Ontwikkeling van geautomatiseerde beeldvorming en analyse voor de zebravis chemische schermen.

In deze video wordt beeldgebaseerde high-content screening uitgevoerd om de modulatie door kleine moleculen van het fibroblastgroeifactor Ras-MAPK-signaalpad te beoordelen. In zebravisembryo's worden transgene mannelijke en wildtype vrouwelijke zebravis gepaard in een kweekkooi. Bevruchte eitjes vallen naar de bodem, worden verzameld en overgebracht naar een Petrischaal. De embryo's worden overnacht geïncubeerd en vervolgens geplaatst in individuele putjes van een 96-wells plaat met ronde bodem.

Het kleine molecuul BCI wordt toegevoegd om de FGF-signalering hyperte activeren en de plaat wordt zes uur geïncubeerd. Afbeeldingen van elke put worden vastgelegd met een confocale platenlezer en geanalyseerd met een zelfontworpen algoritme dat fluorescentie-intensiteiten in specifieke embryonale structuren rapporteert. Hallo, ik ben Hiba Kado van het laboratorium van Dr. Michael Chang van de afdeling Microbiologie en Moleculaire Genetica aan de Universiteit van Pittsburgh.

Hallo, ik ben Andrea Spock van het Drug Discovery Institute van de University of Pittsburgh. Vandaag laten we u de procedure zien voor het fokken, selecteren en in een array plaatsen van zebravissenembryo's voor chemische behandeling. In een 96-wells plaat gebruiken we transgene embryo's die de activiteiten van de fibroblastgroeifactor rapporteren en die behandeld zijn met een molecuul dat deze route hyperactiveert.

We laten u zien hoe we high content screening-methodologie gebruiken om de activiteit van fibroblastgroeifactor in transgene zebravisembryo's automatisch te verwerven, te analyseren en te kwantificeren. Deze procedure belicht de platformtechnologie voor het gebruik van transgene zebravis en high-throughput chemische screens. Laten we beginnen.

Identificeer twee dagen vóór de behandeling homozygote mannelijke transgene zebravisjes en plaats deze in individuele paartanks. Voeg scheidingswanden toe aan de tanks, plaats vervolgens een wild-type vrouwtjesvis in elke tank en laat de vissen een nacht in de paarkooien bij 28 °C. Verwijder de volgende ochtend de scheidingswand. Verplaats de vissen na één uur naar een nieuwe tank en giet de embryo's in een plastic zeef.

Breng de embryo's over naar 100 millimeter petrischalen met E3-oplossing en incubeer deze bij 28 graden Celsius gedurende zes tot acht uur. Inspecteer de embryo's na de incubatie onder een stereomicroscoop. Embryo's die geschikt zijn voor experimenten, bevinden zich in het gastrulatiestadium.

Verwijder op dit moment alle onbevruchte embryo's, die in het eencellige stadium zullen blijven. Verwijder daarnaast niet levensvatbare embryo's die opaak of misvormd lijken. Voeg vervolgens verse E drie-oplossing toe en incubeer dit gedurende de nacht bij 28 °C.

Plaats de embryo's de volgende dag onder een fluorescent stereomicroscoop om de transgene embryo's te sorteren op basis van een vergelijkbaar stadium en uniformiteit. GFP-expressie in embryo's van 24 HPF vertoont een zichtbare grens tussen midden- en achterbrein met intense GFP-expressie en goed gevormde ogen met GFP-positieve dorsale retina's. Deze embryo's zijn actief en zullen met een plastic transferspipet bewegen en kronkelen in hun chorion.

Breng de 24 HPF embryo's één voor één over naar individuele putjes van een 96-wellplaat. Verwijder met een micropipet eventuele overtollige E three-oplossing uit de putjes. Voeg vervolgens met een meerkanaals pipetteur 200 microliters E three-oplossing toe aan elk putje.

Voeg vervolgens twee µL DMSO toe aan alle putjes in kolommen 1 en 12. Voeg daarna twee µL BCL toe, geprepareerd in DMSO, als volgt: 1 µM aan kolommen 2 en 7, 5 µM aan 3 en 8, 10 µM aan 4 en 9, en 20 µM aan de overige kolommen.

Voeg micromolair toe aan kolommen vijf en 10. En tenslotte 25 micromolair aan kolom zes en 11. Dek de plaat nu af met aluminiumfolie en incubeer deze gedurende zes uur bij 28 °C.

Voeg 10 µL trica toe aan elke put om de 30 HPF embryo's te anesthetiseren. Plaats de plaat vervolgens in de Molecular Devices ImageXpress Ultra Open Meta Express-software. Kies een configuratie met een 4x objectief en een maximale pinhole-diameter.

Configureer de automatische laserfocus om de bodem van de plaat te detecteren en gebruik een vooraf bepaalde optimale Z-offset. Om de regio's van interesse te detecteren, stelt u het scangebied in als één enkele site van 2000 bij 2000 pixels zonder binning. Selecteer het juiste plaattype en de 488 nanometer argonlaser bij excitatiegolflengten over emissiegolflengten van 488 over 525 nanometer.

