Name: Ontwikkeling van geautomatiseerde beeldvorming en analyse voor de zebravis chemische schermen. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-24T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Ontdek geautomatiseerde beeldvorming en analyse voor high-throughput chemische schermen in zebravisembryo's met transgene FGF-reporters. Deze methode kwantificeert dosisafhankelijke effecten van kleine moleculen op signaaltransductie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk wordt gefinancierd door het NICHD / NIH (1R01HD053287) naar Hukriede, NCI / NIH (P01 CA78039) te Vogt, en NHLBI / NIH (1R01HL088016) naar Tsang.

1) Opzetten van zebravis paringen en BCI behandeling. <ol><li> Twee dagen voorafgaand aan de behandeling, te identificeren homozygote mannen Tg (dusp6: d2eGFP) PT6 zebravis en plaats individueel in de paring tanks 1. Voeg afscheider en een wild-type AB * vrouwelijke vissen en 's nachts vertrekken paring kooien. </li><li> De volgende morgen te verwijderen van de afscheider, en het verzamelen van embryo's na 1 uur. Transfer embryo's tot 100mm gerechten met E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4), oplossing en incubeer bij 28 ° C gedurende 6 uur. Verwijderen dode en onbevruchte embryo's, voeg verse E3 oplossing en incubeer overnacht. </li><li> Sorteer transgene embryo's voor soortgelijke fase (24hpf) en uniforme GFP expressie. Array embryo's individueel in elke well van een 96-well plaat. </li><li> Verwijder overtollig E3 oplossing met een micropipet. Voeg 200μl van de E3-oplossing met een multi-channel pipet in elk putje. </li><li> Voeg de volgende verbindingen zoals vermeld: <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 11 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> Een </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr><td> B </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr><td> C </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr><td> D </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr><td> E </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr><td> F </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr><td> G </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mM) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr><td> H </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr></tbody></table> Eindconcentraties zijn 1 uM, 5 urn, 10μM, 20μM, 25μM BCI in 1% DMSO. Afdekplaat in aluminium folie en incubeer gedurende 6 uur bij 28 ° C. </li></ol> 2) Geautomatiseerde beeldvorming van 96-wells platen en analyse. <ol><li> Voeg 10μl van tricaïne (0.61mM) aan elk putje te 30hpf embryo's verdoven. </li><li> Laad plaat in Molecular Devices Imagexpress Ultra. </li><li> Open Metaxpress software. Kies een configuratie met een 4x objectieve en maximale pinhole diameter, configureren laser autofocus tot op het bord bodem te detecteren, en bepalen een optimale Z-vliegtuig naar gebieden van belang op te sporen. Acquire beelden bij excitatie / emissie golflengtes van 488 / 525 nm (GFP). Stel scan gebied als een enkele site van 2000x2000 pixels (4 x 4 mm) zonder binning. Configureren laservermogen en krijgen zodanig dat helderste regio's in positieve controle beelden niet te verzadigen. Bevestig de juiste beeldacquisitie in verschillende positieve en negatieve controle putten. </li><li> Start plaat scan. Het instrument zal automatisch verwerven beelden van alle putten en archiveren in een SQL server database. </li><li> Upload beelden in Definiens Developer