Name: Imaging mismatch repair en cellulaire reacties op DNA-schade in Bacillus subtilis /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-08T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Leer hoe je DNA-reparatiecomplexen in levende Bacillus subtilis cellen visualiseert met GFP-fusie-eiwitten. Deze methode biedt inzicht in mismatch repair dynamiek en genomische stabiliteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Drs bedanken. Philina S. Lee en Alan D. Grossman voor de eerste training LAS in fluorescentie microscopie. De auteurs danken ook Drs. Melanie Berkmen en Hajime Kobayashi voor hulp en tips voor beeldvorming. Dit werk werd ondersteund door start-up middelen van de College of Literature, Science &amp; Kunst en van de afdeling Moleculaire, Cellular, en Ontwikkelingsbiologie aan de Universiteit van Michigan.

Groeiende culturen van cellen voor microscopie 1. Een of twee dagen voor de beeldvorming, de voorbereiding van de B. subtilis stam die het translationele fusie-eiwit u wenst te visualiseren. Trial rondes van de stappen 1A en 1B zal nodig zijn om te bepalen welke groei de conditie van de beste beelden van je stam biedt. In de meeste gevallen, moeten cellen worden afgebeeld tijdens de exponentiële groei fase. <ol class="ualpha"><li> Voor sommige B. subtilis stammen (in het bijzonder, stammen die slecht groeien als gevolg van de integratie van de translationele fusie tussen het gen van belang en GFP op de endogene locus), de initiële groei voor twee dagen voorafgaand aan de beeldvorming is nodig voor hoge kwaliteit beelden. Op de eerste dag, streep de B. subtilis stam af te beelden op LB-agar met selectieve antibiotica (s) en incubeer overnacht bij 30 ° C. Op de tweede dag, enten 100 pi van 0,85% zoutoplossing met een enkele kolonie en het uitvoeren van drie 10-voudige seriële verdunningen op LB agar platen (met selectieve antibiotica), plating 100 ul van elke verdunning, gevolgd door een incubatie overnacht bij 30 ° C. Op de derde dag, selecteert u de verdunning plaat met licht confluente groei van cellen. Licht confluerende groei op een plaat zal de groei medium met een gezonde, exponentieel groeiende starter inoculum aan potentieel rendement uitstekende imaging resultaten (zie stap 4). Deze stap is vooral nuttig voor de hoogste kwaliteit membraan beeldvorming met de vlek FM4-64. </li><li> Andere B. subtilis stammen kunnen gewoon worden toegepast op selectieve LB-agar medium voor enkele kolonies met een steriele stok de dag voorafgaand aan de beeldvorming en incubeer overnacht bij 30 ° C. De volgende dag, zal cellen op deze plaat voldoende zijn om te gebruiken als een inoculum voor de beeldvorming (zie stap 4). OPMERKING: B. subtilis, 's nachts culturen in vloeibaar medium niet geschikt zijn te wijten aan een combinatie van spore vorming en quorum reacties, die een langere periode van de aanlooptijd de groei 1 zal veroorzaken. </li></ol> 2. Op de ochtend van beeldvorming, plaats 10 ml van de S7 50 1-3 medium in een 125 ml steriele erlenmeyer. 3. Resuspendeer de cellen in maximaal 2 ml van S7 50 medium van de LB agar plaat met enkele kolonies of het licht samenvloeiende cellen een inoculum te verkrijgen. 4. Voeg genoeg S7 50 medium-cel inoculum aan de erlenmeyer met 10 mL S7 50 medium voor een cultuur met een eerste optische dichtheid gemeten bij 600 nm (OD 600) van ~ 0,08 tot 0,1. Bij deze stap is het belangrijk om minstens een 10-voudige lucht medium verhouding. Zo maken we gebruik van 10 tot 12,5 ml geënt medium in een 125 ml erlenmeyer. 