Name: Hi-C: een methode om de driedimensionale architectuur van genoom-onderzoek. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-06T17:00:00.000+00:00
Duration: 22 min 27 s
Description: Leer de Hi-C-methode voor genomische architectuur met proximiteitsligatie en sequencing. Deze techniek onthult chromatine-interacties en chromosoomterritoria voor inzicht in genregulatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken A. Kosmrlj voor discussies en code, AP Aiden, XR Bao, M. Brenner, D. Galas, W. Gosper, A. Jaffer, A. Melnikov, A. Miele, G. Giannoukos, C. Nusbaum, AJM Walhout , L. Wood, en K. Zeldovich voor discussies en L. Gaffney en B. Wong voor hulp bij visualisatie. Ondersteund door een Fannie en John Hertz Stichting afgestudeerd gemeenschap, een National Defense Science and Engineering gediplomeerde gemeenschap, een NSF afgestudeerd gemeenschap, het National Space Biomedisch Onderzoeksinstituut, en het verlenen van nee. T32 HG002295 van de National Human Genome Research Institute (NHGRI) (EL); i2b2 (Informatica voor de integratie van biologie en het bed), de NIH ondersteunde Center for Biomedical Computing aan de Brigham and Women&#39;s Hospital (LAM), kennen geen. HG003143 van de NHGRI, en een Keck Foundation onderscheiden jonge geleerde award (JD). Raw en in kaart gebracht Hi-C sequence data is gedeponeerd bij het ​​GEO-database ( <a href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/">www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/</a> ), de toetreding niet. GSE18199. Extra visualisaties zijn beschikbaar op <a href="http://hic.umassmed.edu">http://hic.umassmed.edu</a> .

<ol><li>Lieberman-Aiden, E., Van Berkum, N. L., Williams, L., Imakaev, M., Ragoczy, T., Telling, A., Amit, I., Lajoie, B. R., Sabo, P. J., Dorschner, M. O., Sandstrom, R., Bernstein, B., Bender, M. A., Groudine, M., Gnirke, A., Stamatoyannopoulos, J., Mirny, L. A., Lander, E. S., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326, 289-293 (2009).</li>
<li>Kosak, S. T., Groudine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Form+follows+function%3A+the+genomic+organization+of+cellular+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Dev%22%5BJournal%5D)">Form follows function: the genomic organization of cellular differentiation.</a> Genes and Dev. 18, 1371-1384 (2004).</li>
<li>Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+the+sequence%3A+cellular+organization+of+genome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Beyond the sequence: cellular organization of genome function.</a> Cell. 128, 787-800 (2007).</li>
<li>Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Regulation+in+the+Third+Dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene Regulation in the Third Dimension.</a> Science. 319, 1793-1794 (2008).</li>
<li>Cremer, T., Cremer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+territories%2C+nuclear+architecture+and+gene+regulation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells.</a> Nat Rev Genet. 2, 292-301 (2001).</li>
<li>Sexton, T., Schober, H., Fraser, P., Gasser, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulation+through+nuclear+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+and+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene regulation through nuclear organization.</a> Nat Struct and Mol Biol. 14, 1049-1055 (2007).</li>
<li>Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+Chromosome+Conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Capturing Chromosome Conformation.</a> Science. 295, 1306-1311 (2002).</li>
<li>Zhao, Z., Tavoosidana, G., Sjölinder, M., Göndör, A., Mariano, P., Wang, S., Kanduri, C., Lezcano, M., Sandhu, K. S., Singh, U., Pant, V., Tiwari, V., Kurukuti, S., Ohlsson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+chromosome+conformation+capture+%284C%29+uncovers+extensive+networks+of+epigenetically+regulated+intra-+and+interchromosomal+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Circular chromosome conformation capture (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra- and interchromosomal interactions.</a> Nat Genet. 38, 1341-1347 (2006).</li>
<li>Simonis, M., Klous, P., Splinter, E., Moshkin, Y., Willemsen, R., de Wit, E., van Steensel, B., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+organization+of+active+and+inactive+chromatin+domains+uncovered+by+chromosome+conformation+capture-on-chip+%284C%29+uncovers+extensive+networks+of+epigenetically+regulated+intra-+and+interchromosomal+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Nuclear organization of active and inactive chromatin domains uncovered by chromosome conformation capture-on-chip (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra- and interchromosomal interactions.</a> Nat Genet. 38, 1348-1354 (2006).</li>
<li>Dostie, J., Richmond, T. A., Arnaout, R. A., Selzer, R. R., Lee, W. L., Honan, T. A., Rubio, E. D., Krumm, A., Lamb, J., Nusbaum, C., Green, R. D., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+Conformation+Capture+Carbon+Copy+%285C%29%3A+A+massively+parallel+solution+for+mapping+interactions+between+genomic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Chromosome Conformation Capture Carbon Copy (5C): A massively parallel solution for mapping interactions between genomic elements.</a> Genome Res. 16, 1299-1309 (2006).</li>
<li>Miele, A., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+Cis-+and+Trans+Chromatin+Interaction+Networks+Using+Chromosome+Conformation+Capture+%283C%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mapping Cis- and Trans Chromatin Interaction Networks Using Chromosome Conformation Capture (3C).</a> Methods Mol Biol. 464, 105-121 (2009).</li>
<li>Maccallum, I., Przybylski, D., Gnerre, S., Burton, J., Shlyakhter, I., Gnirke, A., Malek, J., McKernan, K., Ranade, S., Shea, T. P., Williams, L., Young, S., Nusbaum, C., Jaffe, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALLPATHS+2%3A+small+genomes+assembled+accurately+and+with+high+continuity+from+short+paired+reads%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol+%22%5BJournal%5D)">ALLPATHS 2: small genomes assembled accurately and with high continuity from short paired reads.</a> Genome Biol . 10, R103-R103 (2009).</li>
</ol>

