertemperatuur om de cellen te permeabiliseren.Was daarna drie keer in PBS gedurende één minuut per wasbeurt. Ga verder met de kleuring volgens het bijbehorende geschreven protocol. Voer elke incubatie en wasstap uit door het dekglas op de paraform om te keren.Zodra de cellen zijn gekleurd, plaatst u een druppel van 20 µL MO op een objectglas en monteert u de dekglasjes met de cellen tussen het dekglas en het objectglas. Na één uur moet de MOY gestold zijn en zijn de cellen klaar voor microscopische analyse. Bereid de cellen bij gebruik van immersie-objectieven voor op scanning elektronenmicroscopie onder een chemische zuurkast.Fixeer de cellen op de glazen dekglasjes in een 24-wellplaat naafschakeling met 2,5% glutaraldehyde in PBS gedurende 30 minuten. Plaats tijdens de incubatie een paraformvel op een reageerbuisstandaard met drie rijen van acht gaten met een diameter van ongeveer 15 millimeter.Om putjes te maken. Vul de putjes met gedestilleerd water. Gebruik een gebogen naald om elk van de dekglasjes uit de glutaraldehyde-oplossing te tillen.Pak vervolgens met een pincet het dekglas vast en breng het over naar een druppel gedestilleerd water op de Paraform-wasplaat door de dekglazen over te brengen naar druppels gedestilleerd water op Paraform. Herhaal dit voor in totaal drie wasbeurten van vijf minuten per keer; breng de dekglazen vervolgens terug in de putjes van de celkweekplaat die 0,5% osmiumtetroxide in gedestilleerd water bevatten en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de dekglazen uit de plaat en was deze drie keer in gedestilleerd water zoals voorheen.Plaats ze vervolgens terug in de 24-wells plaat met 0,5 milliliters 1% tanninezuur in elke well en incubeer gedurende 30 minuten. Was daarna de dekglasjes drie keer gedurende vijf minuten per keer. Herhaal vervolgens de fixatie met osmiumtetroxide en de wasstap.Dek vervolgens de reageerbuis af. Sluit deze af met een nieuw stukje parafilm. Dehydrateer de cellen via een reeks incubaties in de volgende ethanoloplossingen gedurende telkens vijf minuten: 30, 50, 70, 80, 90, 100%.En tot slot, nog één keer in 100% ethanol. Dompel het rek onder in een met ethanol gevuld monsterbakje. Plaats de dekglasjes snel in het metalen rek, waarbij u ervoor zorgt dat de monsters niet uitdrogen.Plaats vervolgens het monsterbootje in een gekoelde kritische puntdroger (CPD). Vul de kamer van de CPD met vloeibare CO2. Laat de inlaatklep volledig openstaan om het vloeistofniveau te handhaven en open de afvoerklep aan de onderzijde zodra er een fase van ethanol zichtbaar is onder de CO2-fase op de bodem van de kamer.Om het grootste deel van de ethanol te verwijderen. Laat de kamer ongeveer 30 minuten spoelen. Sluit na het spoelen de inlaatklep en verlaag het vloeistofniveau tot net onder de bovenkant van de boot.Laat warm water door de mantel van de CPD stromen. Wanneer de temperatuur 36 tot 38 °C bereikt en de druk stijgt tot 1.200 pounds per square inch, zal de grenslijn tussen vloeistof en gas verdwijnen en bevinden de monsters zich boven het kritische punt. Zodra het kritische punt is bereikt, wordt het gas gedurende een periode van vijf minuten langzaam afgevoerd.Om condensatie te voorkomen, moet de temperatuur rond de 40 °C blijven. Open tijdens deze tijd de deur en haal het bootje eruit. Bevestig dat het dehydraterende oplosmiddel is verdampt.Plak de dekglasjes met de juiste zijde naar boven op de lijm van de aluminium monsterhouder en breng ze over naar het hochresolutie-coatingsysteem. Vacumeer de coatingcilinder tot 2 × 10⁻⁵ millibar. Stel het instrument vervolgens in op 1,8 kilovolt en 70 milliampère, en monitor de dikte van de platinum-carbonlaag met een kwartskristaldikte-monitor totdat de laag een dikte van 5 nanometer bereikt.Ontlucht de coatingcilinder van het coating-systeem met hoge resolutie. Verwijder vervolgens met een pincet de monsters uit de coater. Breng de kamer van de SEM naar normale druk.Open de deur. Plaats vervolgens de monsters in de monsterhouder en vacuümeer de kamer voor SEM-analyse.Wanneer er op verschillende tijdspunten na stimulatie wordt gefixeerd, kunnen morfologische veranderingen tijdens NETose worden waargenomen via immunofluorescentiemicroscopie. In deze figuur wordt het DNA in blauw getoond. Het histon-DNA-complex wordt in rood getoond en de neutrofiel elastase.Een korrelmarker wordt in het groen getoond tijdens de eerste fase van NETosis, uitsluitend aan de nucleaire periferie in gecondenseerde kernen. Later, wanneer het chromatine verder gedecondenseerd is, is het grootste deel van de kern gekleurd in de gedecondenseerde nets. De kleuring is homogeen.Dit paneel met afbeeldingen detaileert de overlap van nucleaire en granulaire kleuring die optreedt bij NETosis. Deze scanning elektronenmicroscopische opname toont niet-gestimuleerde neutrofielen; na stimulatie met Ella-bacteriën vlakken de neutrofielen af en produceren zij neutrofiele extracellulaire traps. Hier is een gel-bacterie gevangen in nets.Bacteriën zoals gel worden geïmobiliseerd en gedood door de enzymen die in netten aanwezig zijn. We hebben zojuist laten zien hoe u neutrofiele granulocyten uit menselijk bloed kunt isoleren en stimuleren om de vorming van neutrofiele extracellulaire traps te induceren. Deze kunnen vervolgens verder worden geanalyseerd via immunofluorescentie of scanning elektronenmicroscopie.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de netten zeer fragiel zijn, zelfs na fixatie. Om het verlies van netten te minimaliseren, halen we de dekglasjes met de gestimuleerde neutrofielen uit de well-caviteiten en voeren we het grootste deel van de procedure uit op het oppervlak van bufferdruppels. Zelfs dan is het belangrijk om de preparaten voorzichtig en langzaam te verplaatsen.Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

neutrophil-extracellular-traps-how-to-generate-and-visualize-them

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates the fluorescent staining of neutrophil extracellular traps (NETs), the extracellular DNA components expelled by neutrophils. This technique enables the visualization of adhesive interaction between cancer cells and NETs.