5. Grow elke cultuur bij 30 ° C tot de cultuur in een OD 600 ~ 0.5-0.8. Schudden water baden hebben de voorkeur met de omwentelingen per minuut 150 tot 200. Culturen uitgedaagd met DNA te beschadigen of te mismatch inducerende middelen dienen te worden in een vroeg exponentiële groeifase OD 600 zodanig dat de cellen zal het doel te bereiken OD 600 met de extra periode van groei die nodig is voor de behandeling (zie tabel 1) Bijvoorbeeld 2-aminopurine moet een uur van de behandeling, en dus een cultuur die werden behandeld met 2-aminopurine moet op OD 600 ~ 0.3-0.4, zodanig dat het een uur van de behandeling / groei resulteert in een OD 600 ~ 0.5-0.8, waarbij de cellen zijn klaar voor de beeldvorming. Monstervoorbereiding 1. Pipetteer 300 ul van gekweekte cellen in een 1,5 ml microcentrifugebuis. 2. Als beeldvorming van cellulaire membranen gewenst is, voeg 1:1000 verdunning van FM4-64 membraan vlek (Invitrogen) toe aan elk monster van een 1 mg / ml stamoplossing. Een titratie van FM4-64 kan nodig zijn om de gewenste fluorescentie-signaal te bereiken. Een typische titratie bereik is 1:100, 1:1000 en 1:10.000. 3. Laat de monsters op kamertemperatuur komen voor het tot tien minuten of wanneer de schuif wordt bereid met 1% agarose in 1X Spizizens medium zoals hieronder beschreven (stap 1 van "prepareren" te zien). 4. Als de concentratie van cellen nodig is, geven wij de voorkeur filtering cellen met behulp van een 0,2 um filter met een stofzuiger apparaat. Cellen kunnen vervolgens voorzichtig worden gewassen van het oppervlak van de filter met PBS, een ander geschikt medium buffer of voorafgaand aan de visualisatie. Slide Voorbereiding 1. Bereid 1% agarose met 1X Spizizens. Voeg 5 ml van 10X Spizizens voorraad 45 ml ddH2O samen met 0,5 g agarose, en een magnetron te smelten. Warme gesmolten agarose is moeilijk te pipet, en gestolde agarose zal niet de pipetpunt in te voeren. De agarose moet evenwicht zijn in een waterbad tot een temperatuur van ~ 55 tot 65 ° C voor het aan de pipetpunt betreden zonder stollen in de tip. 2. Teken 20 pl van Spizizens met 1% gesmolten agarose in de pipetpunt. Pipetteer een enkele druppel (ongeveer 1-2 pi) van de agarose oplossing in elke dia goed (we gebruiken 15-slides goed, zie tabel 2) te ondiep agarose pads vormen. De agarose zal onmiddellijk stollen. Dia's moeten eveneens onmiddellijk voorafgaand aan de toepassing van de cellen. Als de agarose pads zijn bij kamertemperatuur alleen, kunnen ze uitdrogen binnen enkele minuten en onbruikbaar geworden. Agarose pads moet in het midden en vul elk goed, maar hebben minimale hoogte te voorkomen dat het dekglaasje, als druppels zijn te hoog (bubble-achtige) of als het monster verspreidt zich voorbij de grens goed, gewoon vegen het goed schoon met een Kimwipe en breng een nieuwe agarose pad. 3. Breng de gehele 300 ul monster (zie stap 6) aan de dia, verdeeld over de top van elke agarose pad. Dit bedrag van de cellen moet voldoende zijn om elk putje deksel op de dia. 4. Laat de schuif vol met cellen te zitten bij kamertemperatuur (23 ° C) gedurende ongeveer tien minuten. Deze stap zal zorgen voor de cellen om zich te vestigen op de agarose pad steeds immobiel en klaar voor imaging. Voor gespecialiseerde heeft deze temperatuur kan veranderd moeten worden, bijvoorbeeld bij het ​​uitvoeren van experimenten die een temperatuur verschuiving vier vereisen. 