Name: DNA-gebaseerde Vissoorten Identification Protocol (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-28T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Leer een DNA-gebaseerde methode voor vissoortenidentificatie met PCR, restrictie-enzymvertering en RFLP-analyse op een bioanalyzer. Dit protocol verbetert de betrouwbaarheid van seafood-authenticiteitstests aanzienlijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Agilent Stratagene Products Division <ul><li> Harini Ravi </li><li> Natalia Novorodovskaya </li><li> Scott Basehore </li><li> Jeff Braman </li><li> Rachel Formosa </li><li> Ronda Allen </li><li> Rajesh Bagga </li><li> Derek Hall </li><li> Sarah JANDLE </li><li> Danielle Huffman </li></ul> Agilent Laboratories <ul><li> Robert Kincaid </li><li> Mary McBride </li></ul> Agilent Europa <ul><li> Nigel Skinner </li><li> Juergen Schneider </li><li> Stephen Mueller </li><li> Martin Kratzmeier </li></ul> Campden BRI <ul><li> Steve Garrett </li></ul>

1: Maak de vis monsters voor DNA-extractie <ol><li> Voor elke vis te testen monster, een stukje weefsel van de vis, met een gewicht tussen 10 mg en 1 g (rauw of gekookt), in een enkele 1,5-ml microcentrifugebuis. Gebruik de onderstaande figuur als een leidraad voor het schatten van het gewicht van een rauwe vis steekproef op basis van de steekproefomvang. <img src="/files/ftp_upload/1871/1871fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="figuur 1"> Figuur 1. Massa Schattingen van Fish monsters op basis van de steekproefomvang. </li><li> Pre-warm het proteïnase K spijsvertering Buffer tot 65 ° C gedurende 5 minuten in een couveuse of waterbad. </li><li> Bereid een werkende oplossing van proteïnase K door het combineren van 200 ul van proteïnase K Spijsvertering Buffer en 20 ul van proteïnase K per monster. Let op: Maak een nieuw werkende oplossing van proteïnase K voor elk gebruik. </li><li> Voeg 220 ul van het proteïnase K werkende oplossing voor elke 1,5 ml tube van vis monster. Incubeer de buizen bij 65 ° C gedurende 10 minuten in een couveuse of waterbad. </li><li> Spin de buizen in een microcentrifuge voor de 3 5 minuten bij 14.000 xg te pellet een onverteerd weefsels. </li><li> Overdracht 150 ul van elk supernatant in een verse 1,5-ml-buis. Vermijd de overdracht van een onverteerd materiaal uit de bodem van de buis of een olieachtige stof die aanwezig kunnen zijn aan de bovenkant van de buis. Deze buizen van supernatant worden de monsters uit die genomische DNA zal worden geëxtraheerd. </li></ol> 2: Extract Genomic DNA <ol><li> In een steriele container (polypropyleen buis of glazen fles), bereidt een werkende oplossing van sulfolaan en Nucleic Acid Binding Buffer door het combineren van 320 ul van 90% sulfolaan en 170 ul van Nucleic Acid Binding Buffer per monster. Misschien wilt u een voldoende hoeveelheid van dit mengsel te bereiden om zo veel samples proces als u van plan bent om na te gaan in de komende 4 weken. Dit mengsel kan worden opgeslagen voor maximaal 30 dagen bij kamertemperatuur. Niet bloot te stellen het mengsel aan het licht tijdens de opslag. </li><li> Voeg 490 ul van de sulfolaan / Binding Buffer mengsel (bereid in stap 1 hierboven) om elke vis monster. Vortex of pipet het monster totdat gehomogeniseerd. De toevoeging van dit mengsel zal het totale volume van elk monster tot 640 ul. </li><li> Overdracht elk monster om een ​​DNA-bindend Spin Cup die is geworteld in een 2-ml bakje buis (meegeleverd) en druk de dop van de tube op de bovenkant van de spin beker. </li><li> Spin de monsters in een microcentrifuge gedurende 1 minuut bij 14.000 xg aan het DNA laden op de spin-cup matrix. </li><li> Verwijder en bewaar de spin cups en gooi de filtraten. Voor elk monster, de spin beker te vervangen in de houder buis, voeg dan 500 ul van 1 x High Salt Wash Buffer en de dop op de tube. </li><li> Spin de monsters in een microcentrifuge bij 14.000 xg gedurende 1 minuut. </li><li> Verwijder en bewaar de spin cups en gooi de filtraten. Voor elk monster, de spin beker te vervangen in de houder buis, voeg dan 500 pi van 80% ethanol en dop de tube. </li><li> Spin de monsters in een microcentrifuge bij 14.000 xg gedurende 1 minuut. </li><li> Herhaal stap 7 en 8 twee keer voor een totaal van 3 wasbeurten met 500 ul van 80% ethanol. </li><li> Na de derde maal in 80% ethanol, te verwijderen en te behouden van de spin-cups en gooi de filtraten. Vervang de spin bekers in hun bakje buizen en draaien in een microcentrifuge gedurende 2 minuten bij 14.000 xg om de vezel matrix droog. </li><li> Breng de spin-cups tot 1,5 m1-collectie buizen. Voeg 100 ul van elutiebuffer aan elke spin cup direct op de vezel matrix in de beker. Snap de doppen van de collectie buizen op de spin-bekers en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut. </li><li> Spin de monsters in een microcentrifuge op maximale snelheid gedurende 1 minuut. </li><li> Het gezuiverde DNA is in de elutie buffer in de microcentrifugebuis. Gooi de spin cup en pet van de buizen. Het DNA kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal een maand. Voor de lange-termijn opslag, opslaan van de DNA bij 20 ° C of 80 ° C. </li><li> Indien gewenst, kunt u de concentratie van het DNA-monsters te meten in een spectrofotometer. </li></ol> De genomische DNA-extractie protocol levert meestal monsters met een concentratie variërend van 5 ng / ul tot 500 ng / ul. De PCR-RFLP protocol werkt putten met DNA-monsters varieert ergens tussen de 0,05 ng / ul tot 2000 ng / ul. 3: Stel de PCR-reacties <ol><li> Bereid een 50 ng / ul verdunning van de positieve controle zalm-DNA door het combineren van 8 ul van de DNA-aandelen met 32 ​​ul van een steriele, DNase-vrij water. Vortex te mengen. De verdunde monster kan worden opgeslagen bij 4 ° C voor toekomstig gebruik. </li><li> Bereid de reacties van het combineren van de componenten in de onderstaande tabel in orde is. Bereid een reactiemengsel voor alle PCR-reacties die simultaan zal worden geleid door het opschalen van de volumes die in detafel. In aanvulling op de test DNA-monsters, onder meer een positieve controle reactie en een no-template controle reactie. Voorbereiden dubbele PCR-reacties voor elke test DNA-monster wordt aanbevolen. Bereid genoeg reactiemengsel voor al uw reacties, plus een reactie van het volume eigen risico. Bijvoorbeeld, als