Isolatie van labiele Multi-eiwit-complexen door In vivo Gecontroleerde Cellulaire Cross-Linking and Immuno-magnetische affiniteitschromatografie
9 maart 2010
De cel permeabele crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionaat)] stabiliseert van voorbijgaande aard en labiele interacties In vivo, Die hun isolement kunnen met behulp van strenge eiwitcomplex zuiveringstechnieken. Hier presenteren wij een techniek voor het verknopen cellen gekweekt in cultuur, gevolgd door isolatie van eiwitcomplexen door immunoprecipitatie.
Voor de cross-linking, gevolgd door immunoprecipitatie. Procedurecellen met een dichtheid van 80 tot 90% worden geïncubeerd met één millimolair ijskoud. DSP in PBS, calcium, magnesium of alleen DMSO.
Voertuigcontrole. DSP is een homo bifunctioneel membraan doorlaatbaar en th reduceerbare crosslinker die vrije en betekent binnen 12 angstroms van elkaar kruist. Na kruisbinding worden cellen gelyseerd en immunoprecipitaties worden uitgevoerd met behulp van standaardcontroles.
Eiwitcomplexen worden vervolgens opgelost door reducerende SDS-pagina, reducerende middelen die DSP afbreken, waardoor de identificatie van individuele eiwitten mogelijk is door immunoblot. Hoi, ik ben Stephanie Ick van het laboratorium van Dr.Victor Fonde in de afdeling Celbiologie aan de Emory University. En ik ben Pearl Ryder, ook van het Fonde-lab.
Vandaag laten we u een procedure zien voor de isolatie van mijn eiwitcomplexen met behulp van gecontroleerde kruisbinding gevolgd door immunomagnetische affiniteitschromatografie. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om tijdelijke labiele eiwitinteracties te bestuderen. Dus laten we beginnen.
Begin met het labelen van de onderkant van de celplaten om het celtype en de specifieke experimentele omstandigheden aan te geven. Een positief symbool hier duidt op DSP-behandelde inclusief een negatieve DMSO-alleen voertuigcontrole. Voeg media toe aan de platen om ze voor te bereiden op celzaaien plate.
HEK-cellen gezaaid bij een verdunning van één op vijf om de isolatie van 500 microgram eiwit per standaardbuisreactie mogelijk te maken. Een enkele buis kan volstaan om de veronderstelde bindingspartners van een eiwit van belang te identificeren door immunoblot uit massaspectrometrie-analyse. Verhoog het aantal standaardreacties minimaal tien keer.
Bereid ook stammen van de meeste oplossingen voor die in het kruisbindingsexperiment worden gebruikt. Deze omvatten PBS aangevuld met 0,1 millimolair calciumchloride en één millimolair magnesiumchloride, aangeduid als PBS calcium magnesium. De toevoeging van calcium- en magnesiumionen is cruciaal voor de hechting van cellen aan de kweekplaat.
Tijdens het experiment bewaar de oplossing op vier graden Celsius. Andere voorraden omvatten crosslinker-dovingsoplossing 50 X complete proteaseremmercocktail, die elke 20 minuten wordt gevormd totdat de pellet is opgelost. 20%Tritan X 100, die op vier graden Celsius wordt bewaard en binnen een maand moet worden gebruikt en 10 x en één x Buffer a-oplossingen.
Bereid en bewaar alle oplossingen zoals beschreven in het bijbehorende schriftelijke protocol. Bereid ten slotte de lysisbuffer voor, bestaande uit één X-buffer. A plus 0,5%TRITTON X 100 en immunomagnetische precipitatiebuffer of IP-buffer, bestaande uit één X-buffer.
A plus 0,1%TRITTON X 10Een tot twee dagen na het plateren zijn de cellen 80 tot 90%co fluence, wat optimaal is voor kruisbinding. In hoge co fluence-omstandigheden hebben cellen de neiging om op elkaar te stapelen, wat leidt tot een afname van de toegankelijkheid van de celpermeable crosslinker voor alle cellen. Plaats de platen terug in de incubator totdat ze klaar zijn voor kruisbinding.
Bereid de DSP-crosslinkeroplossing onmiddellijk voordat u deze op de cellen aanbrengt. DSP is zeer hydrofoob en wordt daarom opgelost in DMSO tot een concentratie van 100 millimolair voordat het wordt verdund in de PBS calciummagnesiumbuffer. Om de verdunning van DSP in de PBS calciummagnesiumbuffer verder te verbeteren, verwarm en geef een geschikt volume, voeg 10 microliter van de DSP- en DMSO-stakoplossing toe.
Voor elke één milliliter warm PBS calciummagnesium, voeg de D-S-P-D-M-S-O stakoplossing druppel voor druppel toe met herhaald mengen tot alle DSP is opgelost. Bereid ook een voertuigcontroleoplossing van 10 microliter DMSO voor elke milliliter PBS calciummagnesium. Na het verdunnen van de DSP, bewaar alle PBS calciummagnesiumoplossingen in een ijswaterbad gedurende maximaal 10 minuten.
Bereid vervolgens een ijswaterbad voor dat alle platen kan bevatten die in het experiment worden gebruikt. Neem de kweekplaten met de cellen uit de 37 graden Celsius-incubator en plaats ze onmiddellijk in het ijswaterbad. Was de cellen twee keer met ijskoud PBS calciummagnesium, met behulp van dezelfde volumes die eerder zijn bereid voor de incubatie met de crosslinker voor een zes-welplate, bereken twee milliliter per putje, enzovoort.
