Ontcijfering Axonale Pathways van genetisch bepaalde groepen van neuronen in de Chick Neural Tube Door gebruik te maken In ovo Elektroporatie
May 2nd, 2010
Deze video laat zien hoe axonale paden van genetisch bepaalde groepen neuronen te visualiseren in de embryonale kuiken ruggenmerg gebruik te maken van In ovo Elektroporatie van de reportergenen onder de controle van specifieke enhancer elementen.
Hallo, ik ben Ham van het laboratorium van Dr.Review Klar bij de afdeling medische neurobiologie aan de Hebreeuwse Universiteit van Jeruzalem. Hallo, ik ben Sophie Esman en ik kom ook van een Lars lab. Vandaag laten we u een procedure zien voor Innovo, elektroporatie en spinale open boek voorbereiding.
We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om axonale trajecten van genetisch gedefinieerde neuronale populaties in het embryonale ruggenmerg te bestuderen. Dus laten we beginnen. Om deze procedure te starten, brengt u bevruchte witte leghorn kippen eieren over van kamertemperatuur naar een bevochtigde incubator, bij voorkeur met slingerende trays op 37 tot 38 graden Celsius.
Het is belangrijk om de temperatuur en vochtigheid van de incubator te controleren om levensvatbare en gesynchroniseerde embryo's te verkrijgen. De kuikenembryo's worden geëlektroporeerd wanneer ze hamburger en Hamilton of HH stadium 18 tot 20 hebben bereikt, wat een optimaal stadium is voor enhancer-afhankelijke specifieke expressie. In dit stadium ligt het hoofd haaks op de romp.
Ook in HH-stadium 18 tot 20, zou een uitgebreide set extra embryonale bloedvaten zoals anterieure, posterieure rechter en linker vitale lijnvaten ook moeten worden gezien. De kuikenembryo's bereiken HH-stadium 19 tot 20 na 66 uur incubatie, en op dat moment verwijdert u de eieren uit de incubator. Na het verwijderen van de eieren, legt u ze horizontaal en wacht u vijf tot 10 minuten. Het embryo bevindt zich nu op de bovenste pool van het ei.
Voor het elektroporeren bereiden de embryo's Hank's oplossing met 100 eenheden per milliliter penicilline en 0,1 milligram per milliliter streptomycine. Bereid een gewenste mengsel van DNA bij twee tot vijf microgram per microliter en voeg een paar korrels van de snelgroene kleurstof toe voor eenvoudige visualisatie van het geïnjecteerde DNA. Zorg ook voor een mondpipet, een steriele injectienaald, kleine schaar en een stukje plakband.
Bereid micro capillairen door glas capillairen met een diameter van 0,5 millimeter te trekken met een pipettrekker. Plaats de tungstenetodes in de micro manipulators en verbind de elektroden met de pulsgenerator. Stel de spanning op de pulsgenerator in op min 30 volt, de lengte van elke puls op 50 milliseconden en het aantal pulsen op drie.
Ga door met elektroporatie voordat u de embryo's blootlegt en behandeld. Plaats een spuit aan de smalle kant van het ei en verwijder vijf tot zes milliliter albumine uit elk ei. Het albumine wordt verwijderd om te voorkomen dat het morst.
Bij het snijden in de volgende stap, gebruikt u de kleine schaar om te snijden. Open een ovaal venster aan de bovenkant van het ei nadat het kuikenembryo is onthuld, bevochtig het met 0,5 tot één milliliter Hanks en penicilline streptomycine oplossing. Gebruik vervolgens een mondperpet om de glazen micro capillair te laden.
Met een DNA-kleurstofmengsel, zou een micro capillair van de juiste diameter gemakkelijk met DNA moeten worden geladen. Onder een binoculair stelt u de embryo voor het injecteren van het DNA in de neurale buis. Plaats het embryo met zijn staart naar u toe.