Selecteer vervolgens een put met een embryo dat is behandeld met het vehikel en klik op 'find sample'. Het instrument voert een autofocusscan uit en neemt een enkele afbeelding op om de juiste beeldverwerving te bevestigen. Selecteer willekeurig een put die met het vehikel is behandeld en neem een afbeelding op.

Controleer of het beeld scherp is en GFP-expressie in de kop vertoont. Plaats de cursor boven de helderste gebieden en verifieer of de fluorescentie-intensiteit binnen het bereik van de 16-bit camera ligt, namelijk minder dan 65.000 eenheden.

Herhaal deze stappen met een andere voertuigcontrole en enkele met verbindingen behandelde wells. Pas indien nodig het laservermogen en de gain aan, zodat de helderste regio's in de beelden van de positieve controle niet verzadigen. Kies vervolgens in het venster voor plaatacquisitie en -besturing voor 'acquire plate' om de plaatscan te starten.

Het instrument zal automatisch één afbeelding per put voor de gehele microplaat verwerven en deze archiveren in een SQL-serverdatabase. Zodra het scannen is voltooid, uploadt u de afbeeldingen naar D-definities. Developer door de Developer te openen met de slinger-optie ingeschakeld.

Maak een nieuwe werkruimte aan. Selecteer vervolgens in het bestandmenu 'customized import'. Navigeer daarna naar de map met de afbeeldingen en open een voorbeeldbestand.

Kies een importfilter dat het afbeeldingsformaat en de bestandsstructuur herkent die zijn gegenereerd door het Molecular Devices Image Express Ultra-platform. Open nu om de beelden te verwerken een controleafbeelding en laad de gewenste Cognition Network Technology-technologie, het CNT-algoritme of de regelset. Het hier gebruikte aangepaste algoritme is ontworpen om embryo, dooier en kop automatisch te identificeren en om de helderheid en het oppervlak van GFP-expresserende kopstructuren te kwantificeren; voer de regelset uit tot de fase van detectie van de kop en de dooier.

Om een juiste toewijzing van de dooierzak en de kop te garanderen, dient de regelset te worden aangepast om de detectiedrempel van de dooier te wijzigen als de dooier te groot of te klein is. Voer vervolgens de regelset uit tot de fase van detectie van heldere kopstructuren. Om een juiste toewijzing van GFP-expressiegebieden in de kop te garanderen, dient de regelset te worden aangepast om de detectiedrempel voor kopstructuren te wijzigen als veelvouden van de minimale intensiteit, totdat de detectie van heldere kopstructuren overeenkomt met de visuele waarneming.

Voer vervolgens de volledige regelset handmatig uit op enkele willekeurig gekozen afbeeldingen die zijn gegenereerd uit met vehicle behandelde embryo's en positieve controle-afbeeldingen van met PCI behandelde embryo's. Om het algoritme op alle plaat-afbeeldingen uit te voeren, selecteert u de te analyseren platen en kiest u Analyse. Navigeer vervolgens naar de geoptimaliseerde regelset en analyseer alle wells.

Met behulp van de geïntegreerde taakplanner worden lege putjes of ambigue beelden tijdens de scan automatisch uitgesloten van de analyse. Er wordt een continu bijgewerkte 'keep map' weergegeven. Zowel de gegevens als de beelden zijn tijdens de run toegankelijk voor visuele inspectie.

De numerieke gegevens en bewerkte afbeeldingen worden automatisch opgeslagen. Nadat alle afbeeldingen zijn geanalyseerd, kunnen de gegevens worden geëxporteerd naar software van derden, zoals Excel, GraphPad of Prism. Deze figuur toont gearchiveerde scanafbeeldingen van een voertuig dat is behandeld en een BCI-behandelde put, met en zonder CNT-analyse.

Toegepast groen fluorescent protein of GFP wordt gedetecteerd in het oog, de grens tussen mid- en achterhersenen en de nervus trigeminus-ganglia van transgene embryo's. Let op dat zowel de GFP-intensiteit als de expressiedomeinen zijn uitgebreid. In de hier behandelde BCI-embryo's is een dosisafhankelijk effect van BCI op de expressie van het GFP-reportergen in transgene embryo's zichtbaar.

De concentratie die nodig is om een halfmaximale respons op te wekken, of EC 50, was ongeveer 12 micromolar. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u transgene zebravisembryo's kunt fokken, verzamelen en in 96-wells platen kunt rangschikken. We hebben toenemende concentraties PCI toegevoegd als activator van de signaleringsroute.

We hebben ook aangetoond hoe de beeldvorming van transgene embryo's kan worden geautomatiseerd en hebben de beelden geanalyseerd met een op maat gemaakt algoritme op basis van cognitie-netwerktechnologie. Met deze aanpak waren we in staat om de effecten van een kleine moleculaire activator van fibroblastgroeifactor-signalering kwantitatief en in gradaties te meten. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de embryo's zorgvuldig moeten worden geselecteerd om de variabiliteit tussen de specimens te minimaliseren.

Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.