je 5 testen DNA-monsters, voor te bereiden genoeg reactiemengsel voor een van beide 8 reacties (5-test reacties, een positieve controle, een no-template controle, en een eigen risico) of 13 reacties als je zijn inclusief duplicaten van de test reacties (10 dubbele-test reacties, een positieve controle, een no-template-controle en een eigen risico). PCR reactiemengsel <table border="1"><tbody><tr><td> Bestanddeel </td><td> Volume 1 Reactie </td><td> Volume 5 Reacties </td></tr><tr><td> dH 2 O, steriele </td><td> 9 pl </td><td> 45 pl </td></tr><tr><td> 2x PCR Master Mix </td><td> 12,5 ul </td><td> 62,5 ul </td></tr><tr><td> Primer Mix </td><td> 2,5 pl </td><td> 12,5 ul </td></tr><tr><td> Totale volume </td><td> 24 pl </td><td> 120 ul </td></tr></tbody></table></li><li> Vortex het reactiemengsel goed, dan verdelen 24 ul op elke individuele dunwandige PCR-reactie buis. </li><li> Voeg een pi van de verdunde positieve controle DNA naar de positieve controle reactie buis. Om de test monsterbuizen, voeg 1 pl van de test-DNA-monster. Voor de no-template control reactie, voeg 1 pl van DNase-vrij water in plaats van het DNA. Om te voorkomen dat kruisbesmetting, gebruik maken van een nieuwe pipet tip voor elk DNA-monster. Na het toevoegen van het monster, meng de reactie door snel pipetteren de inhoud van de buis omhoog en omlaag. </li><li> Cap de reactie buizen, vortex de buizen te mengen en kort gecentrifugeerd de buizen. </li></ol> 4: Start de PCR-protocol <ol><li> Plaats de reacties in de thermal cycler en voer het PCR-programma hieronder. PCR Fietsen Protocol <table border="1"><tbody><tr><td> Segment </td><td> Aantal Cycles </td><td> Temperatuur </td><td> Duur </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 95 ° C </td><td> 5 minuten </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 40 </td><td> 95 ° C 50 ° C 72 ° C </td><td> 30 seconden 30 seconden 30 seconden </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 1 </td><td> 72 ° C </td><td> 7 minuten </td></tr></tbody></table></li></ol> 5: Digest PCR Producten met restrictie-enzymen <ol><li> Label de 0,5 ml buizen of 0,2 ml-strip buizen die worden gebruikt voor de beperking verteren reacties. Elke PCR-reactie zal worden verteerd met drie verschillende restrictie-enzymen: DdeI, HaeIII en NlaIII. Daarom is voor elke PCR-reactie, het etiket drie afzonderlijke buisjes met de naam van de PCR-monster en de naam van het restrictie-enzym. </li><li> Bereid het reactiemengsel voor de DdeI vertering door het combineren van de onderstaande componenten in orde zijn. Bereid een reactiemengsel voor alle DdeI spijsvertering reacties (plus ten minste een reactie volume dan) met behulp van een veelvoud van elke component. Zodra de PCR is voltooid, worden de PCR-reacties behandeld met restrictie-enzymen voor restriction fragment length polymorfisme (RFLP) analyse. DdeI Spijsvertering reactiemengsel <table border="1"><tbody><tr><td> Bestanddeel </td><td> Volume </td></tr><tr><td> dH 2 O, steriele </td><td> 1,5 pl </td></tr><tr><td> 10x DdeI Buffer </td><td> 0,5 pl </td></tr><tr><td> 10x DdeI enzym </td><td> 0,5 pl </td></tr></tbody></table></li><li> Vortex het reactiemengsel goed, dan verdelen 2,5 ul aan de individuele reactie buisjes die waren gelabeld voor DdeI. </li><li> Bereid het reactiemengsel voor de HaeIII vertering door het combineren van de onderstaande componenten in orde zijn. Bereid een reactiemengsel voor alle HaeIII spijsvertering reacties (plus ten minste een reactie volume dan) met behulp van een veelvoud van elke component. HaeIII Spijsvertering reactiemengsel <table border="1"><tbody><tr><td> Bestanddeel </td><td> Volume </td></tr><tr><td> dH 2 O, steriele </td><td> 1,5 pl </td></tr><tr><td> 10x HaeIII Buffer </td><td> 0,5 pl </td></tr><tr><td> 10x HaeIII enzym </td><td> 0,5 pl </td></tr></tbody></table></li><li> Vortex het reactiemengsel goed, dan verdelen 2,5 ul aan de individuele reactie buisjes die waren gelabeld voor HaeIII. </li><li> Bereid het reactiemengsel voor deNlaIII ontsluitingen door het combineren van de onderstaande componenten in orde zijn. Bereid een reactiemengsel voor alle NlaIII spijsvertering reacties (plus ten minste een reactie volume dan) met behulp van een veelvoud van elke component. NlaIII Spijsvertering reactiemengsel <table border="1"><tbody><tr><td> Bestanddeel </td><td> Volume </td></tr><tr><td> dH 2 O, steriele </td><td> 1,5 pl </td></tr><tr><td> 10x NlaIII Buffer </td><td> 0,5 pl </td></tr><tr><td> 10x NlaIII enzym </td><td> 0,5 pl </td></tr></tbody></table></li><li> Vortex het reactiemengsel goed, dan verdelen 2,5 ul aan de individuele reactie buisjes die waren gelabeld voor NlaIII. </li><li> Voor elke spijsvertering reactie, voeg 2,5 pl van de geschikte PCR-product aan de gelabelde buizen. Alle van de test PCR-reacties en de positieve controle reactie moeten worden gedigereerd met alle drie de restrictie-enzymen. </li><li> Vortex de spijsvertering reacties en vervolgens in het kort centrifugeer de buizen. </li><li> Incubeer de spijsvertering reacties bij 37 ° C gedurende 2 uur. Deze incubatie kan worden uitgevoerd in de thermal cycler. Indien gewenst, kunnen reacties worden achtergelaten bij 37 ° C gedurende de nacht. </li><li> Breng de reacties op 65 ° C gedurende 15 minuten. Deze stap kan worden uitgevoerd in de thermal cycler. </li><li> Voeg 1 ui 60 mM EDTA (geleverd bij de kit) om elke reactie en vortex goed. </li></ol> 6: Analyseer de beperking verteren patronen <ol><li> De voorbereiding van de gel-dye mix, plaats een DNA-chip op de chip priming station, en laad de mix op de DNA-chip. </li><li> Pipetteer 5 ul van de DNA-merker in de put gemarkeerd met de ladder symbool en in elk van de 12 monster putten op de chip. DNA-marker is reeds voorzien in het DNA 1000 reagens Kit in een groen buisje met. </li><li> Pipetteer 1 pi van DNA ladder in de put gemarkeerd met een ladder symbool. DNA-ladder is voorzien in de DNA 1000 reagens Kit in een geel-buisje. </li><li> Voor elk van de DNA-monsters, pipet 1 pi van elke restrictie digest reactie in een van de 12 monster putten op de chip volgens de richtlijnen in de figuur hieronder. Met behulp van deze aanpak, putten 1-3 zijn voor de 3 spijsvertering reacties voor de positieve controle monster, putten 4-6 voor de 3 spijsvertering reacties voor monster 1, putten 7-9 