met behulp van de Cellenger applicatie module en een import filter dat beeldformaat en bestandsstructuur gegenereerd door de Molecular Devices Imagexpress Ultra-platform herkent. </li><li> Proces beelden met een speciaal ontworpen Cognition Network Technology-algoritme (ook wel een regelset). Het algoritme, die wij op maat ontwikkeld op basis van een recent gepubliceerde regelset 2, is ontworpen om automatisch te identificeren embryo, dooier, en hoofd, en om de helderheid en het gebied van GFP-expressie hoofd structuren te kwantificeren. Wells waarin geen embryo is geconstateerd of waar het hoofd niet ondubbelzinnig kan worden toegekend (bijvoorbeeld met een hoge toxiciteit compound of onscherp beelden) zijn uitgesloten van de analyse. Configureer het algoritme met behulp van een aantal negatieve controle foto's (voertuig behandeld) en de positieve controle beelden (BCI behandeld) zodanig dat het hoofd en de dooier correct worden geïdentificeerd in beide. Stel een 'head-structuren "detectiedrempel als een veelvoud van de gemiddelde intensiteit dooier tot detectie van heldere structuren hoofd wedstrijden visuele waarneming. Parameters definiëren om te exporteren. In dit voorbeeld is de meest informatieve parameter was de totale geïntegreerde helderheid van GFP-positieve regio's in het hoofd, hierna genoemd "total head-structuren helderheid" (Figuur 1). <img src="/files/ftp_upload/1900/1900fig2.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="figuur 1"> Figuur 1 Grafiek depicitng De dosis-afhankelijke effecten van BCI op de GFP expressie in transgene embryo's. </li><li> Voer het algoritme op alle plaat beelden met behulp van de geïntegreerde job scheduler. De Definiens software maakt gebruik van distributed computing op meerdere processoren ("motoren"), waardoor gelijktijdige analyse van meerdere afbeeldingen. Het algoritme berekent de numerieke maatregelen op basis van de resultaten van de beeldanalyse, die worden opgeslagen in de database samen met een kopie van het bewerkte beeld, met een analyse toegepast. </li></ol> Representatieve resultaten: Nadat alle beelden worden geanalyseerd, kunnen de gegevens worden gevisualiseerd in Cellenger of geëxporteerd naar software van derden (Excel, GraphPad Prism) voor verdere analyse en grafische weergave. Figuur 2 toont gearchiveerde afbeeldingen scannen van behandelde een voertuig en een goed BCI-behandeld, met en zonder CNT-analyse toegepast. Figuur 1 documenten een dosis-afhankelijke effect van de BCI op de GFP-reporter genexpressie in Tg (dusp6: d2EGFP) PT6 embryo's. De concentratie nodig is om een ​​half maximale respons (EC50) te lokken was ongeveer 12 uM. <img src="/files/ftp_upload/1900/1900fig1.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="figuur 2"> Figuur 2 Automatische foto-opname en analyse van transgene zebravis embryo's. (A) DMSO voertuig behandeld Tg (dusp6: d2eGFP) PT6 embryo op 30hpf. (B) transgene embryo's die werden behandeld met 20μM BCI tonen toename van GFP expressie. (C) Afbeelding van embryo's van (A) na het draaien van Definiens regelset om GFP tot uitdrukking komen in het hoofd. Oranje vlekken aan te duiden waar de software GFP intensiteit van maatregelen. (D) Afbeelding van embryo's uit (B) na het draaien van Definiens regelset om GFP tot uitdrukking komen in het hoofd. Oranje vlekken aan te duiden waar de software GFP intensiteit van maatregelen. Merk op dat de regelset in staat was om een ​​uitgebreide gebied van GFP tot uitdrukking komen in de behandelde embryo.