Een voorlopige patent op de Hi-C-methode (no. 61/100, 151) wordt momenteel herzien.

We presenteren een methode voor het bestuderen van de 3-dimensionale architectuur van het genoom in kaart brengen van chromatine interacties in een onpartijdige, genoom-brede manier. De meest kritische experimentele stap wat stelt deze technologie, afgezien van eerder werk - is de incorporatie van gebiotinyleerde nucleotiden aan de beperking uiteinden van verknoopt fragmenten voor stompe-end-ligatie. Het uitvoeren van deze stap met succes maakt diepe sequentie van alle ligatie knooppunten, en geeft Hi-C zijn omvang en kracht. Het aantal gelezen zal uiteindelijk bepalen de resolutie van de interactie kaarten. Hier is een 1 Mb interactie kaart voor het menselijke genoom gepresenteerd met behulp van ~ 30 miljoen alignable leest. Om de &#39;all-purpose&#39; resolutie te verhogen met een factor van n, moet het aantal gelezen worden verhoogd met een factor van n 2. De Hi-C techniek kan gemakkelijk worden gecombineerd met andere technieken, zoals hybride vast te leggen na de bibliotheek generatie (tot specifieke delen van het genoom doel) en chromatine immunoprecipitatie na ligatie (om de chromatine-omgeving van regio&#39;s in verband met specifieke eiwitten te onderzoeken).

<table><tbody><tr><td>Proteaseremmers</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340-5ml</td><td>Stap 1.2</td></tr><tr><td>biotine-14-dCTP</td><td>Invitrogen</td><td>19518-018</td><td>Stap 1.6</td></tr><tr><td>Klenow</td><td>New England Biolabs</td><td>M0210</td><td>Stappen 1.6 en 2.2</td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>Invitrogen</td><td>15224</td><td>Stap 1.9</td></tr><tr><td>T4 DNA polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203</td><td>Stappen 1.17 en 2.2</td></tr><tr><td>10x ligatiebuffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B0202</td><td>Stappen 2.2 en 3.4</td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201</td><td>Stap 2.2</td></tr><tr><td>Klenow (exo-)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212</td><td>Stap 2.3</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavin C1 Beads</td><td>Invitrogen</td><td>650.01</td><td>Stap 3.2</td></tr><tr><td>T4 DNA ligase HC</td><td>Enzymatics</td><td>L603-HC-L</td><td>Stap 3.5</td></tr><tr><td>Phusion HF mastermix</td><td>New England Biolabs</td><td>F531</td><td>Stap 3.8</td></tr><tr><td>Ampure beads</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>A2915</td><td>Stap 3.9</td></tr></tbody></table>

hi-c: een methode om de driedimensionale architectuur van genoom-onderzoek.