voor de 3 spijsvertering reacties voor monster 2, en putten 10-12 zijn voor de spijsvertering 3 reacties voor monster 3.Analyze de beperking verteren reacties op de Agilent 2100 Bioanalyzer om het fragment lengtes geproduceerd tijdens de spijsvertering te bepalen. De Agilent DNA 1000 Kit Guide heeft de volledige instructies voor het uitvoeren van de lab chips op de Bioanalyzer. Een korte protocol is hieronder voor uw gemak. <img src="/files/ftp_upload/1871/1871fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="figuur 2"> Figuur 2. Organisatie van de monsters op de Chip. Als u minder dan 4 DNA-monsters, pipet een pi van water in de ongebruikte putten. Als u meer dan vier DNA-monsters, moet u meer dan een chip uit te voeren. Merk op dat het niet nodig is om het positieve controlemonster draaien op elke chip. </li><li> Horizontaal plaatsen van de chip in de adapter van het IKA vortex mixer en vortex gedurende 60 seconden bij 2400 tpm. </li><li> Plaats de chip in de Agilent 2100 Bioanalyzer en start de chip uit te voeren. De inkomende ruwe signalen worden weergegeven in het instrument context. Na de run is voltooid, worden pieken vastgesteld voor alle monsters met de instellingen van de piek vinden algoritme. Als je denkt dat het algoritme niet heeft voldaan aan een echte piek te detecteren, kunt u de hoogte Threshold setpoint te verlagen tot een waarde die het mogelijk maakt het algoritme te identificeren de top. </li><li> Ga naar de Assay context en selecteer het tabblad Samenvatting Chip. In het Sample veld Naam een ​​sample naam voor alle 12 putten op de chip zoals in de afbeelding hieronder. <img src="/files/ftp_upload/1871/1871fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="figuur 3"> Figuur 3. Sample invoeren van een naam in Chip tabblad Samenvatting. </li></ol> 7: Identificeer het monster soort gebruik van RFLP Matcher De Agilent software applicatie RFLP-decoder kan worden gebruikt om de vissoorten voor de test DNA-monsters op basis van het fragment lengtes geproduceerd in de vertering reacties te identificeren. Tabel 7 Verwachte DNA-fragment Maten in de positieve controle restrictie-enzym Verwachte Product afmetingen (bp) DdeI 117 , 332, 340 HaeIII 40, 105, 333 NlaIII 459 De instructies die hier gebruik maken van de standaard analyse-instellingen in RFLP Matcher. Raadpleeg de Help van de software en systeem voor gedetailleerde informatie over de bediening van de software en interpreteren van de display. <ol><li> Start het RFLP Decoder programma. </li><li> Klik op Bestand&gt; Openen&gt; XAD bestand. Het dialoogvenster Openen Will open. </li><li> Selecteer het XAD-bestand voor de DNA-chip dat de beperking verteren reacties opgenomen. Klik op Openen. Er wordt een dialoogvenster geopend opsomming van de monsters die zijn geladen op de chip. </li><li> Selecteer drie spijsvertering reacties die overeenkomt met een DNA-monster en geef de juiste restrictie-enzym voor elk monster met behulp van de drop-down menu's in de Enzyme kolom. In de onderstaande figuur is de Enzyme column is ingevuld voor DNA-monster 1. <img src="/files/ftp_upload/1871/1871fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="figuur 4"> Figuur 4. Het specificeren van restrictie-enzym voor elk monster. </li><li> In het veld min piekhoogte als% van de lagere marker ", de standaard waarde is 10,0%. Indien nodig, deze waarde kan worden verlaagd tot kleine pieken die werd gemist te identificeren, of verhoogd tot pieken als gevolg van niet-specifieke geluid in het gooi electropherogram. Klik Reïntegratie na het maken van eventuele aanpassingen van de min piekhoogte waarde. <img src="/files/ftp_upload/1871/1871fig5.jpg" alt="Figuur 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="figuur 5"> Figuur 5. Het toewijzen van Minimum piekhoogte. </li><li> Klik Calc aan de onderkant van het dialoogvenster. Het fragment length gegevens verkregen uit de Bioanalyzer termijn zal bevolken de software velden. </li><li> In de score drop-down lijst in de linker bovenhoek van het scherm, selecteert u de juiste algoritme voor de analyse van de gegevens. Als de vis monster wordt geanalyseerd bestaat uit een enkele vissoorten, selecteer Dice (Nei Li) in de score drop-down lijst. Indien de monsters kan bestaan ​​uit een mengsel van soorten, te selecteren mengsel. De tabel aan de onderkant van het scherm label gecombineerde score-lijsten van de beste soort wedstrijden gebaseerd op de resultaten van alle drie de spijsvertering reacties. De soortnaam evenals de gemeenschappelijke naam staan ​​in de tabel (zie hieronder). Perfect wedstrijden (die met een score van 1) zijn groen gemarkeerd. Wedstrijden in het geel worden beschouwd als bijna-overeenkomsten. U kunt dubbelklikken op een soortnaam om het FishBase webpagina voor deze soort. <img src="/files/ftp_upload/1871/1871fig6.jpg" alt="Figuur 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="figuur 6"> Figuur 6. Soorten die identificatie op basis van spijsvertering. </li><li> In de lagere cutoff en match tolerantie velden aan de bovenkant van het scherm, kunt u de standaardinstellingen voor de score van de beste soort match te verbeteren. De lagere cutoff waarde wordt gebruikt om alle fragmenten korter dan de lengte aangewezen in het veld te verwijderen. De wedstrijd tolerantie waarde bepaalt hoe dicht in de lengte een fragment moet zijn om de voorspelde fragment te worden beschouwd als een wedstrijd. </li><li> Herhaal stap 4 tot en met 8 voor de overige DNA-monsters die werden opgenomen op dezelfde chip. </li></ol> 8: representatieve resultaten: Een afbeelding van een Bioanlyzer gel met restrictiedigestie samples uit 4 verschillende vissoorten is weergegeven in onderstaande figuur. De verwachte resultaten voor de positieve DNA-monster zijn samengevat in onderstaande tabel. <img src="/files/ftp_upload/1871/1871fig7.jpg" alt="Figuur 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="figuur 7"> Figuur 7. Bioanalyzer gel beeld van restrictiedigestie reactie monsters. Elke gel laan is gelabeld met de restrictie-enzym gebruikt in die reactie. Verwachte DNA-fragment Maten in de Salmon positieve controle <img src="/files/ftp_upload/1871/1871fig8.jpg" alt="Figuur 8" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="figuur 8"> Figuur 8. Verwachte DNA-fragment Maten in de Salmon positieve controle.