<ol><li>Molina, G. A., Watkins, S. C., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+FGF+reporter+transgenic+zebrafish+and+their+utility+in+chemical+screens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens.</a> BMC Dev Biol. 7, 62-62 (2007).</li>
<li>Vogt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+image-based+phenotypic+analysis+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos.</a> Dev Dyn. 238, 656-663 (2009).</li>
<li>Molina, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+chemical+screening+reveals+an+inhibitor+of+Dusp6+that+expands+cardiac+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages.</a> Nat Chem Biol. 5, 680-687 (2009).</li>
</ol>

Een belangrijke factor die de doorvoer van de zebravis chemische schermen is het gebrek aan methodiek om systematisch te verwerken 96-well platen voor beeldvorming en analyse. Omdat beelden van meercellige organismen zijn complexe, laag contrast, en heterogeen van aard, bestaande beeldanalyse algoritmen niet te detecteren en te kwantificeren specifieke structuren in het organisme. De meeste gepubliceerde zebravis chemische schermen dus mogelijk voor visueel onderzoek van de individuele putten door toegewijde personeel tijdens de gehele procedure. Dit voorkomt meestal de generatie van numerieke uitlezingen en een volledige archivering van het scherm beelden en gegevens. Bovendien, handmatige evaluatie elimineert een aantal belangrijke voordelen van het image-based screening, namelijk de mogelijkheid om retrospectieve analyses van het scherm de prestaties te voeren, om fenotypische veranderingen die niet de primaire focus van de screening campagne (bv. toxiciteit of defecten in de ontwikkeling) het onderzoeken en over te steken -referentie-screening van gegevens met het verleden of de toekomst schermen met dezelfde compound bibliotheek. In dit rapport belichten we de methodologie voor automatische beeldvorming en analyse van de zebravis embryo&#39;s in multiwell platen zonder tussenkomst van de gebruiker. We automatische beeld vast te leggen op een ImageXpress Ultra confocale laser scanning lezer (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) om beeld Tg (dusp6: d2EGFP) PT6 embryo&#39;s in 96 wells platen en ontwikkelde een beeldanalyse algoritme gebaseerd op Cognition Definiens &#39;Network Technology gekwantificeerde GFP uitdrukking in de hoofden van transgene embryo&#39;s. De methode geleverd gesorteerd reacties en gekwantificeerd de in vivo activiteit van een klein molecuul activator van FGF signalering. Vergelijkbare resultaten werden verkregen met de epifluorescentie-based ArrayScan II (Cellomics Inc, Pittsburgh PA) waaruit blijkt dat het mogelijk is om geautomatiseerde beeldopname van de zebravis embryo&#39;s uitvoeren op een verscheidenheid van commercieel beschikbare plaat lezers 2. De ontwikkeling van de methodologie voor het automatisch analyseren van meercellig organisme beelden niet langer nodig voor visuele scoren door een menselijke waarnemer en in staat het genereren en archiveren van numerieke gegevens en beelden voor de retrospectieve analyse en vergelijkingen met toekomstige schermen.

<table><tbody><tr><td>Tricaïne (MS222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat.# A-5040</td><td></td></tr></tbody></table>

ontwikkeling van geautomatiseerde beeldvorming en analyse voor de zebravis chemische schermen.

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. 

Tonen we de toepassing van beeld-gebaseerde high-content screening (HCS) methodologie om kleine moleculen die de FGF / RAS / MAPK route kan moduleren in de zebravis embryo&#39;s te identificeren. De zebravis embryo is een ideaal systeem voor in vivo high-content chemische schermen. De 1-dag oud embryo is ongeveer 1 mm in diameter en kan gemakkelijk worden geschaard in 96-well platen, een standaard formaat voor high throughput screening. Tijdens de eerste dag van de ontwikkeling, de embryo&#39;s zijn transparant met de meeste van de belangrijkste organen aanwezig is, waardoor visualisatie van weefsel de vorming tijdens de embryogenese. De volledige automatisering van zebravis chemische schermen is nog steeds een uitdaging, maar met name in de ontwikkeling van geautomatiseerde afbeelding acquisitie en analyse. We hebben eerder geleid tot een transgene verslaggever lijn die groen fluorescerend eiwit (GFP) tot uitdrukking onder de controle van FGF activiteit en hun nut bewezen in de chemische-schermen<sup&gt; 1</sup&gt;. Om vast te stellen methodiek voor high throughput hele organisme screens, hebben we een systeem ontwikkeld voor automatische beeldvorming en analyse van de zebravis embryo&#39;s op 24-48 uur na de bevruchting (HPF) in 96-well platen<sup&gt; 2</sup&gt;. In deze video belichten we de procedures voor de arraying transgene embryo&#39;s in multiwell platen bij 24hpf en de toevoeging van een klein molecuul (BCI), dat FGF signalering hyperactivates<sup&gt; 3</sup&gt;. De platen worden geïncubeerd gedurende 6 uur gevolgd door de toevoeging van tricaïne om larven voorafgaand aan de automatische imaging verdoven op een Molecular Devices ImageXpress Ultra laser scanning confocale HCS lezer. De beelden worden verwerkt door Definiens Developer software met behulp van een Cognition Network Technology algoritme dat we ontwikkeld voor het detecteren en expressie van GFP te kwantificeren in de hoofden van transgene embryo&#39;s. In dit voorbeeld hebben we aandacht voor het vermogen van het algoritme om dosis-afhankelijke effecten van de BCI maatregel op de GFP-reporter-gen expressie in de behandelde embryo&#39;s.