5. Aspireren weg de overtollige medium uit elk putje, zonder het verwijderen van de pads zelf. 6. Breng de dekglaasje aan de dia en druk stevig en gelijkmatig, maar voorzichtig, over het gebied van de dia. Controleer of dat de dekglas is tegen de glijbaan en dat het deksel slip is niet verheven boven de dia. Visualisatie van cellen 1. Veel verschillende fluorescentie microscopen goed zal werken. Het is van cruciaal belang om een ​​100X olie-immersie lens te hebben. De Simmons Lab gebruikt: <ul><li> Olympus BX61 microscoop uitgerust met een 1,45 NA TIRFM 100X olie-immersie objectief </li><li> Hamamatsu ORCAR twee CCD-camera gekoelde </li><li> Lumen 200 arc metaal (Prior) lichtbron. </li><li> Voor het opsporen van GFP (FITC), filter excitatie en emissie 460-500 510-560 </li><li> Voor de detectie van FM4-64 (TRITC), filter excitatie en emissie 510-560 572-648. </li><li> Beelden werden vastgelegd met behulp van SlideBook 4.2 (figuur 1) </li></ul> 2. Breng de cellen in focus met behulp van wit licht. 3. Leg het beeld met passende filters voor elke fluorofoor. Representatieve resultaten Representatieve afbeeldingen worden weergegeven (figuur 1). GFP haarden moet goed gedefinieerd, terwijl de FM4-64 kleuring moeten helder en duidelijk 4-7. GFP of membraan beelden kunnen pseudo-gekleurd worden met alle kleuren, zodat voor de hoogste kwaliteit beeld worden gepresenteerd zonder gegevens te verliezen. <img src="/files/ftp_upload/1736/1736fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1: Vertegenwoordiger GFP beelden van B. subtilis translationele fusie-eiwitten. GFP eiwitten zijn in het groen, terwijl de FM4-64 membraankleuring wordt getoond in het rood. De witte schaal balk geeft drie micrometer (A) MutS-GFP [relevante genotype: muts - GFP (SPC), amyE:: Pspac mutL (cat)]. In de aanwezigheid van 600 ug / ml 2-aminopurine en 1 mM IPTG. FM4-64 signaal wordt niet weergegeven in om meer duidelijk de MutS-GFP brandpunten (B) MutL-GFP [relevante genotype: mutL:: mutL-GFP (SPC)].. In aanwezigheid van 2-aminopurine (C) DnaX-GFP [relevante genotype: dnaX:: dnaX-GFP (SPC)]. (D) RecA-GFP [relevante genotype: recA:: recA-GFP (SPC)] in het bijzijn van 20 ng / mL mitomycine C. (E) TagC-GFP [relevante genotype: tagC:: tagC-GFP (SPC) ] in de aanwezigheid van 1 ug / ml mitomycin C. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Behandeling / concentratie of hoeveelheid </td><td> Functie </td><td> De tijd van incubatie </td></tr><tr><td> Mitomycine C (MMC) [20 tot 150 ng / ml] </td><td> DNA alkylerende stof </td><td> 1 uur </td></tr><tr><td> 2-aminopurine (2-AP) [600 ug / ml] </td><td> mismatch inducerende </td><td> 1 uur </td></tr><tr><td> Hydroxyurea (HU) </td><td> put dNTPs </td><td> 3 uur </td></tr><tr><td> ultraviolet licht (UV) 20 J/m2 </td><td> Thymine-dimeren thymine en 6-4 fotoproducten </td><td> varieert afhankelijk van de bron, meestal 20 seconden </td></tr><tr><td> grijzen (ioniserende straling) 5-100 Gy </td><td> Dubbelstrengs breuken, enkele streng breuken en de basis schade websites </td><td> varieert afhankelijk van de bron </td></tr></tbody></table>"&gt; Tabel 1. Samenvatting van de DNA-schade en de mismatch Gezondheidsbevorderende behandelingen <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Commentaar (optioneel) </td></tr><tr><td> Multitest glijbaan, 15-well </td><td> MP Biomedicals </td><td> 6041505E </td><td></td></tr><tr><td> Microscoop Dekglas </td><td> Visser </td><td> 12-544-B </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Visser </td><td> BP160-500 </td><td></td></tr><tr><td> Mitomycine C </td><td> Sigma </td><td> M0503-2MG </td><td> mutageen, handschoenen </td></tr><tr><td> 2-aminopurine </td><td> Sigma </td><td> A3509-250mg </td><td> handschoenen </td></tr><tr><td> Hydroxyurea </td><td> Sigma </td><td> H8627-25G </td><td> handschoenen </td></tr><tr><td> FM4-64 </td><td> Invitrogen </td><td> T13320 </td><td> lichtgevoelige </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Lijst van specifieke reagentia en apparatuur:

<ol><li>Hardwood, C. R., Cutting, S. M. Molecular Biological Methods for Bacillus. , John Wiley and Sons. Chichester. (1990).</li>
<li>Berkmen, M. B., Grossman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+organization+of+the+Bacillus+subtilis+replication+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal organization of the Bacillus subtilis replication cycle.</a> Mol. Microbiol. 62, 57-71 (2006).</li>
<li>Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clp+and+Lon+proteases+occupy+distinct+subcellular+positions+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Clp and Lon proteases occupy distinct subcellular positions in Bacillus subtilis.</a> J. Bacteriol. 190, 6758-6768 (2008).</li>
<li>Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+is+required+for+the+RecA+localization+response+to+DNA+damage+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Replication is required for the RecA localization response to DNA damage in Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 1360-1365 (2007).</li>
<li>Simmons, L. A., Davies, B. W., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((b+Clamp+Directs+Localization+of+Mismatch+Repair+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">b Clamp Directs Localization of Mismatch Repair in Bacillus subtilis.</a> Mol. Cell. 29, 291-301 (2008).</li>
<li>Simmons, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+responses+to+double-strand+breaks+between+Escherichia+coli+and+Bacillus+subtilis+reveals+different+requirements+for+SOS+induction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Comparison of responses to double-strand breaks between Escherichia coli and Bacillus subtilis reveals different requirements for SOS induction.</a> J. Bacteriol. 191, 1152-1161 (2009).</li>
<li>Smith, B. T., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+mismatch+repair+in+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualization of mismatch repair in bacterial cells.</a> Mol. Cell. 8, 1197-1206 (2001).</li>
</ol>