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

De drie-dimensionale vouwen van chromosomen compartmentalizes het genoom en en kan brengen verre functionele elementen, zoals promotors en enhancers, in nauwe ruimtelijke nabijheid 2-6. Het ontcijferen van de relatie tussen de organisatie en de chromosoom genoom activiteit zal helpen bij het begrijpen genomische processen, zoals transcriptie en replicatie. Er is echter weinig bekend over hoe chromosomen vouwen. Microscopie is niet in staat om grote aantallen loci gelijktijdig of met een hoge resolutie te onderscheiden. Tot op heden, de detectie van chromosomale interacties met behulp van chromosoom exterieur capture (3C) en de latere aanpassingen nodig zijn de keuze van een set van target loci, het maken van genoom-brede studies onmogelijk 7-10. We ontwikkelden Hi-C, een uitbreiding van 3C die in staat is de identificatie van long range interacties in een onpartijdige, genoom-brede manier. In Hi-C worden de cellen gefixeerd met formaldehyde, waardoor interactie loci te zijn met elkaar verbonden door middel van covalente DNA-eiwit cross-links. Wanneer het DNA vervolgens wordt gefragmenteerd met een restrictie-enzym, blijven deze loci gekoppeld. Een gebiotinyleerde residu wordt opgenomen als de 5 &#39;overhang zijn ingevuld Next, stomp-end ligatie wordt uitgevoerd onder omstandigheden die ligatie te verdunnen gebeurtenissen tussen cross-linked DNA-fragmenten voor. Dit resulteert in een genoom-brede bibliotheek van ligatieproducten, wat overeenkomt met paren van fragmenten die oorspronkelijk werden dicht bij elkaar in de kern. Elk ligatie product is voorzien van biotine op de plaats van de kruising. De bibliotheek is geschoren, en de knooppunten zijn-afgebroken met streptavidine kralen. De gezuiverde knooppunten kan vervolgens worden geanalyseerd met behulp van een high-throughput sequencer, wat resulteert in een catalogus van op elkaar inwerkende fragmenten. Directe analyse van de resulterende contact matrix toont vele functies van de genomische organisatie, zoals de aanwezigheid van chromosoom gebieden en de preferentiële vereniging van kleine gen-rijke chromosomen. Correlatie analyse kan worden toegepast op de contact matrix, waaruit blijkt dat het menselijk genoom is gescheiden in twee compartimenten: een minder dicht op elkaar gepakt compartiment met open, toegankelijk en actieve chromatine en een meer dichte compartiment met gesloten, ontoegankelijke, en inactieve chromatine regio&#39;s. Tot slot, ensemble analyse van het contact matrix, in combinatie met theoretische afleidingen en computationele simulaties bleek dat op de schaal van megabase Hi-C heeft in overeenstemming met een fractal globule conformatie onthult.

De Hi-C methode maakt het mogelijk onpartijdige, genoom-brede identificatie van chromatine interacties (1). Hi-C paren nabijheid ligatie en massaal parallelle sequencing. De resulterende gegevens kunnen worden gebruikt om de genomische architectuur studeren op meerdere schalen: eerste resultaten geïdentificeerd functies zoals chromosoom gebieden, scheiding van open en gesloten chromatine, en chromatine structuur op de megabase schaal.

Hi-C: een methode om de driedimensionale architectuur van genoom-onderzoek.

De driedimensionale vouwing van chromosomen compartmentaliseert het genoom en kan verafgelegen functionele elementen, zoals promoters en enhancers, ...