Wij rapporteren de ontwikkeling van een systeem voor geautomatiseerde beeldvorming en analyse van transgene zebravis embryo&#39;s in multiwell platen. Dit toont de mogelijkheid om dosisafhankelijke effecten van een klein molecuul, BCI, meten op fibroblast groeifactor reporter-gen expressie en leveren van technologie voor de oprichting van high-throughput zebravis chemische schermen.

Ontwikkeling van geautomatiseerde beeldvorming en analyse voor de zebravis chemische schermen.

Wij demonstreren de toepassing van een op beelden gebaseerde high-content screening (HCS)-methodologie om kleine moleculen te identificeren die de FGF/RAS/MAPK ... kunnen moduleren.

In deze video wordt beeldgebaseerde high-content screening uitgevoerd om de modulatie door kleine moleculen van de fibroblast growth factor Rasm map kinase-signaleringsroute te beoordelen. In zebravisembryo's worden transgene mannelijke en wildtype vrouwelijke zebravisen gekoppeld in een kweekbak. Bevruchte eitjes vallen naar de bodem, worden verzameld en overgebracht naar een petrischaal. De embryo's worden gedurende de nacht geïncubeerd en vervolgens geplaatst in individuele putjes van een 96-wells plaat met ronde bodems.Het kleine molecuul BCI wordt toegevoegd om FGF-signalering hyperactief te maken, waarna de plaat zes uur wordt geïncubeerd. Beelden van elk putje worden vastgelegd met een confocale plaatlezer en geanalyseerd met een zelfontworpen algoritme dat de fluorescentie-intensiteiten in specifieke embryonale structuren rapporteert. Hallo, ik ben Hiba Kado van het laboratorium van Dr. Michael Chang bij de afdeling Microbiologie en Moleculaire Genetica aan de Universiteit van Pittsburgh.Hoi, ik ben Andrea Spock van het Drug Discovery Institute van de University of Pittsburgh. Vandaag laten we u de procedure zien voor het fokken, selecteren en in een array plaatsen van zebravisembryo's voor chemische behandeling. In een 96-wells plaat gebruiken we transgene embryo's die rapporteren over fibroblastgroeifactoractiviteiten en die behandeld zijn met een molecuul dat dit signaalpad hyperactiveert.We laten u zien hoe we high-content screening-methodologie gebruiken om de activiteit van fibroblastgroeifactor in transgene zebravisembryo's automatisch te verwerven, te analyseren en te kwantificeren. Deze procedure belicht de platformtechnologie voor het gebruik van transgene zebravis en high-throughput chemische screens. Laten we beginnen.Identificeer twee dagen vóór de behandeling homozygote mannelijke transgene zebravisjes en plaats deze in individuele paartanks. Plaats scheidingsschermen in de tanks, voeg vervolgens aan elke tank een wild-type vrouwtje toe en laat de vissen een nacht in de paarkooien staan bij 28 °C. Verwijder de volgende ochtend het scheidingsscherm. Verplaats de vissen na één uur naar een nieuwe tank en giet de embryo's in een plastic zeef.Breng de embryo's over naar 100 millimeter petrischalen met E3-oplossing en incubeer ze bij 28 °C gedurende zes tot acht uur. Onderzoek na de incubatie de embryo's onder een stereomicroscoop. Embryo's die geschikt zijn voor experimenten, bevinden zich in het gastrulatiestadium.Verwijder op dit moment alle onbevruchte embryo's, die in het eencellige stadium zullen blijven. Verwijder daarnaast niet-levensvatbare embryo's die ondoorzichtig of misvormd lijken. Voeg vervolgens verse E three-oplossing toe en