<ol><li>Dooley, J. J., Sage, H. D., Brown, H. M., Garrett, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+fish+species+identification+by+use+of+lab-on-a-chip+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Control%22%5BJournal%5D)">Improved fish species identification by use of lab-on-a-chip technology.</a> Food Control. 16 (7), 601-607 (2004).</li>
<li>Dooley, J. J., Sage, H. D., Clarke, M. -A. L., Brown, H. M., Garrett, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fish+species+Identification+Using+PCR-RFLP+Analysis+and+Lab-on-a-Chip+Capillary+Electrophoresis%3A+Application+to+Detect+White+Fish+Species+in+Food+Products+and+an+Interlaboratory+Study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Agric.+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Fish species Identification Using PCR-RFLP Analysis and Lab-on-a-Chip Capillary Electrophoresis: Application to Detect White Fish Species in Food Products and an Interlaboratory Study.</a> J. Agric. Food Chem. 53, 3348-3357 (2005).</li>
<li>Dooley, J., Garrett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+PCR-RFLP+Profiles+for+Fish+Species+Using+the+Agilent+2100+Bioanalyzer%5BTitle%5D)+AND+%22Agilent+Technologies+Application+Note%22%5BJournal%5D)">Determination of PCR-RFLP Profiles for Fish Species Using the Agilent 2100 Bioanalyzer.</a> Agilent Technologies Application Note. , (2005).</li>
<li>Dooley, J. J., Clarke, M. L., Sage, H. D., Brown, H. M., Garrett, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+chip-based+capillary+electrophoresis+system+to+enable+simple+PCR-RFLP+identification+of+fish+species%5BTitle%5D)+AND+%22FSA+Final+Report+Q01069%22%5BJournal%5D)">Application of a chip-based capillary electrophoresis system to enable simple PCR-RFLP identification of fish species.</a> FSA Final Report Q01069. , (2004).</li>
</ol>