Hi-C is een methode om lange-afstandsinteracties van chromatine op een onbevooroordeelde manier over het gehele genoom te identificeren. Eerst worden cellen gefixeerd met formaldehyde, waarna de cellen worden gelyseerd en het DNA vervolgens wordt gefragmenteerd met een restrictie-enzym. Vervolgens wordt een gebiotineerd residu ingebouwd terwijl de vijf-prime overhangs stomp worden opgevuld en de ligatie wordt uitgevoerd onder verdunde condities die ligatie-gebeurtenissen tussen cross-links en DNA-fragmenten bevorderen.De bibliotheek wordt gefragmenteerd en de juncties worden neergeslagen met strep-havein-beads. De gezuiverde juncties kunnen vervolgens worden geanalyseerd met een high-throughput sequencer, wat resulteert in een catalogus van interagerende fragmenten. Deze resultaten bieden ons inzicht in de vouwing van chromatine, waarbij de aanwezigheid van chromosoomterritoria, de compartimentalisering van het genoom in open en gesloten chromatine en bewijs voor de Fractal Globule-organisatie op megabase-schaal worden onthuld.Hoi, ik ben Nka Van Bergham van het Laboratory Field Decker in het programma voor genfunctie en -expressie aan de University of Massachusetts Medical School. Hoi, ik ben Ez Lieberman Aiden van het laboratorium van Eric Lander aan het Broad Institute van Harvard en het Massachusetts Institute of Technology. Ik ben Louis Williams van de groep moleculaire biologie R&amp;D aan het Broad Institute. En dan Maxima Mackay van het laboratorium van Len Muni van het Massachusetts Institute of Technology.Vandaag laten we u een procedure zien voor genoombrede chromosoombevestigingscapture genaamd Hi-C. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de architectuur van het menselijk genoom experimenteel te onderzoeken. Het eerste deel van de procedure dat we u zullen tonen, vindt plaats bij de UMass Medical School en het tweede deel zal worden uitgevoerd bij het Broad Institute. We laten u ook zien hoe we de resultaten van het Hi-C experiment hebben gebruikt om de dynamiek van het genoom te simuleren bij MIT.Laten we beginnen. Laten we beginnen. Hi-C begint met het crosslinken van cellen, wat een gebruikelijke methode is bij chromosome conformation capture.Begin met het kweken van tussen de 10⁷ en 2,5 × 10⁷ zoogdiercellen, hetzij in een Durant of in suspensie, en crosslink de cellen. Lyseer de cellen in 550 µL lysbuffer met behulp van een homogenisator. Centrifugeer het chromatine bij 5.000 RPM en was het pellet tweemaal met 500 µL NEB buffer 2. Verdeel dit over vijf genummerde buisjes en voeg NEB buffer 2 toe tot een eindvolume van 362 µL.Voeg voorzichtig 38 µL van de 1% SDS-mix toe en incubeer gedurende 10 minuten bij 65 °C. Plaats de buisjes onmiddellijk terug op ijs en stop de SDS-reactie door 44 µL Triton X 100 toe te voegen, zorgvuldig gemengd met 400 units HindIII, en incubeer dit gedurende de nacht bij 37 °C onder rotatie. De volgende stappen zijn specifiek voor Hi-C en omvatten het markeren van de DNA-uiteinden met biotine en het uitvoeren van blunt-end ligatie van de cross-linked fragmenten.Deze stap maakt het mogelijk om de ligatieverbindingen later in de buis te zuiveren. Deze buis mag de biotine-elutie-stap niet ondergaan en dient in plaats daarvan als controle voor de drie C's om te garanderen dat de digestie- en ligatiecondities optimaal waren om de overhangs van de restrictiefragmenten in te vullen en de DNA-uiteinden in de overige vier buizen met biotine te markeren. Voeg dATP, dGTP en dTTP toe aan buis twee tot en met vijf.Voeg daarna biotinyl-DCTP en Klino toe. Meng zorgvuldig en incubeer gedurende 45 minuten bij 37 °C. Plaats de buizen na incubatie op ijs en voeg vervolgens 86 µL 10% SDS toe aan alle buizen om de enzymen te inactiveren.Incubeer de buizen bij 65 °C gedurende precies 30 minuten en plaats ze direct daarna op ijs. Om ligatiegebeurtenissen tussen cross-linked fragmenten te bevorderen, wordt de ligatie uitgevoerd onder extreem verdunde condities. Voeg, terwijl u op ijs werkt, 7,61 milliliter ligatiemengsel toe aan elk van de vijf buizen van 15 milliliter.Overbreng vervolgens elk verteerd chromatine-mengsel naar de overeenkomstige buis. Voeg 10 µL T4 DNA-ligase toe aan buis één om een reguliere 3C-ligatie uit te voeren. Voeg daarna 50 µL T4 DNA-ligase toe aan buizen twee tot vijf om een blunt-end high-C ligatie uit te voeren.Meng de buisjes door ze om te keren en incubeer deze gedurende vier uur bij 16 °C. Degradeer na incubatie het eiwit en keer de CNA-crosslinking