Name: Het analyseren van grote eiwitcomplexen de Structuurfondsen massaspectrometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-19T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 35 s
Description: Leer grote eiwitcomplexen analyseren met structurele massaspectrometrie. Deze methode karakteriseert macromoleculaire structuren en onthult hun samenstelling en architectuur voor biologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs bedanken de Sharon leden van de groep voor hun kritische review, en voor hun bijdrage aan het manuscript. We zijn dankbaar voor de steun van de Morasha en Bikura Programma&#39;s, de Israel Science Foundation (Grant nrs. 1823-1807 en 378/08), de Josef Cohn Minerva Centrum voor biomembraan onderzoek, de Chais Family Fellows Program voor New Scientists, de Abraham en Sonia Rochlin Foundation; de Wolfson Family Charitable Trust, het Helen en Milton A. Kimmelman Centrum voor Biomoleculaire Structuur en assemblage, het landgoed van Shlomo en Sabine Beirzwinsky; Meil ​​de Botton Aynsley, en Karen Siem, Verenigd Koninkrijk. We zijn dankbaar Dan Tawfik en Itamar Yadid voor het geven van ons de lectine variant monster.

Deel 1: Voorbereiding van goud gecoate capillairen voor nanoflow electrospray ionisatie Analyse van niet-covalente complexen wordt meestal uitgevoerd door middel van nanoflow electrospray ionisatie (Nesi) 6, met behulp van glas of kwarts haarvaten die zijn getrokken om een fijne tip (~ 1 micrometer inwendige diameter), en gecoat met een geleidend materiaal (meestal goud) . Dergelijke haarvaten zijn kant-en-klare uit commerciële bronnen (nieuwe doelstelling of Proxeon), maar het kan meer kosten-effectief om hen voor te bereiden in-huis: <ol><li> Stok twee stroken van een dubbelzijdig klevende pad naar de bodem van een petrischaal, 2 cm uit elkaar. Plaats een glazen staaf (8 cm x 5 mm) in het centrum van een van de pads. De lijm pad houdt de haarvaten in de plaats, en de glazen staaf zal de haarvaten voorbereid, en houden de tips uit te breken (afb. 1). </li><li> Gebruik borosilicaatglas haarvaten, 1,0 mm x 0,78 mm OD id (we gebruiken verpakkingen van 500 dunne wand borosilicaat capillairen van Warner Instruments, cat. Nee. G100TF-4). Plaats een capillair in de naald trekker (we gebruiken model P-97 uit de Sutter Instrument Co). Voorzichtig klem de capillaire op zijn plaats, en pas de positie, zodat het ligt in het centrum van de verwarming van de naald trekker van de gloeidraad. Draai voorzichtig de klemmen, totdat de capillaire is beursgenoteerd bedrijf aan beide uiteinden. </li><li> Trek het capillair, met behulp van een vooraf gedefinieerde programma. Getrokken iedere capillaire zal aanleiding geven tot twee laatste, de vorm van haarvaten. Het proces van programmeren van de trekker is een van de trial-and-error, tot een aanvaardbaar tip vorm wordt verkregen. We maken gebruik van het volgende programma: <table border="1"><tbody><tr><td> Stap </td><td> Warmte </td><td> Trek </td><td> Vell </td><td> Tijd </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 750 </td><td> - </td><td> 15 </td><td> 80 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 700 </td><td> - </td><td> 15 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 750 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 80 </td></tr></tbody></table></li><li> Haal de getrokken capillairen van het instrument en inspecteer de tips, waarbij een eventueel dat misvormd is of gebroken. Gebruik stomp pincet (we gebruiken positionering pincet uit CK Precision), naar de haarvaten in de petrischaal. De basis van de capillaire moet worden gehecht aan de lijm pad en het bovenste deel moet steunen op de glazen staaf, met de punt naar boven. </li><li> Zodra de petrischaal vol is (ongeveer 80 haarvaten passen in een 10 cm diameter schotel), plaatst de plaat in het goud sputter coater (we gebruiken het model niet. EMS550, van EMS). Zorg ervoor dat de gastoevoer wordt gekozen volgens de instructies van de fabrikant, en activeer een vooraf gedefinieerde coating cyclus (we gebruiken Argon druk 4 psi, bij een vacuum druk van 5 x 10 -2 mbar, een stroom van 45mA, en een coating tijd van 1 min, voor 3-6 cycli, totdat de haarvaten zijn gelijkmatig gouden). </li></ol> Deel 2: Voorbereiding van het monster <ol><li> Lage micromolaire concentraties van