De auteurs zijn werkzaam bij Agilent Technologies, dat de reagentia en instrumenten gebruikt in dit artikel oplevert.

Demonstreren we een eenvoudige, snelle en accurate DNA-gebaseerde screening methode voor de identificatie van de vissoorten in visproducten. Deze krachtige methode biedt reproduceerbare, precieze resultaten in minder dan een werkdag en het kan worden toegepast in commerciële testfaciliteiten te wijten aan een gestroomlijnde protocollen en eenvoudige setup. Het wordt gekenmerkt door het genereren van objectieve gegevens die geanalyseerd met behulp van RFLP Decoder software met een uitbreidbare database van experimenteel afgeleide vissoorten profielen. Met de gewone toepassing, deze testmethode heeft de potentie om verkeerde labeling van schaal-en schelpdieren te voorkomen en te helpen bij het handhaven van accurate administratie geschikt is voor de naleving van overheidsvoorschriften.

<table><tbody><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer (met chip priming station en IKA vortexmixer)</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer laptop &amp;amp; Expert Software</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2953CA</td><td>G2950CA - desktop-pc &amp;amp; Expert Software</td></tr><tr><td>Agilent Bioanalyzer DNA 1000 Reagent Kit (onderdeel #5067-1504)</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1504</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Diverse</td><td>Diverse</td><td></td></tr><tr><td>PCR-stripbuisjes</td><td>Agilent Technologies</td><td>401428</td><td></td></tr><tr><td>PCR-stripdoppen</td><td>Agilent Technologies</td><td>401425</td><td></td></tr><tr><td>96-wells werkrek</td><td>Agilent Technologies</td><td>410094</td><td></td></tr><tr><td>Fish Species Identification System DNA Isolation Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>Contact</td><td></td></tr><tr><td>Fish Species Identification System PCR-RFLP Reagent Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>Contact</td><td></td></tr><tr><td>RFLP Matcher Software</td><td>Agilent Technologies</td><td>Contact</td><td></td></tr><tr><td>100% ethanol, 200 proof (USP-kwaliteit of equivalent)</td><td>Diverse</td><td>Diverse</td><td></td></tr><tr><td>Steriel, nuclease-vrij water</td><td>Diverse</td><td>Diverse</td><td></td></tr><tr><td>Pipetten</td><td>Diverse</td><td>Diverse</td><td></td></tr><tr><td>Incubator of waterbad ingesteld op 65&amp;#x00B0;C</td><td>Diverse</td><td>Diverse</td><td></td></tr><tr><td>Steriele glazen fles of polypropyleen buis (bijv. 14-ml BD Falcon polypropyleen</td><td>Diverse</td><td>Diverse</td><td></td></tr><tr><td>rondbodembuisjes of 50-ml BD Falcon polypropyleen conische buisjes)</td><td>Diverse</td><td>Diverse</td><td></td></tr><tr><td>Vortexmixer</td><td>Diverse</td><td>Diverse</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Diverse</td><td>Diverse</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugebuisjes 1,5 ml</td><td>Diverse</td><td>Diverse</td><td></td></tr><tr><td>Buisjesrek 1,5 ml</td><td>Diverse</td><td>Diverse</td><td></td></tr><tr><td>Pipetpunten</td><td>Diverse</td><td>Diverse</td><td></td></tr></tbody></table>