Trial and error zijn verplicht om de blootstelling voorwaarden te vinden voor de hoogste kwaliteit beelden voor elke stam, vinden we dat een milliseconde is geschikt voor wit licht beelden, terwijl de blootstelling van 100 tot 2000 ms zijn geschikt voor GFP (FITC) en FM4-64 (TRITC ) beelden. Belichtingstijd is afhankelijk van de gebruikte beeldvormende apparatuur. Wij raden het gebruik van een stam per 15-well microscoop glijbaan voor de eenvoudigste beeldvorming, als pad de kwaliteit en de verspreiding van cellen van h...

Specifieke oplossing recepten 1: 10x S7 50 zouten 0,5 M MOPS 100 mM ammoniumsulfaat 50 mM Kalium monobasisch Filter steriliseren, en wikkel S7 50 media in folie voor de opslag 100x Metals 0,2 M MgCl 2 70 mM CaCl 2 5 mM MnCl 2 0,1 mM ZnCl2 100 ug / ml Thiamine HCl 2 mM HCl 0,5 mM FeCl 3 * dH 2 O tot eindvolume * FeCl 3 moet als laatste worden toegevoegd, om neerslag te voorkomen. Na het filter sterilisatie, wrap 100x Metal oplossing in folie. S7 50 media 1x S7 50 zouten 1x Metal 1% glucose 0,1% glutamaat 40 ug / ml Tryptofaan 40 ug / ml Fenylalanine gedestilleerd H 2 O tot eindvolume 10x Spizizens (gram / ​​L) 151,4 mM ammoniumsulfaat (20 g / L) 803,8 mM Kalium monobasisch (140g / L) 440,9 mM Kalium Dibasisch (60g / L) 34,0 mM natriumcitraat (10g / L) 16,6 mM MgSO 4 (2 g / L) dH 2 O tot eindvolume Filter steriliseren

imaging mismatch repair en cellulaire reacties op dna-schade in bacillus subtilis</em

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Zowel de prokaryoten en eukaryoten te reageren op DNA-schade door een complex geheel van lichamelijke veranderingen. Veranderingen in genexpressie, de herverdeling van bestaande eiwitten, en de assemblage van nieuwe eiwit-complexen kan worden gestimuleerd door een verscheidenheid van DNA-laesies en verkeerde DNA basenparen. Fluorescentie microscopie is gebruikt als een krachtig experimenteel hulpmiddel voor het visualiseren en te kwantificeren deze en andere reacties op DNA laesies en DNA-replicatie-status te controleren binnen het complex subcellulaire architectuur van een levende cel. Translationele fusies tussen fluorescerende reporter eiwitten en componenten van de DNA-replicatie en reparatie machines zijn gebruikt om de signalen te bepalen die zich richten op DNA-reparatie eiwitten aan hun verwante letsels<em&gt; In vivo</em&gt; En om te begrijpen hoe deze eiwitten worden georganiseerd in bacteriële cellen. Daarnaast zijn transcriptionele en translationele fusies gekoppeld aan DNA-schade induceerbare promoters geopenbaard die cellen binnen een populatie hebben genotoxische stress respons geactiveerd. In deze review, bieden we een gedetailleerd protocol voor het gebruik van fluorescentiemicroscopie het imago van de assemblage van DNA-reparatie en DNA-replicatie complexen in enkele bacteriële cellen. In het bijzonder dit werk richt zich op beeldvorming mismatch repair eiwitten, homologe recombinatie, DNA-replicatie en een SOS-induceerbare eiwit in<em&gt; Bacillus subtilis</em&gt;. Alle hier beschreven procedures zijn gemakkelijk vatbaar voor beeldvorming eiwitcomplexen in een verscheidenheid van bacteriële soorten.