Na de tweede wasbeurt. Voeg ofwel de voertuigregeling, dat is het DMSO opgelost in buffer of de DSP-crosslinkingbufferoplossing toe aan de cellen, incubeer op ijs gedurende twee uur en controleer ongeveer elke 20 minuten om ervoor te zorgen dat alle cellen bedekt zijn met oplossing. Als sommige cellen worden blootgesteld, kantel en draai de schaal om ze weer gelijkmatig te bedekken, het is normaal dat een kleine hoeveelheid DSP precipiteert.
Tijdens de twee uur durende incubatie met de cellen voordat de tweede uur incubatie is afgelopen, bereid een een XDSP-dovingsoplossing voor door de stam in PBS calciummagnesium te verdunnen. Houd de oplossing op ijs totdat u deze gebruikt om de kruisbindingsreactie te stoppen door het DSP dat niet is gereageerd in te werken. Wanneer de twee uur zijn verstreken, verwijder de voertuigregeling en crosslinkingoplossingen van de cellen.
Voeg de ijskoude DSP-dovingsoplossing toe en incubeer gedurende 15 minuten op ijs. Terwijl u de complete proteaseremmercocktail een op 50 in de cellysisbuffer verdunt. Zodra de 15 minuten voorbij zijn, was de cellen twee keer met PBS calciummagnesium.
Voeg vervolgens de lysisbuffer met de proteaseremmers toe aan de cellen en schud bij vier graden Celsius gedurende 30 minuten. Na 30 minuten cellysis, gebruik een celschraper om de cellen van de plaat te verzamelen. Zorg ervoor dat u de lysates op ijs houdt om de protease-activiteit te minimaliseren.
Centrifugeer de cellysaten gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius in een tafelcentrifuge met een topsnelheid van 15.000 Gs. Pipetteer de supernatant in een verse buis en gooi de pellet weg. Analyseer eiwitniveaus
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het crosslinken van cellen met behulp van DSP, een celdoorlatende crosslinker, om tijdelijke eiwitinteracties in vivo te stabiliseren. De techniek maakt het mogelijk om eiwitcomplexen te isoleren door middel van immunoprecipitatie.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Eiwitinteracties
Achtergrond
- DSP is een homo bifunctionele, membraandoordringbare crosslinker.
- Het crosslinkt eiwitten binnen 12 angstroms van elkaar.
- Deze techniek verbetert de studie van tijdelijke eiwitinteracties.
- Immunoprecipitatie is een standaardmethode voor het isoleren van eiwitcomplexen.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor het crosslinken van eiwitten in gekweekte cellen.
- Om de isolatie van eiwitcomplexen voor verdere analyse te vergemakkelijken.
- Om het begrip van eiwitinteracties in vivo te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Cellen worden geïncubeerd met 1 mM DSP in PBS of DMSO.
- Cellen worden na het crosslinken gelyseerd.
- Immunoprecipitatie wordt uitgevoerd met standaardcontroles.
- Eiwitcomplexen worden geïsoleerd voor analyse.
Belangrijkste resultaten
- De crosslinkmethode stabiliseert effectief eiwitinteracties.
- Geïsoleerde eiwitcomplexen kunnen worden geanalyseerd met behulp van strenge zuiveringstechnieken.
- Deze aanpak maakt de studie van tijdelijke interacties in een gecontroleerde omgeving mogelijk.
- Resultaten demonstreren de bruikbaarheid van DSP in eiwitcomplexonderzoek.
Conclusies
- De DSP-crosslinktechniek is een waardevol hulpmiddel voor onderzoekers.
- Het verbetert de mogelijkheid om eiwitinteracties in vivo te bestuderen.
- Deze methode kan leiden tot nieuwe inzichten in celbiologie en neurowetenschappen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Isolation of labile multi-protein complexes using in vivo cross-linking and immuno-magnetic affinity chromatography addresses a critical gap in capturing transient or weak protein interactions that underpin cellular machinery. This capability enhances predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking at early discovery and preclinical inflection points. The method supports robust portfolio decisions by enabling the identification of protein networks that are otherwise inaccessible to standard purification workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Stabilizes transient protein interactions to clarify functional protein networks around targets of interest.
- Enables mechanistic de-risking by capturing weak or dynamic associations critical for pathway interrogation.
- Supports predictive confidence in target validation by providing access to otherwise labile complexes.
Screening & Assay Development
- Prepares validated protein complexes for downstream immunoblot or mass spectrometry analysis.
- Facilitates assay standardization by enabling reproducible isolation of protein assemblies.
- Enables quantitative assessment of protein-protein interactions for reliable compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker discovery by preserving native protein complexes for identification.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by supporting the study of disease-relevant protein networks.
- Reduces biological risk in preclinical models by ensuring detection of physiologically relevant interactions.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical research, enabling robust characterization of protein complexes at each stage.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by stabilizing and isolating labile protein assemblies.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for downstream immunoblot and mass spectrometry workflows.
- Analytics: Provides measurable readouts of protein complex composition, enabling comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Preserves disease-relevant complexes for biomarker alignment and preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable platform for repeated use across diverse targets and cell systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes isolation of protein complexes, improving reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein chemistry, immunoprecipitation, and analytical techniques such as western blot and mass spectrometry.
- Needs access to cross-linking reagents, magnetic bead platforms, and cold-chain infrastructure for sample preservation.
- Demands rigorous cross-team standardization of controls and analytical protocols.
- Adaptable to various cultured cell systems but may require empirical optimization for each target or model.
- Limited to interactions within the cross-linker’s spacer arm and may not capture all relevant associations.