In dit ontwikkelingsstadium is het ruggenmerg duidelijk zichtbaar en daarom zijn geen contrasttechnieken vereist. Het ruggenmerg is aan beide kanten, het hoofd en de staart, afgesloten. Echter, met de micro capillaire puncties meer gat in de neurale buis en penetreert het op een ondiepe hoek, een micro capillair dat dun genoeg is en van de juiste diameter zou de buis moeten penetreren zonder het te beschadigen.
Injecteer het DNA met behulp van een mondperpet. Een micro capillair van de juiste diameter zou het DNA met een regelmatige uitademing moeten vrijgeven. De groene kleurstof zou zich moeten verspreiden vanaf de punt van de staart tot de blaasjes van de zich ontwikkelende hersenen.
Injecteer totdat de neurale buis gevuld is met DNA. Elektroporatie is vereist voor de geïnjecteerde DNA om de cellen eerst binnen te gaan. Plaats de elektroden parallel aan de neurale buis en zo dicht mogelijk bij deze zonder de buis zelf te raken. Zorg ervoor dat de elektroden bedekt zijn met vloeistof om elektrische geleidbaarheid tijdens de puls mogelijk te maken.
Meestal is de Hank-oplossing die onmiddellijk na het blootleggen van het embryo wordt toegevoegd voldoende. Maar als dat niet het geval is, een druppel Hank's oplossing net voor de puls met de elektroden gepositioneerd en ondergedompeld in vloeibare puls om elektro te bedienen, verwijder dan voorzichtig de elektroden en verzegel het venster en het ei met plakband. Het is belangrijk om het ei volledig te verzegelen om uitdroging van het embryo tijdens de volgende incubatieperiode te voorkomen.
Plaats het ei terug in de incubator en incubeer totdat het kuikenembryo ontwikkelings embryonaal bereikt. Dag zes of E zes, wanneer het tijd is voor beeldvorming wanneer het geëlektroporate embryo ontwikkelings embryonaal heeft bereikt. Dag zes, E zes drie dagen na elektroporatie, verwijdert u het uit het ei en plaatst u het in een met siliconen gecoate petrischaal met PBS met behulp van fijne schaar.
Snijd de membranen weg en rek het embryo op zijn ventrale kant uit met behulp van pinnen die in het siliconen worden geduwd om het op zijn plaats te houden. Gebruik een scherpe tungsteen micro capillair. Maak een longitudinale incisie langs het dakplateau van de achterhersenen tot aan de staart.
Maak twee extra longitudinale incisies aan beide zijden van het ruggenmerg, los de dorsale wortelganglia of DRG's los van het ruggenmerg. Los de vloerplaat los van het weefsel, beginnend vanaf de staart tot aan de achterhersenen, waarbij het ruggenmerg intact blijft. Gebruik tenslotte een fijne schaar om het ruggenmerg in een transversale sectie bij de achterhersenen door te snijden en het ruggenmerg van het lichaam te scheiden.
Nu het ruggenmerg is geïsoleerd, spreidt u het in een nieuwe met siliconen gecoate petrischaal met PBS, gebruikmakend van pinnen om het vast te houden van de achterhersen
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze video demonstreert een procedure voor het visualiseren van axonale paden van genetisch gedefinieerde neuronen in het embryonale kippenentruggenmerg met behulp van in ovo elektroporatie. De methode stelt onderzoekers in staat om axonale trajecten effectief te bestuderen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Ontwikkelingsbiologie
- Elektrofysiologie
Achtergrond
- Het begrijpen van axonale paden is cruciaal voor neurowetenschappelijk onderzoek.
- In ovo elektroporatie is een techniek die wordt gebruikt om reportergenen te introduceren.
- Het embryonale kippenentruggenmerg dient als model voor het bestuderen van neuronale ontwikkeling.
- Genetisch gedefinieerde neuronale populaties kunnen inzichten bieden in specifieke neurale circuits.
Doel van het onderzoek
- Om axonale paden in het embryonale ruggenmerg te visualiseren.
- Om in ovo elektroporatie te gebruiken voor genexpressiestudies.
