Met behulp van een geautomatiseerde cel Counter aan Gene Expression Studies Vereenvoudigen: siRNA Knockdown van IL-4 Afhankelijk van genexpressie in cellen Namalwa

Het algemene doel van deze procedure is om electroporatie te gebruiken om siRNAs in cellen te introduceren die moeilijk te transfecteren zijn, om zo genexpressie te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst de benodigde hoeveelheid cel-suspensie te bepalen met behulp van de TC 10. Automatische celteller; vervolgens wordt irna aan de cel-suspensie toegevoegd en worden de cellen geëlectroporeerd.

Met behulp van het MXL-elektroporatiesysteem worden de cellen 24 uur na de elektroporatie geïncubeerd. Vervolgens wordt IL-4 toegevoegd om gentranscriptie in de experimentele cellen te induceren. Tot slot wordt RNA geëxtraheerd en wordt real-time PCR gebruikt om de niveaus van genexpressie te meten.

Uiteindelijk kunnen resultaten worden behaald die het effect van specifieke siRNAs op genexpressiepaden aantonen. Hallo, ik ben Adam McCoy, senior scientist voor de afdeling genexpressie van Bio Rad Laboratories. Vandaag laten we u de procedure zien voor het introduceren van RNA's in moeilijk te transfecteren cellijnen via elektroporatie, om vervolgens te kijken naar de effecten op de genexpressie.

Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de genexpressie van individuele genen te analyseren of om genpaden te bestuderen door één gen uit te schakelen en te zoeken naar downstream-effecten. Laten we beginnen. Verwijder de cellen uit een kweekfles terwijl u werkt in een celkweekkast.

De cellen die in dit protocol worden gebruikt, zijn suspensiecellen. Als u adherente cellen gebruikt, moeten deze eerst met trypsine worden losgemaakt voordat u ze verwijdert. Centrifugeer de cellen om ze te pelletteren.

Nadat de cellen zijn gecentrifugeerd, verwijdert u het supernatant en resuspendeert u de cellen in PBS. Om het aantal levende cellen te bepalen, neemt u een aliquot van de celsuspensie en voegt u tryanblauw-kleurstof toe in een verhouding van één op één om de dode cellen te kleuren. Tryanblauw is vereist voor de beoordeling van levende en dode cellen, maar niet voor de totale cel telling.

Pipetteer het mengsel enkel op de opening van een wegwerptelplaatje en plaats deze in de TC 10 automatische celteller. De TC 10 zal eerst automatisch scherpstellen om de meest nauwkeurige telling te garanderen, waarna we beginnen met het tellen van de cellen. Het aantal levende en totale cellen per milliliter in het monster wordt weergegeven.

Selecteer 'afbeelding weergeven' om de cellen op het weergave scherm te tonen. Gebruik vervolgens de pijltoetsen omhoog of omlaag. Zoom indien nodig in of uit om de benodigde hoeveelheid celсусpensie voor experimenten te berekenen en selecteer 'verdunningscalculator'.

Voer de gewenste concentratie- en eindvolumewaarden voor dit experiment in. Er zullen in totaal 16 monsters worden klaargemaakt, inclusief duplicaten voor elke behandeling. Er is dus in totaal 3,6 milliliters van een suspensie van 5 × 10⁶ cellen per milliliter nodig.

De celteller rapporteert vervolgens het benodigde volume van de celsuspensie op basis van het aantal levende cellen en de ingevoerde doelwaarden. Als TRIAM blue is gebruikt, zal de teller automatisch corrigeren voor de gebruikte één-op-één verdunning. Draag nu, onder een zuurkast, het berekende volume van de celsuspensie over naar een nieuwe buis.

Centrifuge vervolgens de celmengsels om de cellen te pelletteren. Bereid tijdens het centrifugeren de microcentrifugebuisjes voor de elektroporatie voor door SIR A aan elk buisje toe te voegen. Voor dit experiment worden één controle-irna, twee stat six-specifieke siRNAs en onbehandelde controles voorbereid. Verwijder na de centrifugatie de PBS en resuspendeer de cellen in 3,6 milliliters gene Pulser-elektroporatiebuffer. Breng aliquots van 800 microliter over in de buisjes met de betreffende IRNA en meng deze voorzichtig.

De cellen zijn nu gereed voor elektroporatie om alle monsters gelijktijdig te behandelen. Breng met behulp van het MXL-elektroporatiesysteem 150 µL van elke celсусpensie over naar de juiste putjes van een 96-wells elektroporatieplaat. Plaats de plaat vervolgens in de plaatkamer van het MXL-elektroporatiesysteem en sluit het deksel.

Selecteer het gewenste electroporatieprotocol en druk op pulse om de cellen te behandelen. Wanneer de electroporatie voltooid is, verwijdert u de plaat uit het instrument en overbrengt u de cellen naar een nieuwe weefselkweekplaat met voorverwarmd medium. Breng vervolgens voor elk monster 150 µL niet-getransfecteerde controlecellen over naar de nieuwe schaal. Plaats de cellen daarna gedurende de nacht bij 37 °C en 5% carbon dioxide.