om door 50 µL proteinase K per buisje toe te voegen en de buisjes overnacht te incuberen bij 65 °C. Voeg de volgende dag nogmaals 50 µL proteinase K per buisje toe en incubeer verder bij 65 °C gedurende nog twee uur.Noem de reactiemengsels en breng ze over naar vijf conische buizen van 50 milliliter. Purificeer het DNA in deze buizen door een fenolextractie uit te voeren. Voeg 10 milliliter fenol toe en vortex gedurende twee minuten.Centrifugeer de buizen 10 minuten bij 3.500 RPM en breng voorzichtig zoveel mogelijk van de waterige fase over naar een nieuwe buis van 50 milliliter. Herhaal de extractie met fenol-chloroform en precipiteer het DNA met ethanol. Na centrifugatie van het met ethanol geprecipiteerde DNA wordt elk DNA-pellet opgelost in 450 microliters 1X TE-buffer en overgebracht naar een centrifugeerbuis van 1,7 milliliter. Een volgende zuiveringsronde wordt uitgevoerd door twee fenol-chloroform-extracties te doen met 500 microliters fenol-chloroform; vortexeer gedurende één minuut, centrifugeer de buizen vijf minuten bij 14.000 RPM en breng na de tweede extractie de waterige fase over naar een nieuwe buis.Het DNA wordt geprecipiteerd met ethanol. Na het centrifugeren van het geprecipiteerde DNA wordt elke DNA-pellet één keer gewassen met 70% ethanol en vervolgens resuspendeerd in 25 µL one XT-buffer. Bouw eventueel aanwezig RNA af door één µL RNase A per buis toe te voegen en de buizen 30 minuten te incuberen bij 37 °C. Combineer de inhoud van buis twee tot en met vijf, terwijl buis één apart wordt gehouden als 3 C-controle.Nu is een goed moment om de kwantiteit en kwaliteit van de libraries te onderzoeken door een aliquot te draaien in een 0,8% AASE-gel; de ligatie-efficiëntie van Hi-C dient te worden geëvalueerd met een PCR-digestie-assay. De creatie van blunt ends en de ligatie die in de Hi-C-procedure zijn uitgevoerd, creëren restrictieplaatsen voor de endonuclease in HE1; geamplificeerde fragmenten van de drie-C en Hi-C libraries kunnen worden gedigesteerd met HindIII en NHE1 om te bepalen hoe goed de blunt ends zijn gegenereerd; sommige fragmenten zullen niet zijn geligeerd. Verwijder biotine van deze niet-geligeerde uiteinden met behulp van de exonuclease-activiteit van T4 DNA-polymerase, zoals beschreven in het geschreven protocol.Zuiver het DNA opnieuw met behulp van fenol-chloroformextractie en ethanolprecipitatie en resuspendeer de DNA-pellets in een totaal volume van 100 µL water. Als het monster de kwaliteitscontroles heeft doorstaan, gaat het protocol verder met bio-temple down en sequencing. Dank u.Om het BIOTINYLATED DNA geschikt te maken voor high-throughput sequencing, moet het DNA worden geshearred tot een grootte van 300 tot 500 baseparen met een CAVAS S twee instrument. De uiteinden van het DNA worden gerepareerd door toevoeging van 10 x lation buffer, DN TPS, T four DNA polymerase, T four POLYNUCLEOTIDE kinase, clear now DNA polymerase en water. Incubeer de monsters gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Gebruik na incubatie een Kaya Gym MinLu kolom om het DNA te zuiveren volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Nadat het DNA op de kolom is geladen en de kolom is gewassen, wordt het DNA tweemaal geëlueerd met 50 µL van één XTLE buffer; voeg vervolgens DATP toe aan de 3'-uiteinden van het end-repaired DNA door toevoeging van 10 XNEB buffer, twee DATP, water en exonuclease-deficient cile fragment.Incubeer de reactie 30 minuten bij 37 °C om het cile-fragment te inactiveren. Incubeer de reacties 20 minuten bij 65 °C en zet de reacties vervolgens op ijs met een speed vac om de reactievolumes te reduceren tot 20 µL. Laad daarna het DNA in een 1,5% agarosegel met 1X TAE en laat dit 3,5 uur lopen bij 80 tot 90 V.Snijd DNA-fragmenten tussen 300 en 500 baseparen uit en zuiver deze met een Qiagen gel-extractiekit met behulp van twee tot vier kolommen, afhankelijk van het gewicht van de gel. Voeg de eluanten van de QIAquick-kolommen samen en vul het uiteindelijke volume aan tot 300 µL met 1X TE-buffer. Bepaal tenslotte de DNA-concentratie met de QU-assay met behulp van de Qubit en bereken de totale hoeveelheid DNA in dit gedeelte van het protocol.Ligatieverbindingen worden gezuiverd uit de DNA-pool, waardoor interactieve chromatinefragmenten efficiënt kunnen worden geïdentificeerd via paired-end sequencing. Voer alle volgende stappen uit in DNA low bind-buisjes. Bereid de beads voor voor biotine.Voer een pull-down uit door 150 µL geresuspendeerde magnetische