Fluorescence Microscopy of Neutrophil Extracellular Traps or NETs: A Technique to Observe Adhesive Interaction Between Cancer Cells and NETs

This video demonstrates an in vitro technique to generate and isolate neutrophil extracellular traps (NETs). Neutrophils are isolated from peripheral blood and stimulated with phorbol myristate acetate (PMA) to produce NETs. During incubation, the neutrophils undergo a process of cell death (NETosis) to release NETs comprising decondensed chromatin mixed with granular cytoplasmic proteins.

An In Vitro Technique to Generate Human Neutrophil Extracellular Traps

This video demonstrates the induction and visualization of neutrophil extracellular traps or NETs in pre-labeled neutrophils using patient serum containing anti-neutrophil cytoplasmic antibodies. Furthermore, using an impermeable DNA dye and fluorescence microscopy enables the visualization of NETs.

Induction and Visualization of Neutrophil Extracellular Traps in Pre-Labeled Neutrophils

Macrophage vallen extracellulaire een nieuw beschreven entiteit. Dit artikel zal zich concentreren op confocale microscopie methodes en hoe ze zijn gevisualiseerd in vitro en in vivo van longkanker monsters.

Visualiseren van extracellulaire Traps Macrophage met behulp van de Confocal Microscopie

Hier presenteren we een methode waarin menselijke low-density neutrofiele granulocyten (LDN), postoperatieve peritoneale lavage vloeistof, verhaald produceren enorme neutrofiele extracellulaire vallen (netten) en efficiënt trap gratis tumorcellen die vervolgens groeien.

Neutrofiele extracellulaire Traps gegenereerd door lage dichtheid neutrofielen verkregen peritoneale Lavage vloeistof bemiddelen Tumor celgroei en bijlage

Hier presenteren we een protocol voor het genereren van neutrofiele extracellulaire vallen (netten) en het bedienen van NETQUANT, een volautomatische software optie voor het kwantificeren van netten in immunofluorescentie beelden.

Geautomatiseerde kwantificering van neutrofiele extracellulaire traps met behulp van NETQUANT

Dit protocol beschrijft een zeer gevoelige en hoge doorvoer neutrofiele extracellulaire val (NET) assay voor de semi-automatische kwantificering van ex vivo NET vorming door immunofluorescentie driedimensionale confocale microscopie. Dit protocol kan worden gebruikt voor het evalueren van de netto vorming en afbraak na verschillende prikkels en kan worden gebruikt voor het bestuderen van potentiële NET-gerichte therapieën.

Een High-throughput Assay voor het beoordelen en kwantificeren van neutrofiele extracellulaire Trap vorming

Neutrofiele extracellulaire vallen (netten) zijn driedimensionale structuren gegenereerd door geprikkeld neutrofiele granulocyten. Het is in de afgelopen jaren duidelijk geworden dat netten betrokken zijn bij een grote verscheidenheid aan ziekten. Detectie van netten in weefsel kan diagnostische relevantie hebben, zodat gestandaardiseerde protocollen voor het labelen van NETTOCOMPONENTEN vereist zijn.

Immunofluorescentie-etikettering van humane en Muriene neutrofiele extracellulaire vallen in paraffine-ingesloten weefsel

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de inductie en analyse van in vitro neutrofiele extracellulaire vallen (NET's). Kwantificering van DNA, cathelicidin (LL37) en enzymactiviteit leverde gegevens op die de variabiliteit in de samenstelling en morfologie van NET's geïnduceerd door microbiële en chemische stimuli onder vergelijkbare gecontroleerde omstandigheden aantonen.

Morfologische en compositorische analyse van neutrofiele extracellulaire vallen geïnduceerd door microbiële en chemische stimuli

Neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) worden in verband gebracht met verschillende ziekten en immunofluorescentie wordt vaak gebruikt voor hun visualisatie. Er zijn echter verschillende kleuringsprotocollen en in veel gevallen wordt slechts één type weefsel onderzocht. Hier stellen we een algemeen toepasbaar protocol op voor het kleuren van NET in muizen en menselijk weefsel.

Immunofluorescentiebeeldvorming van neutrofiele extracellulaire vallen in menselijke en muizenweefsels

We presenteren een geautomatiseerde high-throughput methode om neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) te kwantificeren met behulp van het live cell analysesysteem, gekoppeld aan een membraanpermeabiliteit-afhankelijke dual-dye benadering.

Real-time High Throughput-techniek om de vorming van extracellulaire neutrofielen in menselijke neutrofielen te kwantificeren

Leer hoe je neutrofiele granulocyten isoleert uit menselijk bloed en stimuleert tot vorming van Neutrofiele Extracellulaire Vallen (NETs). Visualiseer deze structuren met immunofluorescentie en scanning-elektronenmicroscopie.

Neutrofielen Extracellulaire Traps: Hoe te genereren en te visualiseren

Meer video's verkennen