dna-gebaseerde vissoorten identification protocol

DNA-based Fish Species Identification Protocol

We hebben een snelle, eenvoudige en nauwkeurige DNA-gebaseerde screening methode om de vissoorten die in verse en verwerkte zeevruchten monsters te identificeren. Deze veelzijdige methode maakt gebruik van PCR-amplificatie van genomisch DNA uit vis monsters, gevolgd door een restrictie fragment lengte polymorfisme (RFLP) analyse fragment patronen die kunnen worden opgelost op de Agilent 2100 Bioanalyzer en afgestemd op het juiste soort gebruik van RFLP pattern matching-software te genereren. De vis identificatie methode maakt gebruik van een eenvoudige, betrouwbare, spin kolom-gebaseerd protocol om DNA te isoleren uit vis monsters. De monsters worden behandeld met proteinase K aan de nucleïnezuren introductie in oplossing. DNA wordt vervolgens geïsoleerd door schorsing van de sample in de bindende buffer en het laden op een micro-spin cup met een silica-gebaseerde glasvezel matrix. De nucleïnezuren in het monster binden aan de vezel matrix. Het geïmmobiliseerde nucleïnezuren worden gewassen om verontreinigingen te verwijderen, en de totale DNA is teruggevonden in een eindvolume van 100 ul. De geïsoleerde DNA is klaar voor PCR-amplificatie met de meegeleverde primers die zich binden aan sequenties in alle vis genomen. De PCR-producten worden dan verteerd met drie verschillende restrictie-enzymen en opgelost op Agilent 2100 Bioanalyzer. Het fragment lengtes geproduceerd in de spijsvertering reacties kunnen worden gebruikt om de vissoorten waarvan het DNA-monster werd bereid te bepalen, het gebruik van de RFLP patroon matching-software, die een databank van experimenteel afgeleide RFLP patronen van commercieel relevante vissoorten.

Deze publicatie wordt beschreven hoe u de Agilent Vissoorten Identification System te gebruiken om de soort van een vis te identificeren door extractie van DNA en het uitvoeren van PCR en RFLP-analyse.

DNA-gebaseerde Vissoorten Identification Protocol

Wij hebben een snelle, eenvoudige en nauwkeurige DNA-gebaseerde screeningsmethode ontwikkeld om de vissoorten te identificeren die aanwezig zijn in verse en bewerkte seafoodmonsters. ...

