DNA-gebaseerde Vissoorten Identification Protocol

Het Fish Species Identification System is een eenvoudige, snelle en nauwkeurige DNA-gebaseerde methode om de vissoorten in een bepaald monster te identificeren. Vismonsters worden behandeld met proteinase K om nucleïnezuren in oplossing te brengen. Het genomische DNA van de vis wordt vervolgens geïsoleerd en PCR-amplificeerd met behulp van primers die zich binden aan sequenties die in alle visgenomen worden aangetroffen.

De PCR-producten worden vervolgens gedigesteerd met drie verschillende restrictie-enzymen en opgelost op de Agilent 2100 bioanalyzer. De fragmentlengten die in de digestiereacties worden geproduceerd, kunnen worden gebruikt om de vissoort te bepalen met behulp van restrictiefragmentlengtepolymorfisme, of RFLP patroonvergelijkende software. Hoi, ik ben Rachel Formosa van Agilent Technologies.

Vandaag zullen we u een procedure voor DNA-gebaseerde vissoortenidentificatie laten zien. Deze procedure is een screeningsmethode waarmee u de vissoorten kunt identificeren die aanwezig zijn in verse, bevroren, gemalen, gekookte, gedroogde of anderszins verwerkte monsters. En dit kan in minder dan één werkdag worden volbracht.

We gebruiken deze procedure om de echtheid van zeevruchten te bestuderen, wat erg belangrijk is voor de zeevruchtenindustrie omdat vervanging en mislabeling significante economische, milieu- en voedselveiligheidsgevolgen kunnen hebben. Bovendien kan het vooral moeilijk zijn om vissoorten te bepalen door visuele identificatie en andere traditionele methoden. Zodra een vis is verwerkt, levert DNA-testen een veel nauwkeuriger en betrouwbaarder resultaat op.

Dus laten we beginnen. Begin met het voorbereiden van monsters voor DNA-extractie door 10 tot 1000 milligram van elk rauw of gekookt visweefselmonster in 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes te plaatsen voor elke vis. Neem 220 microliter vers bereide proteinase case-oplossing en pipet op en neer.

Incubeer de buisjes 10 minuten bij 65 graden Celsius, volg de incubatie centrifuge gedurende drie tot vijf minuten bij 14.000 Gs om eventueel onverteerd weefsel te pelleteren. Breng vervolgens voorzichtig 150 microliter van elk supernatant over naar een nieuwe 1,5 milliliter buis, vermijd onverteerd materiaal aan de bodem en olieachtig materiaal aan de bovenkant. Het supernatant zal nu worden gebruikt voor genomische DNA-extractie.

Begin de genomische DNA-extractie door 500 microliter van de nucleïnezuurbindende buffer toe te voegen aan elk monster. Dit brengt het totale monstervolume naar 650 microliter. Vorm het monster tot het homogeen is.

Breng vervolgens elk monster over naar een DNA-bindende spincup die in een van de twee milliliter opvangbuisjes is geplaatst die in de kit zijn meegeleverd. Klep de dop van de buis op de bovenkant van de spincup. Laat de monsters een minuut draaien bij 14.000 Gs om het DNA op de spincupmatrix te laden.

Na het centrifugeren verwijdert u de spincups, gooit het filtraat weg en plaatst de cups terug in de opvangbuisjes. Voeg 500 microliter van een x hoge zout wasbuffer toe. Sluit de buisjes af en centrifugeer opnieuw na het centrifugeren.

Gooi het filtraat weg en plaats de spincups opnieuw in de opvangbuisjes. Voeg nu 500 microliter 80% ethanol toe. Sluit de buis af en draai een minuut bij 14.000 Gs.

Herhaal de ethanolwassing nog twee keer na de derde wassing in 80% ethanol, gooi de filtraten weg. Plaats de spincups terug in de opvangbuisjes en draai nu twee minuten om de vezelmatrix te drogen. Breng nu de spincups over naar 1,5 milliliter opvangbuisjes.

Voeg 100 microliter evolutiebuffer toe aan elke spincup direct op de vezelmatrix in de cup. Klep vervolgens de opvangbuisjes op de spincups en incubeer ze een minuut op kamertemperatuur. Na de incubatie draai de monsters een minuut op maximale snelheid.

Gooi vervolgens de spincup weg en sluit de buisjes af. Als de DNA-concentraties worden gemeten, worden concentraties verwacht variërend van vijf nanogram per microliter tot 500 nanogram per microliter. Het DNA kan nu worden bewaard bij vier graden Celsius gedurende maximaal één maand voor langdurige opslag, plaats het DNA bij min 20 of min 80 graden Celsius.

Voer PCR uit met behulp van de primers en reagentia die in het P-C-R-R-F-L-P reagentiakit zijn meegeleverd. Volgens het bijbehorende geschreven protocol wordt het aanbevolen om elk monster, inclusief de positieve anti-geensjablooncontrole in duplicaat te laten lopen terwijl de PCR loopt. Bereid restrictie-enzym mastermixen voor de digesties met DTE E een HAE drie en NL drie voor door de volgende componenten in de volgorde te combineren, 1,5 microliter steriele gedistilleerd water 0,5 microliter 10 x enzymbuffer en 0,5 microliter 10 x enzym.

Bereid voldoende voor alle monsters plus één reactievolume, overtollig fourex drie reagentimengen. Verdeel vervolgens 2,5 microliter over elk reactiebuisje gelabeld met de monster- en enzymnaam. Zodra de PCR klaar is, verwijder de monsters uit de thermische cycler en plaats ze op ijs.

Voeg 2,5 microliter van elk PCR-product toe aan elk van de drie restrictiedigestbuisjes voor die reactie. DDE een HAE drie en NLA drie. Vorm het mengsel vervolgens.

Centrifugeer kort en incubeer de digesties gedurende twee uur bij 37 graden Celsius. Als het handiger is, kunnen de digesties ook 's nachts worden geïncubeerd. Na de digestie worden de reacties gedurende 15 minuten bij 65 graden Celsius geïncubeerd.

Voeg vervolgens een microliter van 60 millimolair EDTA toe aan elk buisje om de reactie te beëindigen en vorm het mengsel. Gebruik de Agilent bioanalyzer reagentiakit om de restrictiedigest voor te bereiden en laad deze in de putjes van een DNA-chip volgens de handleiding van de kit. Voor elk monster moeten alle drie de digesten op dezelfde chip worden geladen.

Vorm vervolgens het chip en laad het in de machine. Nadat de run is voltooid, gaat u naar de assaycontext en selecteert u het chipsamenvattingstabblad. Voer in het veld voor monsternaam een monsternaam in voor alle 12 putjes van de chip om de vissoorten voor de test-DNA-monsters te identificeren.

Start het RFLP-decoderprogramma door op bestand te