Name: Met behulp van een geautomatiseerde cel Counter aan Gene Expression Studies Vereenvoudigen: siRNA Knockdown van IL-4 Afhankelijk van genexpressie in cellen Namalwa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Leer hoe u siRNA introduceert in moeilijk transfereerbare cellijnen met elektroporatie en automatische celcounting. Deze methode analyseert IL-4-afhankelijke genexpressie via real-time PCR in Namalwa-cellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

1. Het voorbereiden en het tellen van de cellen Namalwa <ol><li> Verwijder de cellen van cultuur kolf en centrifuge de cellen pellet. Verwijder supernatant en resuspendeer cellen in een bekend volume van de PBS. De cellen die worden gebruikt in dit protocol zijn suspensie-cellen. Als u gebruik maakt van hechtende cellen je nodig hebt om trypsinize voor het verzamelen. </li><li> Voor het bepalen van het aantal levende cellen, vlek een aliquot van de celsuspensie door het te mengen 1:1 met een 0,4% trypan blauwe oplossing en pipet 10 pi van het mengsel op een glijbaan te tellen, en plaats de dia in de TC 10 automatisch cel teller (Bio-Rad Laboratories, Inc). </li><li> De TC 10 celgetalmeter zal autofocus om de meest nauwkeurige telling te verzekeren, en ga verder met het tellen. Het bepaalt automatisch de dichtheid van levende cellen en totale cellen in het monster. </li><li> Selecteer de afbeelding om te bekijken van de cellen op het viewscreen display. Selecteer vervolgens de verdunning rekenmachine om de TC 10 celgetalmeter hebben automatisch berekent het bedrag van cel mengsel dat nodig zal zijn. </li><li> Dit experiment is met behulp van een totaal van drie siRNA's: een controle siRNA en twee verschillende siRNA's gericht op de STAT6 gen, plus ongetransfecteerde controles. Dit vereist 3,6 ml bij een uiteindelijke concentratie van 5 X 10 6 cellen per ml. </li><li> Voer de gewenste concentratie en laatste deel waarden in de verdunning rekenmachine, en het berekent het volume van de celsuspensie die nodig zijn op basis van de levende cellen tellen voor dat monster. U kunt ook handmatig de berekening. Vervolgens overbrengen van het vereiste volume van de cel mengsel voor deze experimenten in een nieuwe buis. </li><li> Spin de cel mengsels pellet de cellen en verwijder alle PBS. Resuspendeer in 3,6 ml van Gene Puiser elektroporatie buffer (Bio-Rad Laboratories). Transfer 800 ul monsters in buizen met daarin de juiste siRNA's en meng voorzichtig. De cellen zijn nu klaar voor elektroporatie. </li></ol> 2. Electroporating de cellen in 96-well platen <ol><li> De 96-well plaat elektroporatie kan de duplo's voor alle vier de behandelingen om samen te zijn geëlektroporeerd. </li><li> Overdracht 150 pi van de celsuspensie in de juiste wells van een 96-wells plaat elektroporatie. </li><li> Plaats de plaat in de MXcell elektroporatie plaat kamer en sluit het deksel. </li><li> Electroporate met de instellingen geoptimaliseerd voor de cellijn en de buffer wordt gebruikt. Deze cellen zijn geëlektroporeerd met behulp van een exponentiële verval golf met een instrument instellingen van 250 V, 350 uF, en 1000 Ω weerstand. </li><li> Na de elektroporatie is voltooid, pipet op en neer voorzichtig in elk putje om vervolgens mengen en cellen over te dragen aan een weefselkweek plaat met voorverwarmde media. Namalwa cellen worden gekweekt in RPMI (Life Technologies), aangevuld met 7,5% FCS en 1% pyruvaat. </li><li> Controlemonsters die niet zijn geëlektroporeerd worden genomen van de resterende celsuspensie en toegevoegd aan de cultuur gerechten van voorverwarmde kweekmedium identiek aan de geëlectroporeerd cellen. </li><li> Incubeer cellen een nacht bij 37 ° C met 5% CO 2. </li><li> Na 24 uur werd een verzameling cellen geïnduceerd met 10 ng / ml uiteindelijke concentratie recombinant IL-4 (R &amp; D Systems). De tweede set van controle cellen alleen aanvullende media. Alle cellen worden geïncubeerd een extra 24 uur bij 37 ° C en 5% CO 2. </li></ol> 3. Extract en controleer RNA <ol><li> Na een totaal van 48 uur van de groei, de telling van de cellen in elk putje, en de overdracht een aliquot van elk putje naar een microfugebuis voor RNA-extractie en het bevriezen van een tweede volume voor de western blotting of andere eiwit analyse. </li><li> Centrifuge monsters naar pellet de cellen, en vervolgens te verwijderen en het supernatant gooi van elk buisje. </li><li> Ga verder met de RNA-extractie. Wij gebruiken meestal de Aurum totaal RNA kit (Bio-Rad) volgens de meegeleverde protocol. </li><li> Bij het bewaken van siRNA gemedieerde gen knock-down is het vooral belangrijk om te controleren of RNA-kwaliteit, omdat gedegradeerd