strep A-beads tweemaal te wassen met 400 µL one x tween-buffer. Toekomstige wasstappen bestaan uit vijf stappen: het toevoegen van buffer aan de beads, het overbrengen van het mengsel naar een nieuwe buis, het roteren van het monster gedurende drie minuten bij kamertemperatuur en het terugwinnen van de beads met behulp van een magnetische partikelconcentrator.Ik verwijder het supernatant. Resuspendeer de beads in 300 µL 2x no-Tween-buffer en voeg 300 µL high cDNA toe. Laat het biotinylerede high cDNA binden aan de strep-beads door het mengsel 15 minuten bij kamertemperatuur onder rotatie te incuberen.Herwin het aan de beads gebonden DNA-strp A met een magnetische partikelconcentrator en verwijder het supernatant. Was de beads met 400 µL 1x no tween buffer, gevolgd door 100 µL 1x ligation buffer. Resuspendeer de beads in 50 µL 1x ligation buffer en breng het mengsel over naar een nieuwe buis.Om het DNA voor Illumina paired-end sequencing voor te bereiden, neemt u de totale hoeveelheid DNA-input van de gebruiker voor de biotin pull-down, die eerder is berekend met de quant assay, en deelt u deze door 20 om de hoeveelheid high cDNA te schatten die is neergeslagen en beschikbaar is voor ligatie. Voeg zes pmol Illumina paired-end adapters toe per microgram cDNA dat beschikbaar is voor ligatie. Gebruik 1.200 units T4 DNA-ligase om de adapters aan het DNA te ligeren.Incubeer twee uur bij kamertemperatuur. Verwijder niet-geligeerde paired-end adapters door de beads waaraan het cDNA is gebonden terug te winnen en de beads twee keer te wassen met 400 µL van een 1x Tween-buffer. Was de beads met 200 µL van een 1x buffer zonder Tween, gevolgd door 200 µL en vervolgens 50 µL van een 1x NEB-buffer.Twee na de laatste wasbeurt. Resuspendeer de beads in 50 µL van een NEB-buffer twee en breng deze over naar een nieuwe buis. Om het aantal cycli te bepalen dat nodig is om voldoende PCR-product voor sequencing te genereren.Stel vier test-PCR-reacties op met 6, 9, 12 of 15 cycli. Bepaal het optimale aantal cycli door de PCR-reacties uit te voeren op een 5% polyacrylamidegel en te kleuren met cyber green, waarbij moet worden gecontroleerd op de afwezigheid van spookbanden en de aanwezigheid van een smear tussen 400 600 basenparen, wat de lengte is van de gedeelde producten na ligatie aan de adapters; amplificeer de rest van de high C-library round stripped, die in beads zitten, in een grootschalige PCR met het optimale aantal PCR-cycli. Haal de PCR-producten uit de afzonderlijke wells en win de beads terug.Houd 1% van de PCR-producten op grote schaal apart om op een gel te analyseren en zuiver het resterende deel van het PCR-product met 1,8 maal het volume aan pure beads volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Elueer het DNA met 50 µL 1X TE-buffer en vergelijk 1% van het met PU-beads gezuiverde PCR-product met het aliquot van 1% van het oorspronkelijke PCR-product op een 5% polyacrylamidegel. Na bevestiging van de succesvolle verwijdering van de PCR-primersequentie, wordt de high-C-library met Illumina paired-end sequencing geanalyseerd door elk uiteinde onafhankelijk uit te lijnen met behulp van MAC om interagerende chromatinefragmenten te identificeren.De volgende resultaten worden verwacht wanneer het high C-protocol technisch correct wordt uitgevoerd en kunnen worden beschouwd als kwaliteitscontrole-standaarden. De kwaliteitscontroles moeten uitwijzen dat zowel de three C- als de high C-bibliotheken verschijnen als vrij strakke banden groter dan 10 kilo bases. Een DNA-smear duidt op een lage ligatie-efficiëntie.Over het algemeen is de ligatie-efficiëntie in een High-C library iets lager vergeleken met een 3C-template. High-C markering en ligatie-efficiëntie kunnen worden geschat door digestie van een 3C-PCR-product. 3C-junctions worden geknipt door Hindi III, maar niet door NHE I.Het omgekeerde is waar voor juncties met een hoog C-gehalte. Deze PCR-digestie-assay laat zien dat 70% van de amplicons met een hoog C-gehalte worden geknipt door NHE one en niet door HI Hindi.Drie. Ter bevestiging van de efficiënte markering van ligatiejuncties moet de analyse van de gesequentiede reads aantonen dat reads van zowel intrachromosomale als interchromosomale interacties, aangegeven door de blauwe en rode lijnen, significant dichter bij Hindi drie restrictieplaatsen aligneren vergeleken met willekeurig gegenereerde reads, weergegeven in het groen.In een succesvol experiment vertegenwoordigt 55% van de aligneerbare read-paren interchromosomale interacties. 