Een gedetailleerd protocol is beschreven voor de beeldvorming van de real-time vorming van DNA-herstel complexen in<em&gt; Bacillus subtilis</em&gt; Cellen.

Imaging mismatch repair en cellulaire reacties op DNA-schade in Bacillus subtilis</em

Zowel prokaryoten als eukaryoten reageren op DNA-schade via een complex geheel van fysiologische veranderingen. Wijzigingen in de genexpressie, de redistributie ...

Baus TLU-stammen met translationele fusies van mismatch-reparatie. Eiwitten gefuseerd aan GFP worden uitgestreken op selectieve media. De uitgestreken cellen worden gebruikt voor een vers inoculum in vloeibare kweek.Cellen worden gekweekt tot een OD 600 van 0,3 tot 0,4, waarna indien gewenst mismatch-inducerende behandelingen worden toegepast en de cellen verder worden gekweekt tot een OD 600 van 0,5 tot 0,8, waarna de cellen worden geoogst. De membraankleurstof FM 4 64 wordt indien gewenst toegevoegd, en de cellen worden aangebracht op objectglazen met geprepareerde aros-pads en men laat ze bezinken na verwijdering van het overtollige medium door aspiratie.Er wordt een dekglas geplaatst en de cellen worden gevisualiseerd met behulp van microscopie. Hallo, ik ben Dr. Andrew Kow van het laboratorium van Dr. Lyle Simmons van de afdeling Molecular, Cellular and Developmental Biology aan de University of Michigan Ann Arbor. Vandaag laten we u een procedure zien die wordt gebruikt om translationele fusies van de DNA-mismatch-reparatie-eiwitten, evenals andere reparatie- en ribosomale eiwitten in Bacillus subtilis, te visualiseren.We gebruiken deze procedure om de interactie tussen de DNA-mismatch-reparatie-eiwitten en de ribosomale eiwitten in levende cellen van Bacillus subtilis te bestuderen. Laten we beginnen. Om deze procedure te starten, bereidt u de B. subtilis-stammen voor die het translationele fusie-eiwit bevatten dat u voor bepaalde stammen wilt visualiseren.Het is voldoende om één dag voor de beeldvorming te beginnen. Voorbeelden hiervan zijn stammen die goed groeien wanneer de translationele fusie tussen GFP en het gen van belang is ingebouwd in de endogene locus van het gen, zoals MU LGFP. Wanneer u één dag voor de beeldvorming begint, gebruikt u onder steriele omstandigheden een steriel stokje om de bacteriën aan te brengen op platen met selectief LB-agro-medium.Incubeer de bacteriën gedurende de nacht bij 30 degrees Celsius om enkele kolonies te laten groeien; de volgende dag worden deze kolonies gebruikt als startinoculum. Sommige B sublist-stammen vereisen twee dagen groei vóór de microscopie om beelden van hoge kwaliteit te verkrijgen. Specifieke stammen die twee dagen groei vereisen, zijn stammen die slecht groeien als gevolg van de translationele fusie, zoals rec A GFP. Streep op de eerste dag de bacteriën uit op selectieve LB AED en incubeer deze gedurende de nacht.Voer op de tweede dag een seriële verdunning uit. Pluk eerst een enkele kolonie om 100 µL 0,85% zoutoplossing te inoculeren, voer vervolgens vier tienvoudige seriële verdunningen uit en plateer 100 µL van elke zoutoplossingverdunning, evenals de startkolonie en de zoutoplossing, op LB-agarplaten die selectieve antibiotica bevatten. Incubeer de platen een nacht, gewoonlijk bij 30 °C. Selecteer na de tweede nachtelijke incubatie de verdunningsplaat die een lichte confluente celgroei vertoont.Deze zorgen voor een gezond, exponentieel groeiend startinoculum, wat potentieel uitstekende beeldgevingsresultaten oplevert. Dit is bijzonder nuttig voor beeldvorming van de hoogste kwaliteit bij membraankleuring. Voeg op de ochtend van de beeldvorming met FM 4 64 10 milliliters S seven 50 medium toe aan een 125 milliliter steriele kolf.Houd zo een lucht-mediumverhouding van ten minste tien maal in stand. Resuspendeer de cellen uit de lppl met enkelvoudige kolonies of cellen met een soortgelijke confluentie in maximaal twee milliliter S seven 50-medium om een inoculum te verkrijgen. Voeg voldoende S seven 50-medium celinoculum toe aan de Erlenmeyer-kolf met 10 milliliters S seven 50-medium, zodat de cultuur een initiële OD 600 van ongeveer 0,08 tot 0,1 heeft.Kweek vervolgens elke cultuur bij de juiste temperatuur voor de B-sublijst-stam die geïmageerd moet worden. Schuddende waterbaden hebben de voorkeur, met een toerental van 150 tot 200 rpm. Laat de culturen verder groeien totdat ze een OD 600 van ongeveer 0,5 tot 0,8 bereiken.Plan bij culturen die worden blootgesteld aan DNA-beschadigende of mismatch-inducerende agentia de behandeling zodanig dat het einde van de incubatieperiode met het DNA-altererende agens samenvalt met het moment waarop de doel-OD 600 wordt bereikt. Zo vereist 2-aminopurine, een DNA-gebaseerd analoog dat een mismatch-base nabootst wanneer het in het genoom wordt ingebouwd, een incubatie van één uur en leidt dit tot de vorming van foci van mismatch-reparatie-eiwitten zoals mutLGFP. De vorming van RecA-GFP-foci vereist echter een incubatie van één uur met mitomycine C of een ander DNA-beschadigingsreagens voor de inductie van dubbelstrengse DNA-breuken; zowel 2-aminopurine als mitomycine C worden toegevoegd.Wanneer de culturen een OD 600 van ongeveer 0,3 tot 0,4 bereiken en na het