RNA geeft misleidende resultaten. De 260/280 verhouding geeft niet aan RNA integriteit daarom is het belangrijk om de monsters lopen op een gel of microfluïdische apparaat om te controleren RNA worden niet afgebroken. </li><li> Voor de beoordeling van zowel de kwaliteit en kwantiteit in een stap, zullen deze monsters worden geanalyseerd met behulp van de Experion automatische elektroforese-systeem (Bio-Rad). </li><li> De eerste, warmte monsters. Vervolgens, prime, laden en vortex de Experion RNA-chip. Plaats de chip in de Experion elektroforese station en begin met lopen. </li><li> Na de run is voltooid, wordt de software automatisch Experion resultaten weergeven in de vorm van een electropherogram, resultaten tafel (dat wordt weergegeven RNA-concentratie, ribosomale ratio, en de RNA-kwaliteit indicator nummer), en virtuele gel (die lijkt op een traditionele RNA gel). Hoge kwaliteit totaal RNA monsters hebben typisch een RQI van 8-10. </li> 4. Real-time PCR <ol><li> Na verificatie van de RNA-kwaliteit, verder met de cDNA reacties. Dit experiment gebruikte de iScript een-stap RT-PCR-mix (Bio-Rad) om cDNA synthese en real-time PCR combineren in een reactie. </li><li> Maak een meester mix met alle reacties op andere onderdelen dan de RNA-sjablonen voor elke primer in te stellen en te verspreiden die in de PCR-plaat. </li><li> Na verdunning van het RNA om een ​​uniforme concentratie, voeg de RNA monsters naar de juiste bronnen. Elke reactie wordt opgezet in drievoud. </li><li> Seal de plaat, en plaats deze in de CFX384 real-time PCR-systeem (Bio-Rad). Selecteer het juiste protocol en beginnen met het lopen. </li><li> Zodra de run is voltooid, wordt genexpressie bepaald door het vergelijken van gen-expressie van het gen van belang genormaliseerd naar een referentie-gen in cellen geëlektroporeerd met experimentele siRNA om dezelfde normalisering van de cellen geëlektroporeerd met een controle siRNA. </li></ol> 5. Analyse van de siRNA knock-down <ol><li> De expressie van CCL17 werd gecontroleerd met behulp van kwantitatieve real-time PCR om de rol van de transcriptionele activator STAT6 onderzoeken in IL-4 afhankelijke inductie van CCL17. Voor dit experiment werd GAPDH gebruikt als een referentie-gen. Alternatieve referentie-genen of meerdere referentie-genen kunnen worden gebruikt op dezelfde manier. </li><li> De CFX Manager-software automatisch genormaliseerd CCL17 expressie om expressie van het referentie-gen van hetzelfde monster en automatisch vergeleken de resulterende genormaliseerde waarden op behandelingen bedienen door eenvoudig te selecteren GAPDH als "referentie" en de controle behandeling (controle siRNA zonder IL-4 inductie) als "controle" in het experiment instellingen venster van de CFX manager software. </li><li> Zonder IL-4 inductie, transcriptie van CCL17 bleef op een laag, constitutieve niveaus die vergelijkbaar zijn met de controle-behandeling. </li><li> Cellen geïnduceerd met IL-4 en behouden van een normale STAT6 pad (dat wil zeggen, controle siRNA of ongetransfecteerde controle behandelingen) toonde 8-10 maal inductie van CCL17 expressie. </li><li> Cellen geïnduceerd met IL-4, maar met STAT6 uitdrukking geremd door de introductie van een van beide STAT6 siRNA bleek slechts ongeveer twee maal hoger CCL17 expressie dan de niet-geïnduceerde cellen bevestiging van de rol van STAT6 in de IL-4 geïnduceerde expressie van CCL17. </li></ol> 6. Representatieve resultaten <img src="/files/ftp_upload/1904/1904fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Overzicht van de IL-4 signaalweg. A) Binding van IL-4 aan de receptor leidt tot dimerisatie en activering van STAT6. Geactiveerd STAT6 naar de kern en activeert transcriptie van zijn doel genen, zoals CC17. B) zonder IL-4 inductie, zal de transcriptie van CCL17 blijven op een laag, constitutief niveaus. C) Na siRNA-gemedieerde zwijgen van de STAT6 gen, moet de behandeling met IL4 leiden tot weinig of geen toename van CCL17 expressie. <img src="/files/ftp_upload/1904/1904fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Inductie van CCL17 door IL4 gemeten door verschillende omstandigheden met behulp van kwantitatieve real-time PCR. A) monsters geteeld zonder IL-4 had een lage constitutieve niveau van expressie, ongeacht van genexpressie. B) Zoals in groen en blauw, controlemonsters reageerde normaal op de behandeling met IL-4, met een 8-10 maal inductie van CCL17. Echter, cellen getransfecteerd met siRNA gericht op STAT6, weergegeven in rood en roze, had verminderd CCL17 expressie in reactie op IL-4, het ondersteunen van het idee dat STAT6 speelt een rol in de IL-4 geïnduceerde expressie van CCL17. </ol>