15% vertegenwoordigt intrachromosomale interacties tussen fragmenten die minder dan 20 kilobases van elkaar afliggen, en 30% zijn intrachromosomale read-paren die meer dan 20 kilobases van elkaar afliggen. Deze distributie kan vóór high-throughput sequencing worden bemonsterd als een vorm van kwaliteitscontrole.Het klonen en Sanger-sequensen van ongeveer 100 klonen is doorgaans voldoende. De chromatine-interacties kunnen worden gevisualiseerd als een heat map, waarbij de x- en y-as de genomische positie vertegenwoordigen en elke pixel het aantal waargenomen interacties tussen deze posities aangeeft. Over het algemeen zullen DNA-fragmenten die in het lineaire genoom zeer dicht bij elkaar liggen, de neiging hebben om frequent met elkaar te interageren.Dit is zichtbaar in de intrachromosomale kaarten of heatmaps als een prominente diagonaal. De volgende resultaten tonen verschillende manieren om de gegevens te analyseren om diverse niveaus van genoomorganisatie te onthullen. Het uitzetten van de contactwaarschijnlijkheid tegenover de genomische afstand laat zien dat de waarschijnlijkheid van contact afneemt als functie van de genomische afstand, om uiteindelijk bij elke afstand een plateau te bereiken.Intrachromosomale interacties, weergegeven door de doorlopende lijn, zijn verrijkt ten opzichte van interchromosomale interacties, weergegeven door de stippellijnen. Dit impliceert direct de aanwezigheid van chromosoomterritoria; de berekening van het geobserveerde versus het verwachte aantal interchromosomale contacten tussen alle chromosoomparen onthult een preferentiële associatie tussen specifieke chromosoomparen. Kleine, genrijke chromosomen interageren bij voorkeur met elkaar, wat wordt aangegeven door de helderrode kleur.Individuele chromosomen kunnen ook worden onderzocht. De ruwe heatmap kan worden aangepast aan de hand van een verwachte heatmap om rekening te houden met de genomische afstand tussen paren loci, wat resulteert in een heatmap van de geobserveerde versus de verwachte waarden. Vervolgens kan een correlatiematrix worden gegenereerd door de rijen en kolommen van de heatmaps van de geobserveerde versus de verwachte waarden met elkaar te correleren.Met behulp van correlatieanalyse is aangetoond dat het menselijk genoom is verdeeld in twee compartimenten. Dit wordt geïllustreerd door het ruitpatroon. In de correlatie-heatmaps met gebruik van high C-data werden nieuwe inzichten verkregen in de chromatinvouwing op megabase-schaal.Een gewoon polymeermodel van chromatineverpakking zou suggereren dat chromatine wordt verpakt in een equilibrium GLO. Het plotten van de contactwaarschijnlijkheid als functie van de afstand illustreert dat de contactwaarschijnlijkheid schaalt als een machtswet met de genomische afstand, waarvan de helling ongeveer min één is. Dit is niet consistent met het gedrag van een equilibrium Glo, maar komt wel overeen met de verwachtingen voor een alternatieve structuur die bekend staat als een fractale glo. Hier worden twee gular structuren getoond.De kleur correspondeert met de afstand vanaf één uiteinde, variërend van blauw naar cyaan-groen, geel, oranje en rood. En net als bij equilibriumglobules ontbreken in een fractale Glo verstrengelingen in fractale globules. Loci die langs de contour dicht bij elkaar liggen, hebben de neiging om in 3D dicht bij elkaar te liggen, wat leidt tot de aanwezigheid van monochromatische blokken.Dergelijke blokken worden niet aangetroffen in de equilibrium Glo. Het gebrek aan verstrengelingen kan ook worden aangetoond door de kracht die de globules beperkt weg te nemen; wanneer de globules mogen expanderen, decondenseert de fractale glo snel. De equilibrium Glo doet dit niet, omdat deze te sterk verknoopt is.We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u een analyzer high C-bibliotheek maakt. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de juiste controles uit te voeren om een efficiënte high C-ligatie en zuivering te waarborgen. Het aantal reads zal uiteindelijk de resolutie van de interactiekaarten bepalen.We hebben ongeveer 30 miljoen reads gebruikt om interactiekaarten van het menselijk genoom te genereren met een resolutie van ongeveer één megabase. Om de resolutie met een factor N te verhogen, moet het aantal reads met een factor n kwadraat worden vermeerderd. Ik hoop dat u het leuk vindt om meer te leren over de structuur van het menselijk genoom.Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