Na 24 uur wordt IL four gebruikt om gentranscriptie in één set cellen te induceren, terwijl aan de tweede set alleen medium wordt toegevoegd. Eén IL four wordt aan de cellen toegevoegd. Incubeer nogmaals 24 uur bij 37 °C en 5% CO2 na een totale groeiperiode van 48 uur.

Er kunnen grote verschillen in celdichtheid optreden als de experimentele behandeling de celdeling beïnvloedt. Daarom is het raadzaam om de TC 10 automatische celsteller te gebruiken om de cellen snel opnieuw te tellen op basis van de celgetallen. Draag één aliquot van elke put over naar een microcentrifugebuisje voor RNA-extractie en vries deze in.

Een tweede aliquot voor western blotting of andere eiwitanalyses. Vandaag wordt alleen de RNA-workflow getoond. Centrifugeer de monsters om de cellen te pelletteren.

Verwijder vervolgens het supernatant uit elke buis en gooi dit weg. Ga verder met de RNA-extractie met behulp van de orum total RNA kit. Zodra het RNA is geëxtraheerd, dient men onmiddellijk over te gaan tot de analyse, waarbij de monsters op ijs worden bewaard.

Om de RNA-kwaliteit en -kwantiteit in één stap te verifiëren, gebruikt u het geautomatiseerde elektroforese-station van Experian; hitte-denatureer de monsters en de Experian RNA-ladder en plaats deze op ijs. Voeg een bereid mengsel van gel en kleurstof toe aan de priming. Plaats de primingcode op het primingstation op een RNA-chip.

Plaats de chip in het geautomatiseerde primingstation en druk op start. Verwijder de chip uit het primingstation en load de chip. Vortex de chip om de monsters met de loadbuffer te mengen.

Plaats de chip in het elektroforese-station en start de run. De Experian-software zal de resultaten automatisch weergeven in de vorm van een elektroferogram, een resultatentabel waarin de RNA-concentratie, de ribosomale ratio en het RNA-kwaliteitsindicatienummer (RQI) worden getoond, en een virtuele gel die lijkt op een traditionele RNA-gel. Hoogwaardige totale RNA-monsters hebben doorgaans een RQI van 8 tot 10.

Nadat de RNA-kwaliteit is geverifieerd, worden hier de cDNA-synthese-reacties voorbereid. De IS script ONEstep R-T-P-C-R mix wordt gebruikt om cDNA-synthese en real-time PCR te combineren. Maak voor elke primer-set één mastermix die alle reactiecomponenten bevat, behalve de RNA-templates.

Verdeel vervolgens het mengsel over de putjes van een PCR-plaat. Voeg na het verdunnen van het RNA tot een uniforme concentratie de monsters in drievoud toe aan de juiste putjes. Sluit de plaat af, plaats deze in het realtime PCR-apparaat, selecteer het juiste protocol en start de run; zodra de run is voltooid, kunnen de realtime traces worden gebruikt om de expressieniveaus te bepalen.

De software berekent de genormaliseerde genexpressie uit de gegevens op basis van de relatieve expressie van experimentele en referentiegenen in behandelde en gecontroleerde cellen. Deze figuur geeft een overzicht van de IL four signaalroute: de binding van IL four aan zijn receptor leidt tot dimerisatie en activatie van STAT six; geactiveerd STAT six transloceert naar de kern en activeert de transcriptie van zijn doelwit.

Bij genen zoals CCL 17 zal de transcriptie van CCL 17 zonder IL-4-inductie op lage constitutieve niveaus blijven na siRNA-gemedieerde silencing van het STAT6-gen. Behandeling met IL-4 zou moeten leiden tot een geringe of geen toename in de expressie van CCL 17. De inductie van CCL 17 door IL-4 werd onder verschillende omstandigheden gemeten via kwantitatieve real-time PCR.

PCR-monsters die zijn gekweekt zonder IL-4 vertoonden een laag constitutief expressieniveau. Ongeacht de siRNA, reageerden de controlemonsters A, weergegeven in groen en blauw, normaal op de behandeling met IL-4 met een acht- tot tienvoudige inductie van CCL17. Echter, cellen die waren getransfecteerd met siRNA's gericht tegen STAT6, weergegeven in rood en roze, vertoonden een verminderde CCL17-expressie als reactie op IL-4, wat het idee ondersteunt dat STAT6 een rol speelt bij de IL-4-geïnduceerde expressie van CCL17.

We hebben zojuist gedemonstreerd hoe siRNA's in een moeilijk te transfecteren suspensie-cellijn kunnen worden gebracht en hoe de genexpressie in deze cellen kan worden gevolgd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat alle stappen voor alle monsters zo consistent mogelijk worden uitgevoerd. Dat is alles.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.