incubeer dit gedurende de nacht bij 28 °C.Plaats de embryo's de volgende dag onder een fluorescent stereomicroscoop om de transgene embryo's op basis van een vergelijkbaar stadium en uniformiteit te sorteren. GFP-expressie in embryo's van 24 HPF vertoont een zichtbare grens tussen midden- en achterhersenen met intense GFP-expressie en goed gevormde ogen met GFP-positieve dorsale retina's. Deze embryo's zijn actief en zullen met een plastic transferpipet bewegen en kronkelen in hun chorion.Overbreng de embryo's van 24 HPF één voor één naar individuele putjes van een 96-wells plaat. Verwijder met een micropipet elk overschot aan E three-oplossing uit de putjes. Voeg vervolgens met een multichannel-pipetteur 200 µL E three-oplossing toe aan elk putje.Voeg vervolgens twee microliters DMSO toe aan alle wells in kolom één en 12. Voeg daarna twee microliters BCL toe, bereid in DMSO, als volgt: één micromolar aan kolommen twee en zeven, vijf micromolar aan drie en acht, 10 micromolar aan vier en negen en 20 micromolar aan vijf en tien.Voeg micromolair toe aan kolommen vijf en 10. En voeg tot slot 25 micromolair toe aan kolom zes en 11. Dek de plaat nu af met aluminiumfolie en incubeer deze gedurende zes uur bij 28 °C.Voeg 10 µL trica toe aan elke put om de 30 HPF embryo's te anesthetiseren. Plaats de plaat vervolgens in de molecular devices image express ultra open meta express software. Kies een configuratie met een Forex-objectief en een maximale pinhole-diameter.Configureer de automatische laserfocus om de bodem van de plaat te detecteren en gebruik een vooraf bepaalde optimale Z-offset. Om de regio's van belang te detecteren, stelt u het scangebied in als een enkele locatie van 2000 bij 2000 pixels zonder binning. Selecteer het juiste plaattype en de 488 nanometer argonlaser bij excitatiegolflengten van 488 over emissiegolflengten van 525 nanometer.Select vervolgens een well met een met vehicle behandeld embryo en klik op 'find sample'. Het instrument voert een autofocus-scan uit en maakt één afbeelding om de juiste beeldacquisitie te bevestigen. Selecteer willekeurig een met vehicle behandelde well en maak een afbeelding.Controleer of de afbeelding scherp is en GFP-expressie in de kop vertoont. Plaats de cursor over de helderste gebieden en verifieer of de fluorescentie-intensiteit binnen het bereik van de 16-bit camera ligt, namelijk minder dan 65 000 eenheden.Herhaal deze stappen met een andere voertuigcontrole en enkele putjes die met het 화합물-complex zijn behandeld. Pas indien nodig het laservermogen en de gain aan, zodat de helderste regio's in de beelden van de positieve controle niet verzadigen. Kies vervolgens in het venster voor plaatacquisitie en -besturing voor 'acquire plate' om de plaatscan te starten.Het instrument zal automatisch één afbeelding per well voor de gehele microplaat vastleggen en deze archiveren in een SQL-serverdatabase. Zodra het scannen is voltooid, uploadt u de afbeeldingen naar D definition's. Developer door developer te openen met de slinger-optie ingeschakeld.Maak een nieuwe werkruimte aan. Selecteer vervolgens 'customized import' in het bestandmenu. Navigeer daarna naar de map waarin de afbeeldingen staan en open een voorbeeldbestand.Kies een importfilter dat het afbeeldingsformaat en de bestandsstructuur herkent die zijn gegenereerd door het Molecular Devices ImageXpress