het monster nodig zijn (1 - 20 uM). Indien nodig, concentreer het monster met behulp van centrifugale ultrafiltratie apparaten (bijv. Vivaspin van Sartorius, of NanoSep van Pall Corporation). Het wordt aanbevolen dat u de adsorptie van het eiwitcomplex te controleren om het apparaat membraan voor gebruik. </li><li> Vaak is de zuivering buffers of storage-oplossingen van het eiwit complex zijn niet compatibel met Nesi, waarvoor alleen vluchtige oplossingen worden toegepast. Daarom buffer uitwisseling noodzakelijk is. Deze kritische stap, waarin alle sporen van zouten, buffer-moleculen of andere niet-vluchtige adducten zoals glycerol, DTT, of EDTA worden verwijderd, bepaalt de kwaliteit van de spectra. Meestal wordt waterige ammoniumacetaatoplossing gebruikt, bij een concentratie van tussen de 5 mm en een M, en 6-8 pH. Buffer uitwisseling kan worden uitgevoerd met behulp van een microcentrifuge gelfiltratie kolom (bijv. Micro Bio-Spin 6 chromatografiekolommen van Bio-Rad). Deze stap kan worden herhaald 1-3 keer met minimale verdunning (minder dan een factor van 1,3 per apparaat 5), tot de maximale uitwisseling is bereikt. Als zowel de concentratie en de buffer uitwisseling nodig zijn, kunnen deze samen worden gedaan, met behulp van centrifugale ultrafiltratie (e, g, Vivaspin van Sartorius, of NanoSep van Pall Corporation). </li></ol> Deel 3: Het kalibreren van de massaspectrometer voor een hoge massa-metingen Het merendeel van de experimenten uitgevoerd op multi-eiwit-complexen zijn uitgevoerd met behulp van een nano elektrospray quadrupool-time-of-flight (Q-TOF) instrument. Er wordt gesuggereerd dat u een quadrupool massa filter aangepast aan de lage frequenties te gebruiken, om de overdracht en de massa-analyse van ionen mogelijk met een hoge m / z-waarden 7,8. Het isook aanbevolen dat gasinlaten 7,8 of 9 hulzen worden toegevoegd aan het instrument in de eerste ion gids, om de druk controle mogelijk te maken bij de eerste vacuum fase. De laatste maakt optimalisatie van de transmissie en desolvation van zeer grote ionen 7-9. Op dit moment, commerciële ESI-ToF en Q-TOF-instrumenten zijn beschikbaar van verschillende fabrikanten (bijvoorbeeld, Waters, Sciex, Bruker, of Agilent), die kunnen worden relatief gemakkelijk en kosteneffectief, aangepast voor eigen MS-toepassingen 7,8. Het is mogelijk, echter de standaard ToF of QTOF configuraties te gebruiken op instrumenten zoals LCT of QToF1 (Waters) om de massa spectra te verwerven voor complexen tot een MDA, zonder de noodzaak voor hardware aanpassingen 5. Het protocol hieronder beschreven werd uitgevoerd op een Synapt instrument (Waters). <ol><li> Bereiding van 100 mg / ml, oplossing van de CSI in gezuiverd water. CSI gebruikt voor hoge massa kalibratie van de enkelvoudig geladen zout clusters, (CSI) n Cs + uitstrekken over een breed massa bereik, van 393 m / z tot ruim 10.000 (afb. 2). </li><li> Met behulp van bot pincet, neem een ​​gecoate capillair van de petrischaal en de belasting 2μL van de CSI-oplossing in het capillair, met behulp van een Eppendorf GeLoader tip. </li><li> Steek de capillaire in de capillaire houder, en pas de capillaire op een zodanige wijze dat de tip is ongeveer 10 mm afstand van de rand van de houder. </li><li> Schuif de oplossing naar de top van de capillaire handmatig, of met behulp van een spin down adapter. </li><li> Plaats het capillair onder een optische microscoop en snijd de tip, met behulp van de scherpe AA-type pincet. </li><li> Sluit de capillaire houder aan de nanoflow ES-interface. Achteruit Draai de xyz stadium om te voorkomen dat schade aan de capillaire, en duw het podium in zijn geactiveerd positie. De capillaire moet worden geplaatst 1 - 10 mm van de kegel opening. </li><li> Van toepassing zijn capillaire spanning (1050-1400 V) en een lage nanoflow druk (+0,00 tot 0,03 bar) tot de sproeistof wordt gestart, probeer dan de nanoflow druk te verminderen tot een minimale waarde. </li><li> Optimaliseren van de intensiteit van het signaal door het aanpassen van de locatie van de xyz fase, de capillaire spanning, de nanoflow druk, en de desolvation gasstroom. </li><li> Voor het detecteren van een breed scala massa van CSI piek-serie, moet de versnelling spanningen geoptimaliseerd worden (we gebruiken de volgende parameters: capillaire 1,3-1,7 kV, sample