De auteur is werkzaam bij Bio-Rad Laboratories, dat reagentia en instrumenten gebruikt in dit artikel oplevert.

Dit artikel heeft aangetoond hoe siRNA electroporate in een moeilijk tot opschorting cellijn transfecteren en hoe genexpressie te volgen in deze cellen. Bij het doen van deze procedure is het belangrijk om te onthouden om de dingen zo consistent mogelijk in alle monsters te houden.

met behulp van een geautomatiseerde cel counter aan gene expression studies vereenvoudigen: sirna knockdown van il-4 afhankelijk van genexpressie in cellen namalwa

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Het gebruik van siRNA gemedieerde gen knockdown blijft een belangrijk instrument in studies van genexpressie worden. siRNA studies worden uitgevoerd, niet alleen om de effecten van downregulating enkele genen te bestuderen, maar ook om signaalwegen en andere complexe interactie netwerken ondervragen. Deze pad analyses vereisen zowel het gebruik van relevante cellulaire modellen en methoden die minder storing van de cellulaire fysiologie kunnen veroorzaken. Elektroporatie wordt in toenemende mate gebruikt als een effectieve manier om siRNA en andere nucleïnezuren te introduceren in moeilijk te cellijnen en primaire cellen transfecteren zonder dat de signaleringsroute in onderzoek. Er zijn meerdere kritische stappen naar een succesvolle siRNA experiment, en er zijn manieren om het werk te vereenvoudigen, terwijl het verbeteren van de kwaliteit van gegevens op verschillende experimentele fase. Om u op weg helpen met uw siRNA gemedieerde gen knockdown project, zullen we laten zien hoe je een pad studie te voltooien van het verzamelen en tellen van de cellen voorafgaand aan de elektroporatie door na transfectie real-time PCR-genexpressie analyse uit te voeren. De volgende studie onderzoekt de rol van de transcriptionele activator STAT6 in IL-4 afhankelijke genexpressie van CCL17 in een Burkitt lymfoom cellijn (Namalwa). Aangetoond dat de technieken zijn nuttig voor een brede waaier van siRNA-gebaseerde experimenten op zowel hechtende en ophanging cellen. We zullen ook zien hoe de cel tellen met de TC 10 geautomatiseerde cel tegen te gaan, hoe u meerdere monsters tegelijk met het MXcell elektroporatie systeem electroporate, en hoe tegelijkertijd te beoordelen RNA kwaliteit en kwantiteit van de Experion geautomatiseerde elektroforese te vereenvoudigen.

Deze procedure beschrijft een snelle en eenvoudige workflow om siRNA te introduceren in moeilijk om cellijnen te transfecteren en gen-expressie te volgen door real-time PCR. Het gebruik van een geautomatiseerd celgetalmeter, multi-well plaat elektroporatie, en geautomatiseerde elektroforese station zorgen voor een snelle en betrouwbare resultaten, zonder de noodzaak voor dure robot handling.

Met behulp van een geautomatiseerde cel Counter aan Gene Expression Studies Vereenvoudigen: siRNA Knockdown van IL-4 Afhankelijk van genexpressie in cellen Namalwa

Het gebruik van siRNA-gemedieerde gen-knockdown blijft een belangrijk instrument in studies naar genexpressie. siRNA-studies worden niet alleen uitgevoerd ...

<a class="grey_button" href="/video/2163">
Chinees
</a>

using-an-automated-cell-counter-to-simplify-gene-expression-studies

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier gebruiken we een menselijke esiRNA bibliotheek in een high-throughput screen voor genen die betrokken zijn bij de celdeling. Laten we zien hoe het opzetten en uitvoeren een esiRNA schermen, en hoe te analyseren en valideren van de resultaten.