Ultra-platform. Om de beelden te verwerken, opent u nu een controleafbeelding en laadt u de gewenste Cognition Network Technology (CNT)-algoritme of regelset. Het hier gebruikte aangepaste algoritme is ontworpen om automatisch het embryo, de dooier en de kop te identificeren en om de helderheid en het oppervlak van GFP-expresserende kopstructuren te kwantificeren; voer de regelset uit tot de fase van kop- en dooierdetectie.Om een correcte toewijzing van de dooierzak en de kop te garanderen, dient de regelset te worden aangepast om de drempelwaarde voor de detectie van de dooier te wijzigen als de dooier te groot of te klein is. Voer vervolgens de regelset uit tot de fase van de detectie van heldere kopstructuren. Om een correcte toewijzing van GFP-expressiegebieden in de kop te garanderen, dient de regelset te worden aangepast om de drempelwaarde voor de detectie van kopstructuren te wijzigen als veelvouden van de minimale intensiteit, totdat de detectie van heldere kopstructuren overeenkomt met de visuele waarneming.Voer vervolgens de volledige regelset handmatig uit op enkele willekeurig gekozen afbeeldingen van embryo's behandeld met het vehikel en positieve controle-afbeeldingen van embryo's behandeld met PCI. Om het algoritme op alle plaat-afbeeldingen uit te voeren, selecteert u de platen die geanalyseerd moeten worden en kiest u Analyse. Navigeer vervolgens naar de geoptimaliseerde regelset en analyseer alle wells.Met behulp van de geïntegreerde taakplanner worden lege wells of ambigue beelden tijdens het scannen automatisch uitgesloten van de analyse. Er wordt een continu bijgewerkte keep-map weergegeven. Zowel de gegevens als de beelden zijn tijdens de run toegankelijk voor visuele inspectie.De numerieke gegevens en bewerkte beelden worden automatisch opgeslagen. Nadat alle beelden zijn geanalyseerd, kunnen de gegevens worden geëxporteerd naar software van derden, zoals Excel, GraphPad of Prism. Deze figuur toont gearchiveerde scan-beelden van een met voertuig behandelde en een met BCI behandelde well, met en zonder CNT-analyse.Toegepast groen fluorescerend eiwit of GFP wordt gedetecteerd in het oog, de grens tussen het midden- en achterbrein en de nervus trigeminus-ganglia van transgene embryo's. Let op dat zowel de GFP-intensiteit als de expressiedomeinen zijn uitgebreid. In de hier met BCI behandelde embryo's is een dosisafhankelijk effect van BCI op de expressie van het GFP-reportergen in transgene embryo's te zien.De concentratie die nodig is om een halfmaximale respons op te wekken, of EC 50, was ongeveer 12 micromolar. We hebben zojuist aangetoond hoe u transgene zebravissen kunt fokken, de embryo's kunt verzamelen en deze in 96-wells platen kunt rangschikken. We hebben toenemende concentraties PCI toegevoegd als activator van de signaleringsroute.We hebben ook aangetoond hoe de beeldvorming van transgene embryo's kan worden geautomatiseerd en hebben de beelden geanalyseerd met een op maat ontworpen algoritme op basis van cognitienetwerktechnologie. Met deze aanpak waren we in staat om op een graduele wijze kwantitatief de effecten van een klein-molecuulactivator van fibroblastgroeifactor-signalering te meten. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om embryo's zorgvuldig te selecteren om de variabiliteit tussen specimens te minimaliseren.Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