- Om het begrip van neuronale ontwikkeling en connectiviteit te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Overbreng bevruchte kippeneitjes naar een bevochtigde incubator.
- Houd de incubatie op 37 tot 38 graden Celsius.
- Voer in ovo elektroporatie uit om reportergenen te introduceren.
- Bereid open book-preparaten van het ruggenmerg voor voor visualisatie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van axonale paden in het ruggenmerg.
- Demonstratie van de effectiviteit van in ovo elektroporatie.
- Inzichten in de trajecten van genetisch gedefinieerde neuronale populaties.
- Een betrouwbare methode vaststellen voor het bestuderen van neuronale ontwikkeling.
Conclusies
- De methode biedt een waardevol hulpmiddel voor neurowetenschappelijk onderzoek.
- In ovo elektroporatie is effectief voor genlevering in embryonale modellen.
- Het begrijpen van axonale paden kan studies over neurale circuitvorming informeren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables precise visualization of axonal trajectories in genetically defined neuronal populations, addressing a key challenge in target validation where bilateral labeling obscures ipsilateral versus contralateral projections. By restricting reporter expression to one side of the neural tube via unilateral in ovo electroporation, researchers achieve mechanistic de-risking of neuronal circuit hypotheses early in discovery. The approach supports predictive confidence in target selection by clarifying pathway-specific connectivity patterns relevant to neurodevelopmental disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating axonal projections of specific neuronal subpopulations defined by enhancer-driven reporters.
- Operational Value: Provides unilateral labeling to distinguish ipsi- and contra-laterally projecting axons, reducing ambiguity in circuit mapping.
- Predictive Value: Supports biological de-risking of targets by clarifying whether a neuronal population engages excitatory or inhibitory pathways critical for disease mechanism.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable axonal trajectory data as a phenotypic readout for screening genetic or pharmacological modulators of neuronal guidance.
- Operational Value: Produces standardized, reproducible whole-mount preparations compatible with high-resolution confocal imaging and automated analysis pipelines.
- Scalability Value: Utilizes chick embryo model amenable to scale for multi-condition testing of enhancer activity or electroporation efficiency.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Maps disease-relevant axonal pathways in vertebrate spinal cord models, enabling alignment with human neurodevelopmental disorder biomarkers.
- Mechanistic Continuity: Bridges discovery-stage target validation with preclinical assessment of circuit-level drug effects on axonal growth or guidance.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by revealing whether a target modulates specific projection patterns linked to functional recovery or pathology.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis generation through lead identification, providing mechanistic insights that precede functional assay development and support translational biomarker alignment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of enhancer-specific gene expression in defining neuronal subpopulations and their axonal trajectories.
- Screening: Enables assay-ready biological systems with standardized, unilateral reporter expression for evaluating compound effects on axon guidance.
- Analytics: Delivers quantitative spatial readouts of axonal projection patterns, facilitating comparison across genetic or treatment conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by establishing disease-relevant axonal pathway models for biomarker correlation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative testing of genetic constructs, enhancer elements, or electroporation parameters across multiple neuronal targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by resolving axonal projection directionality, a critical factor in assessing circuit-specific drug effects.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through defined electroporation parameters (voltage, pulse length, number) and staged embryo handling.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets whose axonal pathways are misaligned with desired therapeutic mechanisms.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying targets that modulate specific projection patterns relevant to clinical endpoints in neurodevelopmental indications.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryological techniques, including embryo staging, microinjection, and electroporation parameter optimization.
- Depends on instrumentation such as pulse generators, micro manipulators, tungsten electrodes, and confocal microscopy for imaging.
- Necessitates standardization of DNA concentration, enhancer element selection, and electrode placement across users and labs for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when transferring the model to other vertebrate systems or neuronal types beyond spinal interneurons.
- Practical limitations include embryo viability sensitivity to incubation conditions and the technical challenge of achieving uniform unilateral electroporation without tube damage.