MISSIE esiRNA voor RNAi Screening in zoogdiercellen

Het endoplasmatisch reticulum speelt een belangrijke rol in de eiwit-biogenese en in de calcium homeostase. We hebben een experimenteel systeem dat ons in staat stelt om de rol van Ca2 + lekkage te verhelpen en om hun vermeende regulerende mechanismen te karakteriseren. Dit systeem houdt in siRNA gemedieerde gene silencing en live cell imaging Ca2 +.

Live-Cell Calcium Imaging Gecombineerd met siRNA gemedieerde gen-silencing Identificeert Ca 2 + Lek Kanalen in het ER membraan en de regulerende mechanismen

Bijdrage van de ACF chromatine remodeling factor E4orf4-geïnduceerde celdood werd gemeten. Het protocol omvat selectie celklonen waarin doxycycline induceert voorwaardelijke knockdown van de ACF subeenheden Acf1 en SNF2h en het gebruik van de DAPI assay E4orf4 geïnduceerde celdood meten in de induceerbare cellijnen.

Voorbereiding van Cell-lijnen voor Conditional Knockdown van genexpressie en meting van de Knockdown Effecten op E4orf4-geïnduceerde celdood

In dit protocol beschrijven we methoden om efficiënt muis macrofaag cellijnen te transfecteren met siRNA's met behulp van het Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle Systeem, de macrofagen te stimuleren met lipopolysaccharide, en de effecten op de productie van inflammatoire cytokinen te monitoren.

Met behulp van RNA-interferentie te onderzoeken de aangeboren immuunrespons in muizenmacrofagen

Gepresenteerd is een flexibele informatica workflow waardoor multiplex-image-based analyse van fluorescent gelabelde cellen. De workflow kwantificeert nucleaire en cytoplasmatische markers en berekent marker translocatie tussen deze compartimenten. Procedures zijn voorzien verstoring van cellen met siRNA en betrouwbare methode voor het merkerdetectie door indirecte immunofluorescentie in 96-well formaat.

Workflow voor High-inhoud, individuele cel Kwantificering van fluorescente merkers van Universal Microscoop gegevens, Ondersteund door Open Source Software

We beschrijven een methode om enkele zoogdiercellen te sorteren en om de expressie van maximaal 96 doelgenen van belang in elke cel te kwantificeren. Deze methode omvat het gebruik van interne qPCR-standaarden om de schatting van absolute transcripttellingen mogelijk te maken.

Eencellige Gene Expression Profiling Met behulp van FACS en qPCR met interne standaarden

Dit protocol fungeert als een regeling voor de oprichting van een functioneel Tet-ON systeem in cellijnen van kanker en het latere gebruik ervan, in het bijzonder voor de studie van de rol van tumor cel afkomstige eiwitten in de aanwerving van monocyten/macrofagen aan de communicatie van de tumor.

Voorwaardelijke Knockdown van genexpressie in kanker cellijnen te bestuderen van de aanwerving van monocyten/macrofagen naar de Tumor communicatie

Dit protocol biedt een workflow op hoe te combineren met kunstmatige microRNA-gemedieerde RNA-interferentie met optogenetics te stimuleren specifiek presynaptische los met verminderde expressie van selectieve gene(s) binnen intact neuronale circuits.

Optogenetics combineren met kunstmatige microRNAs te karakteriseren van de effecten van Gene Knockdown op presynaptische functie binnen Intact neuronale Circuits

Hier presenteren we een protocol om genetisch wijzigen van primaire of uitgebreide menselijke natural killer (NK) cellen met behulp van Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs). Met behulp van dit protocol, we genereerden menselijke NK cellen tekort voor Transformeren groeifactor-b receptor 2 (TGFBR2) en hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).

Generatie van Knock-out primaire en uitgebreide menselijke NK-cellen met behulp van Cas9 Ribonucleoproteins

Dit experimentele protocol biedt een stabiele, kosteneffectieve en efficiënte methode die lncRNA-knockdown combineert met kolonievormende assays om het effect van lncRNA op de proliferatie van osteosarcoomcellen te kwantificeren.

Kolonievormingstest Detecteer de proliferatieve capaciteit van LncRNA-knockdown osteosarcoomcellen

Leer hoe u siRNA introduceert in moeilijk transfereerbare cellijnen met elektroporatie en automatische celcounting. Deze methode analyseert IL-4-afhankelijke genexpressie via real-time PCR in Namalwa-cellen.

Met behulp van een geautomatiseerde cel Counter aan Gene Expression Studies Vereenvoudigen: siRNA Knockdown van IL-4 Afhankelijk van genexpressie in cellen Namalwa (Video) | JoVE Journal

Met behulp van een geautomatiseerde cel Counter aan Gene Expression Studies Vereenvoudigen: siRNA Knockdown van IL-4 Afhankelijk van genexpressie in cellen Namalwa

Meer video's verkennen