development-automated-imaging-analysis-for-zebrafish-chemical

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Large Scale zebravis-Based In vivo Kleine Molecule Screen

Hier beschrijven we een nieuwe, hoge-inhoud chemisch geinduceerde ontsteking test met het oog op de identificatie van immuun-modulerende bioactieve. We hebben met succes gecombineerd geautomatiseerde microscopie met op maat ontwikkelde software scripts voor directe kwantificering van de ontstekingsreactie en verdere verwerking van gegevens, analyse, mijnbouw, en opslag.

Faciliteren Drug Discovery: een geautomatiseerde high-content Ontsteking Assay in de zebravis

In dit artikel worden zebravisembryo's gebruikt voor het screenen van chemische toxiciteit. Chemische toxiciteit is gecorreleerd met fenotype-uitlezingen. Het monsterprotocol toont een methodologische benadering van het uitvoeren van de chemische toxiciteitsscreening.

Embryo-gebaseerd chemisch toxiciteitsscherm: effecten op de ontwikkeling van zebravisembryo's beoordelen

We beschrijven de procedure en de data-analyse van een chemische screening systeem voor glucocorticoïde stresshormoon signaleren met behulp van zebravis larven: de Glucocorticoid Responsive In vivo zebravis luciferaseactiviteit (Grizly) test. De test gevoelig en specifiek detecteert effecten op glucocorticoïd signalering door verbindingen die metabolization nodig hebben of van invloed endogene glucocorticoïden productie.

Een chemische Screening Procedure voor Glucocorticoid Signalering met een zebravis larve luciferasereporter System

Ons laboratorium ontwikkelde een nieuwe high-throughput geautomatiseerde imaging systeem dat nuttig is voor de detectie van verschillende gedragingen in 7 dagen oude zebravis larven. Het systeem kan worden gebruikt voor het detecteren van subtiele veranderingen in het gedrag na de larven zijn blootgesteld aan milieu-toxische stoffen of geneesmiddelen.

Geautomatiseerde High-throughput Behavioral Analyses in zebravis Larven

Hier beschreven is een protocol voor de semi-geautomatiseerde beeldvorming van weefsel-specifieke fluorescentie in zebravis embryo's.

Semi-geautomatiseerde beeldvorming van Tissue-specifieke fluorescentie in zebravis embryo&#39;s

De zebravis is een uitstekend experimenteel organisme om gewervelde ontwikkelingsprocessen en model menselijke ziekten te bestuderen. Hier, een protocol over hoe je een handmatige high-throughput chemische scherm presteren in de zebravis embryo's met een beschrijven we whole-mount in situ hybridisatie (WISH) uitgelezen.

A Manual Small Molecule Screen Naderend High-throughput Met behulp van zebravis embryo&#39;s

Hier presenteren we een protocol te ontwerpen en fabriceren van een embryo van de zebravis arraying sjabloon, gevolgd door een gedetailleerde procedure op het gebruik van deze sjabloon voor hoge doorvoer zebrafish embryo arraying in een 96-wells-plaat.

Een 3-dimensionale (3D)-sjabloon voor High Throughput Zebrafish Embryo Arraying afgedrukt

Zebravis embryo's worden gebruikt voor het evalueren van de toxiciteit van chemische verbindingen. Ze ontwikkelen zich extern en zijn gevoelig voor chemicaliën, waardoor subtiele fenotypische veranderingen kunnen worden opgespoord. Het experiment vereist slechts een kleine hoeveelheid stof, die direct wordt toegevoegd aan de plaat die embryo's bevat, waardoor het testsysteem efficiënt en kosteneffectief is.

Snelle evaluatie van de toxiciteit van chemische verbindingen met behulp van zebravis embryo's

Zebrafish xenograft modellen zorgen voor high-throughput drug screening en fluorescerende beeldvorming van menselijke kankercellen in een in vivo micro-omgeving. We ontwikkelden een workflow voor grootschalige, geautomatiseerde medicijnscreening op patiënt-afgeleide leukemiemonsters bij zebravissen met behulp van een geautomatiseerde fluorescentiemicroscoop uitgeruste imaging unit.

Drug Screening van primaire patiënt afgeleid tumor Xenografts bij zebravissen

We beschrijven de workflow en data-analyse van een screeningssysteem voor het evalueren van de toxiciteit van chemische verbindingen op basis van de schrikreactie van zebravisembryo's. Het systeem registreert de bewegingen van zebravisembryo's bij blootstelling aan een trillingsstimulus en maakt een geïntegreerde evaluatie van algemene toxiciteit/letaliteit en neuromusculaire toxiciteit mogelijk.

Evaluatie van de toxiciteit van chemicaliën met behulp van een Zebrafish Vibration Startle Response Screening System

Ontdek geautomatiseerde beeldvorming en analyse voor high-throughput chemische schermen in zebravisembryo's met transgene FGF-reporters. Deze methode kwantificeert dosisafhankelijke effecten van kleine moleculen op signaaltransductie.

Ontwikkeling van geautomatiseerde beeldvorming en analyse voor de zebravis chemische schermen.

Meer video's verkennen