kegel 80-150V, extractie kegel 1-3 V). </li><li> Voor het optimaliseren van de overdracht van hoge massa ionen, die zachte desolvation voorwaarden, de backing druk in de eerste vacuüm fase, tussen de bron en de analysator vereisen, moeten worden verhoogd. Dit kan worden bereikt door zorgvuldig het verminderen van de geleiding van de bron vacuüm lijn naar de scroll pompen, door het gedeeltelijk sluiten van de afsluiter (SpeediValve). Om het optimale punt te definiëren, moet deze worden uitgevoerd, terwijl het toezicht op het effect op de signaalintensiteit (we meestal gebruik van 3.0-6.5 mBar). </li><li> Verzamel ongeveer 30 scans bij 1 scan / sec, op een m / z bereik van tussen de 1.000 tot 15.000 m / z. </li><li> Na de overname, kalibreren van de TOF met de juiste kalibratie tafel. </li></ol> Deel 4: MS analyse van intacte eiwitcomplexen <ol><li> Laad je monster, zoals beschreven (deel 3, afdelingen 2-5), en initiëren spray. </li><li> Begin met de eerste optimalisatie van de spray (deel 3, afdelingen 6-9), totdat het signaal wordt gedetecteerd. De exacte positie van de lading staten is proteïne-afhankelijk, maar het kan worden voorspeld met behulp van de relatie tussen ion massa en gemiddelde tarief staat, dus: (Z av) 10: Z av = 0,0778 √ (m), waarin m is de massa van het complex in Daltons. Om te voorkomen dat complexe dissociatie, niet Verwarm de ionenbron: ofwel schakelt de verwarming uit, of de temperatuur lager dan 40 ° C. te houden </li><li> Varieer de capillaire positie, monster kegel en afzuigkap spanningen aan ion-transmissie te maximaliseren, en controleer de resulterende wijzigingen in de spectra. Een mogelijk uitgangspunt zou kunnen worden cone voltage 100 V; extractor conus: 1 V; capillaire spanning 1,5 kV. Optimaliseren van deze parameters, in combinatie met de nanoflow druk. </li><li> Ter verbetering van desolvation en uit afvalwater en buffer componenten strip, verhogen de bias spanning en de gasdruk in de botsing cel. Deze stap moet zorgvuldig worden uitgevoerd, tot dissociatie van het complex te voorkomen. Typische bias spanningen zijn binnen het bereik van 10-100 V, met een val gasstroom van 1-10 ml / min (afb. 3). Handmatige instelling van de RF-instelling en quadrupool profiel kan het verbeteren van de overdracht van de hoogmis ionen. </li><li> Pas de Trap en de overdracht botsing energieën. Vaak zijn hogere spanningen nodig zijn voor de overdracht van een hoge massa-ionen (meestal binnen de range van 10-30 V). Op dit punt is het belangrijk om te voorkomen dat een botsing veroorzaakte dissociatie van het complex. </li><li> Na een stabiel signaal is reached, is het aanbevolen dat de nanoflow druk en capillaire spanning worden verlaagd tot minimale waarden, met behoud van een stabiele spray. </li></ol> Deel 5: Tandem massaspectrometrie: distantiëren eiwitcomplexen <ol><li> Zodra een optimale en stabiele signaal is verkregen, selecteert u een precursor ion. Stel de massa-centrum en isolatie breedte (we doorgaans gebruik van een LM resolutie van 12, en een HM resolutie van tussen de 13 en 15). Gebruik een brede massabereik aan de hoge massa / het batterijniveau laag is dissociatie-producten op te sporen. Het wordt aanbevolen dat u de m / z bereik in te stellen op het maximale niveau, en dan te reduceren tot de gewenste waarden. We verder stellen superpositie van de MS en MS / MS spectra, aan het isolement van de gekozen precursor ion valideren. </li><li> Voor het uitvoeren van MS / MS, dissociëren de voorloper ion door het verhogen van de botsing energie (CE) en de druk op de botsing cel. Te verhogen ofwel Trap of geleidelijk Transfer CE, in stappen van 10-20V, en verheffen de botsing gasdruk tot 0-5 ml / min (gemeenschappelijke waarden). Monitor veranderingen in de spectra tot een optimale activering omstandigheden worden bereikt. Hoge activatie energie kan leiden tot het uiteenvallen van een of meer subunits van de intacte complex, en verduidelijking van de interactie tussen affiniteiten van de verschillende subeenheden. We gebruiken meestal Argon als een botsing gas in de Trap / Transfer-cellen, hoewel de voordelen van het gebruik van een zwaardere gas (bijv. Xe of SF 6) zijn gemeld, maar deze gassen zijn aanzienlijk duurder 11 (afb. 3). </li><li> Het wordt aanbevolen om meer dan een laadtoestand worden geselecteerd voor