vereiste uur groei met een van beide behandelingen, hebben de culturen waarschijnlijk een OD 600 van 0,5 tot 0,8 bereikt en zijn ze klaar voor beeldvorming. Begin met het pipetteren van 300 µL van de gecultiveerde cellen in een 1,5 mL microcentrifugebuis. Indien beeldvorming van cellulaire membranen gewenst is bij een verdunning van 1:1000 van 1 mg/mL FM 4 64 membraankleurstof per monster, kan een titratie van FM 4 64 nodig zijn om het gewenste fluorescentiesignaal te verkrijgen.Een typisch titratiebereik is 1:100, 1:1000 tot 1:10.000. Laat de monsters tot 10 minuten staan of terwijl het preparaat wordt klaargemaakt. Als de concentratie van de cellen vereist is, filter de cellen dan met een 0,2 micrometer filter met behulp van een vacuümapparaat.Was vervolgens voorzichtig de cellen van het filter met een geschikte buffer of medium terwijl de celmonsters incuberen met FM 4 64. Bereid 1% agros met een eenvoudige concentratie zens door vijf milliliter 10 x zens-stock toe te voegen aan 45 milliliter gedestilleerd water, samen met 0,5 gram agros, en dit in de magnetron te verhitten tot smelting.Laat de temperatuur van de agarose equilibreren in een waterbad tot ongeveer 65 °C en zuig 20 µL van de vloeibare agarose op in een pipetpunt. Agarose die te heet is, is moeilijk te pipetteren en koude agarose zal stollen en niet in de pipetpunt terechtkomen.Gebruik vervolgens een multitest 15-wells slide en pipetteer een enkele druppel van ongeveer één tot twee µL van de aros-oplossing in elke well. Om ondiepe aros-pads te vormen, zal de aros onmiddellijk stollen.De objectglazen worden vlak voor het aanbrengen van de cellen klaargemaakt om uitdroging te voorkomen, wat de objectglazen onbruikbaar zou maken. De aros-pads moeten gecentreerd zijn en elke put vullen, maar een minimale hoogte hebben om te voorkomen dat het dekglas wordt verstoord. Als de druppels te hoog zijn, belvorming vertonen of als het monster zich buiten de rand van de put verspreidt, veeg de put dan eenvoudig schoon met een kim wipe en breng een nieuwe aros-pad aan.Nu het objectglas gereed is, brengt u het volledige monster van 300 µL dat eerder in het microcentrifugebuisje was apart gezet aan op het objectglas, waarbij het monster over de bovenkant van elk aeros-pad wordt verdeeld. Deze hoeveelheid cellen moet voldoende zijn om elke put op het objectglas te bedekken. Laat het met cellen geladen objectglas ongeveer 10 minuten bij kamertemperatuur staan.Deze stap zorgt ervoor dat de cellen op het agros-pad bezinken en immobiel worden, waardoor ze aan het einde van de incubatie van 10 minuten gereed zijn voor beeldvorming. Aspireer het overtollige medium uit elke put zonder de pads zelf te verwijderen. Plaats het dekglas op de objectglasplaat door stevig en gelijkmatig, maar voorzichtig, over het oppervlak van de plaat te drukken; controleer of het dekglas goed tegen de objectglasplaat aanligt en niet erboven uitsteekt.Voor de beeldvorming kunnen veel verschillende fluorescentiemicroscopen worden gebruikt. Het is essentieel om over een 100 x olie-immersielens te beschikken. Het Simmons-lab maakt gebruik van een Olympus BX 61-microscoop, uitgerust met een 100 x olie-immersie-objectief met een numerieke apertuur van 1,45, geschikt voor total internal reflection, fluorescentiemicroscopie of turf m.De microscoop is tevens uitgerust met een gekoelde CCD-camera en een LU 200 arch metal lichtbron. Begin met het in focus brengen van de cellen met behulp van wit licht. Gebruik voor elk flora het juiste filter.Vier voor detectie van GFP. Gebruik excitatiefilter 460 tot 500 en emissie 510 tot 560 voor detectie van FM 4 64. Gebruik excitatiefilter 510 tot 560 en emissie 572 tot 648.Leg het beeld vast met behulp van de juiste filters voor elke laag. Vier met de software voor slide book 4.2. Hier zijn enkele representatieve resultaten van de beeldvorming van het DNA-mismatch-reparatie-eiwit MU L, dat translationeel is gefuseerd met GFP.De onbehandelde controlecultuur van MU LGFP vertoont minimale foci, waarbij de meeste cellen slechts cytoplasmatische niveaus van het mut LGFP-fusie-eiwit bevatten. De meerderheid van de cellen die zijn gekweekt in de aanwezigheid van 2-aminopurine, dat een mismatch-base nabootst wanneer het in het genoom wordt ingebouwd, vertoont echter GFP-foci, wat aangeeft dat het mutale GFP-eiwit betrokken is bij de herkenning en herstel van de mismatch-DNA-basen.Vergelijkbare resultaten worden verkregen met de REC A GFP-stam die is gekweekt in de aanwezigheid van het DNA-beschadigende geneesmiddel mitomycine C. Hier bevat de meerderheid van de cellen na behandeling met mitomycine C een focus van rec A GFP, wat aangeeft dat rec A GFP heeft gereageerd op de DNA-beschadiging en het herstelproces is gestart; zonder behandeling met mitomycine C is pho IR niet waargenomen. We hebben zojuist laten zien hoe herstelproteïnen in levende facius subtlest-cellen gevisualiseerd kunnen worden. Bij het uitvoeren van deze procedure.Het is belangrijk om te onthouden dat u de tijd moet nemen om de cellen scherp te stellen, en dat dit in de praktijk enige oefening kan vereisen. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