hi-c-a-method-to-study-the-three-dimensional-architecture-of-genomes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De 3DNA softwarepakket is een populaire en veelzijdige bioinformatica tool met mogelijkheden om te analyseren, construeren, en drie-dimensionale nucleïnezuur structuren te visualiseren. Dit artikel presenteert gedetailleerde protocollen voor een subset van nieuwe en populaire functies die beschikbaar zijn in 3DNA, van toepassing op zowel individuele structuren en ensembles van verwante structuren.

Het analyseren en opbouwen nucleinezuurstructuren met 3DNA

We beschrijven een robuuste en veelzijdige protocol voor de analyse nucleaire architectuur door 3D DNA FISH met direct gelabelde fluorescerende probes.

Robuuste 3D DNA FISH behulp direct gemerkt Probes

Dit werk beschrijft een protocol voor het genereren van hoge resolutie in situ Hi-C bibliotheken van strak geënsceneerd pre gastrulatie Drosophila melanogaster embryo's.

Generatie van genoom-brede chromatine conformatie Capture bibliotheken uit strak geënsceneerde vroege Drosophila embryo 's

3D multicolor DNA FISH vertegenwoordigt een hulpmiddel om meerdere genomische loci binnen 3D bewaarde kernen te visualiseren, ondubbelzinnig definiëren d.m.v. hun wederzijdse interacties en lokalisatie binnen de nucleaire ruimte op één celniveau. Hier wordt een stap voor stap protocol beschreven voor een breed spectrum van menselijke primaire cellen.

3D Multicolor DNA FISH Tool om nucleaire architectuur in menselijke primaire cellen te bestuderen

Het genoom is georganiseerd in de nucleaire ruimte in verschillende structuren die kunnen worden onthuld door middel van chromosoom conformatie capture technologieën. De hi-c-methode in de kern biedt een genoombrede verzameling chromatine-interacties in Drosophila-cellijnen, die contactkaarten genereert die kunnen worden verkend met megabaseresolutie op beperkingsfragmentniveau.

Hi-C in nucleus in drosophilacellen

Hi-C 3.0 is een verbeterd Hi-C protocol dat formaldehyde en disuccinimidylglutaraat crosslinkers combineert met een cocktail van DpnII en DdeI restrictie enzymen om de signaal-ruisverhouding en de resolutie van chromatine interactie detectie te verhogen.

Chromosoomconformatie vastleggen over lengteschalen

Dit protocol beschrijft de Capture Hi-C-methode die wordt gebruikt om de 3D-organisatie van megagebaseerde gerichte genomische regio's met hoge resolutie te karakteriseren, inclusief grenzen van topologisch associërende domeinen (TAD's) en chromatine-interacties op lange afstand tussen regulerende en andere DNA-sequentie-elementen.

Ontcijferen van 3D-chromatineorganisatie met hoge resolutie via Capture Hi-C

Een protocol voor het in kaart brengen van de driedimensionale genoomorganisatie met nucleosoomresolutie met behulp van de genoomwijde chromosoomconformatie-capture-methode Micro-C-XL wordt hier gepresenteerd.

3D-genoominteracties van zoogdieren in kaart brengen met Micro-C-XL

Hier presenteren we een aanpassing van de chromosoomconformatie-capture (3C) -techniek in detail met de nadruk op betrokkenheid en leren van niet-gegradueerden.

Een A krijgen met de 3C's: chromosoomconformatie-opname voor studenten

Genexpressie wordt gereguleerd door interacties van genpromotors met distale regulerende elementen. Hier beschrijven we hoe low input Capture Hi-C (liCHi-C) de identificatie van deze interacties in zeldzame celtypen mogelijk maakt, die voorheen niet meetbaar waren.

Een geïntegreerde workflow om de promotor-centrische spatio-temporele genoomarchitectuur in schaarse celpopulaties te bestuderen

Hier presenteren we een protocol om RNA-geassocieerde chromatine DNA-DNA interacties vast te leggen voor het in kaart brengen van RNA-gerelateerde driedimensionale genoomorganisatie.

RNA-geassocieerde chromatine DNA-DNA interactie methode

Leer de Hi-C-methode voor genomische architectuur met proximiteitsligatie en sequencing. Deze techniek onthult chromatine-interacties en chromosoomterritoria voor inzicht in genregulatie.

Hi-C: een methode om de driedimensionale architectuur van genoom-onderzoek.

Meer video's verkennen