Het systeem voor de identificatie van vissoorten is een eenvoudige, snelle en nauwkeurige DNA-gebaseerde methode om de aanwezige vissoorten in een gegeven monster te identificeren. Vismonsters worden behandeld met proteinase K om nucleïnezuren in oplossing te brengen. Het genomisch DNA van de vis wordt vervolgens geïsoleerd en via PCR geamplificeerd met behulp van primers die binden aan sequenties die in alle visgenomen voorkomen.De PCR-producten worden vervolgens gedigesteerd met drie verschillende restrictie-enzymen en geanalyseerd met de Agilent 2100 bioanalyzer. De fragmentlengtes die ontstaan bij de digestiereacties kunnen worden gebruikt om de vissoort te bepalen met behulp van restrictiefragmentlengtepolymorfisme, of software voor RFLP-patroonmatching. Hallo, ik ben Rachel Formosa van Agilent Technologies.Vandaag tonen we u een procedure voor de identificatie van vissoorten op basis van DNA. Deze procedure is een screeningsmethode waarmee u de vissoorten kunt identificeren die aanwezig zijn in verse, bevroren, gemalen, gekookte, gedroogde of anders bewerkte monsters. Dit kan worden gerealiseerd in minder dan één werkdag.Wij gebruiken deze procedure om de authenticiteit van zeevruchten te bestuderen, wat van groot belang is voor de sector zeevruchten, aangezien substitutie en verkeerde etikettering aanzienlijke economische, milieu- en voedselveiligheidsgevolgen kunnen hebben. Bovendien kan het met name moeilijk zijn om vissoorten te bepalen via visuele identificatie en andere traditionele methoden. Zodra een vis is verwerkt, biedt DNA-onderzoek een veel nauwkeuriger en betrouwbaarder resultaat.Laten we beginnen. Begin met het voorbereiden van de monsters voor DNA-extractie door 10 tot 1000 mg van elk rauw of gekookt visweefselmonster in 1,5 ml microcentrifugebuisjes per vis te plaatsen. Voeg 220 µL vers bereide proteinase-K-oplossing toe en pipetteer dit op en neer.Incubeer de buisjes 10 minuten bij 65 °C en centrifugeer ze vervolgens drie tot vijf minuten bij 14.000 Gs om onverteerd weefsel te pelletteren. Breng daarna voorzichtig 150 µL van elk supernatant over naar een nieuwe buis van 1,5 mL, waarbij onverteerd materiaal aan de bodem en olieachtig materiaal aan de bovenzijde worden vermeden. Het supernatant wordt nu gebruikt voor de extractie van genomisch DNA.Begin de extractie van genomisch DNA door 500 µL van de nucleic acid binding buffer aan elk monster toe te voegen. Hiermee wordt het totale monstervolume 650 µL. Vortex het monster tot homogenisatie.Breng vervolgens elk monster over naar een DNA-bindende centrifugatiekolom die in een van de meegeleverde buisjes van twee milliliter is geplaatst. Klik de dop van het buisje op de bovenkant van de centrifugatiekolom. Centrifugeer de monsters gedurende één minuut bij 14 000 Gs om het DNA op de matrix van de centrifugatiekolom te laden.Verwijder na de centrifugatie de spin-cups, gooi het filtraat weg en plaats de cups terug in de opvangbuisjes. Voeg 500 µL van een 1x high salt wash buffer toe. Sluit de buisjes af en centrifugeer opnieuw na de centrifugatie.Gooi het filtraat weg en plaats de spin-cups opnieuw in de opvangbuisjes. Voeg nu 500 µL 80% ethanol toe. Sluit het buisje af en centrifugeer bij 14,000 G gedurende één minuut.Herhaal de ethanolwas nog twee keer na de derde wasbeurt in 80% ethanol en gooi de filtraten weg. Plaats de spin cups terug in de opvangbuisjes en centrifugeer deze keer twee minuten om de fibermatrix te drogen. Draag de spin cups vervolgens over naar 1,5 milliliter opvangbuisjes.Voeg 100 µL elutiebuffer toe aan elke spin-cup, direct op de vezelmatrix in de cup. Klik vervolgens de doppen van de opvangbuisjes op de spin-cups en incubeer deze gedurende één minuut bij kamertemperatuur. Centrifugeer de monsters na de incubatie gedurende één minuut op maximale snelheid.Vervolgens werpt u de centrifugecup weg en sluit u de buisjes af. Indien de DNA-concentraties worden gemeten, worden concentraties verwacht die variëren van 5 ng/µL tot 500 ng/µL. Het DNA kan nu gedurende maximaal één maand worden bewaard bij 4 °C; voor langdurige bewaring plaatst u het DNA bij -20 °C of -80 °C.Voer de PCR uit met de primers en reagentia die zijn meegeleverd in de P-C-R-R-F-L-P reagentkit. Volgens het bijbehorende schriftelijke protocol wordt aanbevolen om elk monster, inclusief de positieve controle en de no-template controle, in dubbeltoestanden te analyseren tijdens het PCR-proces. Bereid de mastermixen van restrictie-enzymen voor de digesties met DTE E one HAE three en NL three door de volgende componenten in deze volgorde te combineren: 1.5 µL steriel gedestilleerd water, 0.5 µL 10 x enzymbuffer en 0.5 µL 10 x enzym.Bereid voldoende fourex three reagensmengsel voor voor alle monsters plus één reactievolume. Verdeel vervolgens 2,5 µl over elke reactiebuis die is gelabeld met de naam van het monster en het enzym. Wanneer de PCR is voltooid, haal je de monsters uit de thermocycler en plaats je deze op ijs.Voeg 2,5 µL van elk PCR-product toe aan elk van de drie restrictiedigestiebuisjes voor die reactie. DDE één HAE drie, en NLA drie. Vortex vervolgens.Centrifugegeef kort en incubeer de digesties gedurende twee uur bij 37 °C. Indien praktischer, kunnen de digesties ook overnight worden geïncubeerd. Incubeer na de digestie de reacties gedurende 15 minuten bij 65 °C.Voeg vervolgens één µL 60 mM EDTA toe aan elke buis om de reactie te beëindigen en vortex deze. Bereid de restrictiedigest voor en laad deze, met behulp van de Agilent bioanalyzer reagent kit, in de wells van een DNA-chip volgens de handleiding van de kit. Voor elk monster moeten alle drie de digesten op dezelfde chip worden geladen.Vortex vervolgens de chip en plaats deze in het apparaat. Nadat de run is voltooid, gaat u naar de assay-context en selecteert u het tabblad chip summary. Voer in het veld sample name een monsternaam in voor alle 12 wells van de chip om de vissoorten voor de test-DNA-monsters te identificeren.Start het RFLP-decoderprogramma door op bestand te klikken. Open vervolgens het XAD-bestand. Het dialoogvenster voor openen wordt geopend.Selecteer nu het XAD-bestand van de gebruikte DNA-chip. Klik op openen om een lijst met de op de chip geladen monsters te zien. Selecteer de drie digesten die horen bij het eerste DNA-monster.Geef onder de kolom enzym de restrictie-enzymen op die zijn gebruikt in het veld met het label min peak height as percent of lower marker. De standaardwaarde is 10% indien nodig. Deze waarde kan worden verlaagd om kleine pieken te identificeren die over het hoofd zijn gezien, of worden verhoogd om pieken te verwijderen die het resultaat zijn van aspecifieke ruis in het elektroferogram.Nadat u eventuele aanpassingen aan de waarde voor de minimale piekhoogte heeft aangebracht, klikt u op reintegrate. Klik vervolgens op calc onderaan het dialoogvenster. De fragmentlengtegegevens die zijn verkregen uit de bioanalyzer-run zullen de softwarevelden vullen.Select vervolgens dice in de vervolgkeuzelijst voor de score in de linkerbovenhoek van het scherm. Als het vismonster uit één vissoort bestaat, of als het monster uit een mengsel kan bestaan, gebruik dan de tabel onderaan het scherm met het label combined score list. De beste soortovereenkomsten worden gebaseerd op de resultaten van alle drie de digestiereacties.Perfecte overeenkomsten met een score van één zijn groen gemarkeerd. Bijna-overeenkomsten zijn geel gemarkeerd bovenaan het scherm. De onderste afkapwaarde geeft de minimale fragmentgrootte aan die in de analyse is gebruikt en de tolerantiewaarde voor overeenkomsten bepaalt hoe dicht de lengte van een fragment bij het voorspelde fragment moet liggen om als een overeenkomst te worden beschouwd.De getoonde waarden zijn de standaardinstellingen en kunnen worden aangepast. Herhaal deze stappen voor de analyse van de resterende DNA-monsters op de tip. DNA-monsters van vier verschillende vissoorten werden geïsoleerd, geamplificeerd en gedigesteerd volgens de in deze video beschreven methode.Een bioanalyzer-gel waarop de restrictiedigestie-monsters te zien zijn, wordt hier getoond met behulp van de Agilent Bioanalyzer en RFLP-decoder. Software-buigpatronen worden hier gebruikt om de vis te identificeren. Het eerste monster wordt correct geïdentificeerd als forel, het tweede als tonijn en het derde als zeebaars.En het laatste monster als specifieke kabeljauw. We hebben u zojuist laten zien hoe u DNA-gebaseerde identificatie van vissoorten uitvoert met de PCR-RFLP-methode van Agilent. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om kruiscontaminatie van monsters te vermijden, aangezien de methode zeer gevoelig is.Dat was het. Nu weet u hoe u snel, eenvoudig en nauwkeurig de vissoorten in uw monsters kunt identificeren. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

dna-based-fish-species-identification-protocol

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit artikel beschrijft DNA-extractie uit zebravisstaartclip. Het protocol demonstreert een snelle en efficiënte methode om zebravis genotypen te analyseren.