MS / MS-analyse. In het geval van overlappende componenten, zal het verwerven van een set van tandem MS spectra te helpen bij het oplossen van de lading serie van de verschillende populaties. Bovendien zal een hogere heffing staten dissociëren gemakkelijker, vergeleken met de lagere kosten staten 12. </li><li> In aanvulling op de karakterisering van de intacte complex, wordt voorgesteld dat de kleinere subcomplexes in oplossing zullen worden gegenereerd, onder milde denaturerende omstandigheden. De MS en MS / MS analyses van subcomplexes vormen de basis voor het definiëren van de subunit architectuur van het complex 13. Voor de gedeeltelijke verstoring van de subunit-subunit interacties, voeg geleidelijk organische oplosmiddelen (bijv. methanol, isopropanol, of acetonitril) tot een concentratie van 50%, of verandering van de pH van de oplossing door het toevoegen van ammoniak of mierenzuur (tot een concentratie van 4 %). </li><li> Voor het bepalen van de massa's van de individuele subeenheden dat het complex samengesteld, is het belangrijk om een ​​spectrum te verwerven onder denaturerende omstandigheden. Dit kan worden uitgevoerd met behulp van Zip-Tip 4 C (Millipore) met een 25:75 water / acetonitril-verhouding, met 1% mierenzuur als de elutievloeistof. </li></ol> Deel 6: Data verwerking en analyse <ol><li> Gegevens worden geanalyseerd offline, met behulp van een spectraal-analyse programma's voor MS-spectra. We normaal gesproken gebruik maken van de MassLynx-programma (Waters). </li><li> Voor spectra dat een breed m / z assortiment overspanning, raden wij verschillende regelingen van smoothing en zwaartepunt parameters worden toegepast voor de hoge en lage m / z regio's, het verschil in piek resolutie van deze regio's weer te geven. </li><li> Het identificeren van kosten-serie en bereken lading staten en massa's, de "handleiding vinden" functie van MassLynx kan worden toegepast. In het geval van complexe massaspectra met overlappende componenten, kan handmatige berekening van de massa's gemakkelijker. </li><li> Om voor deze opdracht processen, kunnen extra software worden gebruikt, bijvoorbeeld: Maxent voor spectra deconvolutie 14, SOMMS voor piek montage en simulatie 15, en top voor het toewijzen van de samenstelling en de stoichiometrie van eiwitten subcomplexes en het genereren van eiwit interactie netwerken 13,16,17 . </li></ol> Deel 7: representatieve resultaten <img src="/files/ftp_upload/1954/1954fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Voorbereiden goud gecoate nano-electrospray haarvaten. A. Bevestig twee dubbelzijdige plakband op een petrischaal, 2 cm uit elkaar. Ter ondersteuning van de voorbereide haarvaten, plaats een glazen staaf (8 cm x 5 mm) in het centrum van een van de pads. B. Steek het stompe eind van de haarvaten bereid om de lijm pad, en leunen de tip over de glazen staaf. C. Zodra de petrischaal is gevuld met het haarvaten, smeer ze met goud tot een dunne film van goud wordt gelijkmatig afgezet op het buitenoppervlak van de haarvaten. <img src="/files/ftp_upload/1954/1954fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Hoogmis calibratie met behulp van cesium jodide-ionen. De grote en monisotopic clusters van CSI hebben het de verbinding van de keuze voor het kalibreren van massa spectrometers voor een hoge massa-analyse. De reeks van gelijke afstand van elkaar bergtoppen strekken zich uit over een breed scala, van m / z 393 tot ruim 10.000. Ze zijn assigned om alleen te betalen zout clusters van de algemene samenstelling (CSI) n Cs +. Extra signalen tussen de grote pieken worden veroorzaakt door dubbel-en triple-geladen deeltjes van de serie; [(CSI) n CS2] 2 + en [(CSI) n Cs3] 3 +, respectievelijk. Het verhogen van de druk bij de eerste vacuüm fase is essentieel voor het opsporen van de hoogmis clusters. Het effect van druk op de hoge massa pieken wordt gedemonstreerd in Panelen A. en B. met druk readbacks van 1,2 en 5,3, respectievelijk. C. Uitbreiding van het massaspectrum getoond bij B. <img src="/files/ftp_upload/1954/1954fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Nanoflow electrospray massa spectra van een pentamere lectine. A. Massaspectrometrie van een lectine variant complex (afgeleid van Lib1-B7 door gerichte evolutie 18) aanleiding geeft tot een vergoeding staat verdelingen