imaging-mismatch-repair-cellular-responses-to-dna-damage-bacillus

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We presenteren een procedure waarbij twee-dimensionale agarose-gel analyse kan worden gebruikt om de structuur van de replicatie tussenproducten die optreden na UV-straling te identificeren.

Visualisatie van UV-geïnduceerde Replicatie Intermediates in E. coli Met behulp van twee-dimensionale Agarose gel-analyse

Elektronenspectroscopisch beeldvorming kan nucleïnezuur en eiwitten onderscheiden met een resolutie van nanometer. Het kan worden gecombineerd met het miniSOG-systeem, dat gelabelde eiwitten specifiek kan markeren in transmissie-elektronenmicroscopie-monsters. We illustreren het gebruik van deze technologieën met dubbelstrengsbreukreparatiefoci als voorbeeld.

Visualisatie van miniSOG Tagged DNA reparatie-eiwitten in combinatie met Electron spectroscopische beeldvorming (ESI)

Het doel van dit protocol is te beschrijven hoe laser microirradiation voor het opwekken van verschillende soorten DNA-beschadiging, met inbegrip van relatief eenvoudige strand einden en complexe schade, aan de studie van DNA schade signalering en reparatie factor montage op schade sites in vivo .

Laser Microirradiation om te studeren In Vivo cellulaire reacties op eenvoudige en complexe DNA-schade

Confocale fluorescentie microscopie en laser micro-bestraling aanbod tools voor inducerende DNA-beschadiging en het toezicht op de reactie van DNA reparatie eiwitten in geselecteerde sub nucleaire gebieden. Deze techniek is onze kennis van schade detectie, signalering en werving aanzienlijk vooruitgegaan. Dit manuscript toont deze technologieën te onderzoeken van een- en tweepersoonskamers strand break repair.

Toepassing van Laser-Micro-bestraling voor onderzoek van enkele en dubbele Strand Break Repair in zoogdiercellen

Reparatie van dubbele streng DNA pauzes is een dynamisch proces, waarbij niet alleen de vorming van reparatie complexen in de pauzes, maar ook hun resolutie na de laesie is gericht. Hier, gebruiken we immunofluorescentie microscopie voor voorbijgaande en langdurige double-stranded pauzes als een instrument om te ontleden dit genoom onderhoud mechanisme.

Karakterisering van de DNA-herstelsynthese op Transiënten- en Long-lasting Double-streng DNA-einden door immunofluorescentie microscopie

De door straling veroorzaakte DNA-schaderespons die wordt geactiveerd door neutronenmixstraal die wordt gebruikt in de boorneutronvangtherapie (BNCT) is nog niet volledig vastgesteld. Dit protocol biedt een stapsgewijze procedure voor het detecteren van door straling geïnduceerde foci (RIF) van reparatie-eiwitten door immunofluorescentie kleuring in menselijke darmkankercellijnen na bestraling met de neutronen gemengde straal.

Immunofluorescentie beeldvorming van DNA Schade en Reparatie Foci in human Colon Kankercellen

Na DNA-schade activeren menselijke cellen essentiële hersteltrajecten om de integriteit van hun genoom te herstellen. Hier beschrijven we de methode van indirecte immunofluorescentie als een middel om DNA-hersteleiwitten te detecteren, hun ruimtelijke en temporele rekrutering te analyseren en de eiwitinteractie op de sites van DNA-schade te helpen ondervragen.

Visualisatie van DNA Repair Proteins Interaction door Immunofluorescentie

Dit artikel introduceert essentiële stappen van immunostaining en chromatine immunoprecipitatie. Deze protocollen worden vaak gebruikt om DNA-schadegerelateerde cellulaire processen te bestuderen en om de rekrutering van eiwitten die betrokken zijn bij DNA-reparatie te visualiseren en te kwantificeren.

Visualiseren en kwantificeren van endonuclease-gebaseerde site-specifieke DNA-schade

Dit protocol beschrijft een werkwijze voor het visualiseren van een DNA dubbelstrengs breuken signaleringeiwit geactiveerd in reactie op DNA schade en de lokalisatie tijdens mitose.

Twee-en drie-dimensionale live cell imaging van DNA schade respons Eiwitten

Ratiometrische bimoleculaire bakens (RBMBs) kan worden gebruikt om het interne gemanipuleerde RNA-transcripten in levende cellen. Hier beschrijven we de bereiding en zuivering van RBMBs, levering van RBMBs in cellen van microporatie en fluorescentie beeldvorming van afzonderlijke RNA transcripten in real-time.

Real-time beeldvorming van Single Engineered RNA-transcripten in levende cellen door gebruik Ratiometrische Bimoleculaire Beacons

Leer hoe je DNA-reparatiecomplexen in levende Bacillus subtilis cellen visualiseert met GFP-fusie-eiwitten. Deze methode biedt inzicht in mismatch repair dynamiek en genomische stabiliteit.

Imaging mismatch repair en cellulaire reacties op DNA-schade in Bacillus subtilis

Meer video's verkennen