DNA-extractie uit staartclip: een methode die wordt gebruikt bij het genotyperen van zebravissen

We beschrijven een robuuste en veelzijdige protocol voor de analyse nucleaire architectuur door 3D DNA FISH met direct gelabelde fluorescerende probes.

Robuuste 3D DNA FISH behulp direct gemerkt Probes

PCR in combinatie met hoge-resolutie smelt analyse (HRMA) wordt aangetoond als een snelle en efficiënte methode om zebravis genotype.

Snelle en efficiënte zebravis Genotyping Met behulp van PCR met een hoge resolutie Melt Analyse

Een verbeterde polymerasekettingreactie-restrictiefragment lengte polymorfisme werkwijze voor genotyperen kogelvis soorten van vloeistofchromatografie / massaspectrometrie beschreven. Een omgekeerde-fase-silica monoliet kolom wordt toegepast voor het scheiden van geknipt amplicons. Deze methode kan de mono-isotopische massa van oligonucleotiden, die bruikbaar is voor het identificeren basissamenstelling helderen.

Verbeterde Polymerase Chain Reaction-restrictiefragmentlengtepolymorfisme Genotypering van Toxic Pufferfish door vloeistofchromatografie / massaspectrometrie

Meest voorkomende analyses van de inhoud van de darm van macroinvertebrates zijn visueel. Waarbij intensieve kennis over morfologische diversiteit van organismen van de prooi, ze missen zachte lijf prooi en, als gevolg van de sterke trimventilatoren van de prooi, zijn bijna onmogelijk voor sommige organismen, met inbegrip van vlokreeftjes. Wij bieden gedetailleerde, roman genetische methoden voor macroinvertebrate ten prooi identificatie in het dieet van vlokreeftjes.

Laboratorium Protocol voor genetische Analyses van de inhoud van de Gut van aquatische Macroinvertebrates gebruiken groepsspecifieke rDNA Primers

Laboratorium behuizing van turkoois poolfish kan worden opgeschaald naar huis en duizenden afzonderlijke vissen efficiënt te verhogen in een gecentraliseerde water filtratie-systeem, met dezelfde infrastructuur gebruikt voor standaard zebrafish faciliteiten. Hier detail we een aantal gestandaardiseerde procedures waarmee efficiënte poolfish onderhoud.

Een Protocol voor het laboratorium huisvesting van Turquoise Killifish (Nothobranchius furzeri)

De gezondheid van de wilde vissen kan worden gebruikt als een indicator van de gezondheid van aquatische ecosysteem. Documentatie van de zichtbare laesies of afwijkingen, gegevens die worden gebruikt voor de berekening van de voorwaarde-indicatoren, alsmede de mogelijkheid om het verzamelen van weefsels voor microscopische evaluatie, genuitdrukking en andere meer diepgaande necropsie gebaseerde vis medische keuringen te verstrekken analyses.

De beoordeling van de gezondheid van de necropsie gebaseerde wilde vis

Zebravis als betrouwbare genetische modelorganismen in biomedisch onderzoek, vooral met de komst van gen-bewerken technologieën zijn gebruikt. Wanneer larvale fenotypen verwachting, kan DNA-extractie en genotype identificatie worden uitdagende. Hier beschrijven we een efficiënte genotypering procedure voor zebrafish larven, door de staart knippen, zo spoedig 72 uur na bevruchting.

High-throughput DNA-extractie en de genotypering van 3dpf Zebrafish larven door Fin knippen

Milieu-DNA-tests vereisen een rigoureus ontwerp, testen, optimalisatie en validatie voordat het verzamelen van veldgegevens kan beginnen. Hier presenteren we een protocol om gebruikers door elke stap te nemen bij het ontwerpen van een soortspecifieke, op sondes gebaseerde qPCR-test voor de detectie en kwantificering van dna van een doelsoort uit milieumonsters.

Ontwikkeling en testen van soortspecifieke kwantitatieve PCR-tests voor milieu-DNA-toepassingen

Dit werk beschrijft een protocol voor het kwantificeren van de vorm van craniofaciaal kraakbeen met behulp van vrije software (tpsDigs2, MorphoJ en PAST) om veranderingen in gezichtsstructuur bij zebravislarven te meten.

Morfometrische analyses van vorm: De analysesoftware-toolbox voor craniofaciale vormkwantificatie bij zebravissen

Leer een DNA-gebaseerde methode voor vissoortenidentificatie met PCR, restrictie-enzymvertering en RFLP-analyse op een bioanalyzer. Dit protocol verbetert de betrouwbaarheid van seafood-authenticiteitstests aanzienlijk.

DNA-gebaseerde Vissoorten Identification Protocol

Meer video's verkennen