tussen de 3.000 en 5.000 m / z, maar als gevolg van onvoldoende desolvation van de ionen, de pieken zijn breed. Vergelijking van het paneel A. en B. tonen het effect van het verhogen van de voorspanning spanning van 4V (A). Tot 15V (B.) Op de top breedte. Deze toename bij het versnellen van omstandigheden zorgt ervoor dat het strippen van restwater en buffer componenten, waardoor een zeer opgelost spectrum. De gemeten massa (60,240 ± 38 Da) komt overeen met een pentamere complex. C. de +15 laadtoestand toen werd geselecteerd voor tandem MS analyse (grijs gearceerd in het Configuratiescherm B.) D. De toename van de botsingsenergie zorgt ervoor dat de release van een hoog geladen monomeer, gecentreerd op 1664 m / z, en een gestript tetrameer complex, in het bereik van 5.000 - 8.000 m / z. Alle spectra werden verkregen uit een monster met 20 uM van de oplossing in 0,5 M ammoniumacetaat.

<ol><li>Alberts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+as+a+collection+of+protein+machines%3A+preparing+the+next+generation+of+molecular+biologists%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists.</a> Cell. 92 (3), 291-294 (1998).</li>
<li>Benesch, J. L., Ruotolo, B. T., Simmons, D. A., Robinson, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+complexes+in+the+gas+phase%3A+technology+for+structural+genomics+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Protein complexes in the gas phase: technology for structural genomics and proteomics.</a> Chem Rev. 107 (8), 3544-3567 (2007).</li>
<li>Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+mass+spectrometry%3A+a+bridge+between+interactomics+and+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Native mass spectrometry: a bridge between interactomics and structural biology.</a> Nat Methods. 5 (11), 927-933 (2008).</li>
<li>Sharon, M., Robinson, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mass+spectrometry+in+structure+elucidation+of+dynamic+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The role of mass spectrometry in structure elucidation of dynamic protein complexes.</a> Annu Rev Biochem. 76, 167-193 (2007).</li>
<li>Hernandez, H., Robinson, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+the+stoichiometry+and+interactions+of+macromolecular+assemblies+from+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Determining the stoichiometry and interactions of macromolecular assemblies from mass spectrometry.</a> Nat Protoc. 2 (3), 715-726 (2007).</li>
<li>Wilm, M., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+properties+of+the+nanoelectrospray+ion+source%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Analytical properties of the nanoelectrospray ion source.</a> Analytical Chemistry. 68 (1), 1-8 (1996).</li>
<li>Sobott, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tandem+mass+spectrometer+for+improved+transmission+and+analysis+of+large+macromolecular+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">A tandem mass spectrometer for improved transmission and analysis of large macromolecular assemblies.</a> Anal Chem. 74 (6), 1402-1407 (2002).</li>
<li>van den Heuvel, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+performance+of+a+quadrupole+time-of-flight+instrument+for+macromolecular+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Improving the performance of a quadrupole time-of-flight instrument for macromolecular mass spectrometry.</a> Anal Chem. 78 (21), 7473-7483 (2006).</li>
<li>Chernushevich, I. V., Thomson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collisional+cooling+of+large+ions+in+electrospray+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Collisional cooling of large ions in electrospray mass spectrometry.</a> Anal Chem. 76 (6), 1754-1760 (2004).</li>
<li>Mora, dela, J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospray+ionization+of+large+multiply+charged+species+proceeds+via+Dole+s+charged+residue+model%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Electrospray ionization of large multiply charged species proceeds via Dole s charged residue model.</a> Anal Chim Acta. 406, 93-104 (2000).</li>
<li>Lorenzen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+macromolecular+tandem+mass+spectrometry+of+large+non-covalent+complexes+using+heavy+collision+gases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Optimizing macromolecular tandem mass spectrometry of large non-covalent complexes using heavy collision gases.</a> Int J Mass Spectrom. 268, 198-206 (2007).</li>
<li>Benesch, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quadrupole-time-of-flight+mass+spectrometer+modified+for+higher-energy+dissociation+reduces+protein+assemblies+to+peptide+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Quadrupole-time-of-flight mass spectrometer modified for higher-energy dissociation reduces protein assemblies to peptide fragments.</a> Anal Chem. 81 (3), 1270-1274 (2009).</li>
<li>Taverner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+architecture+of+intact+protein+complexes+from+mass+spectrometry+and+homology+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Acc+Chem+Res%22%5BJournal%5D)">Subunit architecture of intact protein complexes from mass spectrometry and homology modeling.</a> Acc Chem Res. 41 (5), 617-627 (2008).</li>
<li>Ferrige, A. G., Seddon, M. J., Skilling, J., Ordsmith, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+MaxEnt+to+high+resolution+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">The application of MaxEnt to high resolution mass spectrometry.</a> Mass Spectrom. 6, 765-770 (1992).</li>
<li>van Breukelen, B., Barendregt, A., Heck, A. J., van den Heuvel, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+stoichiometries+and+oligomeric+states+of+glutamate+synthase+protein+complexes+with+curve+fitting+and+simulation+of+electrospray+mass+spectra%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Resolving stoichiometries and oligomeric states of glutamate synthase protein complexes with curve fitting and simulation of electrospray mass spectra.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 20 (16), 2490-2496 (2006).</li>
<li>Sharon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symmetrical+modularity+of+the+COP9+signalosome+complex+suggests+its+multifunctionality%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Symmetrical modularity of the COP9 signalosome complex suggests its multifunctionality.</a> Structure. 17 (1), 31-40 (2009).</li>
<li>Hernandez, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+architecture+of+multimeric+complexes+isolated+directly+from+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Subunit architecture of multimeric complexes isolated directly from cells.</a> EMBO Rep. 7 (6), 605-610 (2006).</li>
<li>Yadid, I., Tawfik, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+functional+beta-propeller+lectins+via+homo-oligomeric+assembly+of+shorter+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of functional beta-propeller lectins via homo-oligomeric assembly of shorter fragments.</a> J Mol Biol. 365 (1), 10-17 (2007).</li>
<li>Videler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+of+intact+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry of intact ribosomes.</a> FEBS Lett. 579 (4), 943-947 (2005).</li>
<li>Uetrecht, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+mass+spectrometry+of+viral+assemblies%3A+molecular+composition+and+stability+of+dimorphic+hepatitis+B+virus+capsids%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">High-resolution mass spectrometry of viral assemblies: molecular composition and stability of dimorphic hepatitis B virus capsids.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (27), 9216-9220 (2008).</li>
<li>Uetrecht, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+and+shape+of+hepatitis+B+virus+capsids+in+vacuo%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Stability and shape of hepatitis B virus capsids in vacuo.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 47 (33), 6247-6251 (2008).</li>
<li>Morton, V. L., Stockley, P. G., Stonehouse, N. J., Ashcroft, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+virus+capsid+assembly+from+non-covalent+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom+Rev%22%5BJournal%5D)">Insights into virus capsid assembly from non-covalent mass spectrometry.</a> Mass Spectrom Rev. 27 (6), 575-595 (2008).</li>
<li>Sharon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((20S+proteasomes+have+the+potential+to+keep+substrates+in+store+for+continual+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">20S proteasomes have the potential to keep substrates in store for continual degradation.</a> J Biol Chem. 281 (14), 9569-9575 (2006).</li>
<li>van Duijn, E., Heck, A. J., Vies, S. M. vander <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inter-ring+communication+allows+the+GroEL+chaperonin+complex+to+distinguish+between+different+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Inter-ring communication allows the GroEL chaperonin complex to distinguish between different substrates.</a> Protein Sci. 16 (5), 956-965 (2007).</li>
<li>van Duijn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+mass+spectrometry+of+intact+GroEL-substrate+complexes+reveals+substrate-specific+conformational+changes+in+the+trans+ring%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Tandem mass spectrometry of intact GroEL-substrate complexes reveals substrate-specific conformational changes in the trans ring.</a> J Am Chem Soc. 128 (14), 4694-4702 (2006).</li>
<li>Synowsky, S. A., van Wijk, M., Raijmakers, R., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+multiplexed+mass+spectrometric+analyses+of+endogenously+expressed+yeast+nuclear+and+cytoplasmic+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparative multiplexed mass spectrometric analyses of endogenously expressed yeast nuclear and cytoplasmic exosomes.</a> J Mol Biol. 385 (4), 1300-1313 (2009).</li>
<li>Sharon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+organization+of+the+19S+proteasome+lid%3A+insights+from+MS+of+intact+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural organization of the 19S proteasome lid: insights from MS of intact complexes.</a> PLoS Biol. 4 (8), e267-e267 (2006).</li>
<li>Zhou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+reveals+modularity+and+a+complete+subunit+interaction+map+of+the+eukaryotic+translation+factor+eIF3%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry reveals modularity and a complete subunit interaction map of the eukaryotic translation factor eIF3.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18139-18144 (2008).</li>
</ol>

Het verwerven van een hoge kwaliteit spectra aandacht moet worden besteed aan de monstervoorbereiding stappen, die sample concentratie en buffer uitwisseling omvatten. Meer dan verdunde monsters levert een laag signaal, terwijl de zeer geconcentreerde monsters kunnen worden nogal viskeus, en blokkeren de electrospray naald. Bovendien oplossing additieven zoals zouten, glycerol, detergenten, metaalionen, en reductiemiddelen (DTT of β-mercapto-ethanol), hebben de neiging zich te houden aan de buitenkant van de eiwitten, en de oorzaak verbreding van de pieken. Daarom, om goed opgelost toppen te bereiken, dient deze componenten worden toegevoegd aan de laagste concentraties mogelijk te maken. Een andere belangrijke parameter is de positie van de nanoflow capillaire, ten opzichte van de massa-spectrometer opening. Het vinden van de &quot;sweet spot&quot; zou een uitdaging zijn voor onervaren gebruikers, toch, dit in grote mate invloed op de kwaliteit van de spectra. Het is ook belangrijk om na te gaan van de nanoflow capillaire voorafgaand aan de start van de spray. De druppelgrootte is een functie van de tip diameter, die moet worden ~ 1 uM. Kleine druppeltjes leiden tot efficiëntere ionisatie, en zou daarom voordelig zijn. Het is ook belangrijk om te valideren dat er geen luchtbellen in de capillaire die de stroom kunnen blokkeren, en dat het goud coating is niet ontdaan van de capillaire tijdens de acquisitie, zo ja, verder trim de tip. Houd in gedachten dat een overmatige hoeveelheid monster zal de mogelijkheid van het optimaliseren van MS-voorwaarden, zoals de capillaire spanning, het versnellen van spanningen, druk, en botsing energie te verhogen. Over het geheel genomen zijn de procedures beschreven in het protocol is gebruikt om de samenstelling, de stoichiometrie en de architectuur van tal van eiwitcomplexen (zie reviews 2,3,4) te bepalen. Analyse van grote MDa complexen zoals het ribosoom 19 en sterk geordende virus capsiden 20-22, bij het ​​bepalen van substraat binding aan moleculaire machines 23-25, of de karakterisering van subunit interactienetwerken 26,17,16,17,27,28 dienen als maar een paar voorbeelden van de waarde van deze aanpak.

Voorbeeld eisen: <table border="1"><tr><td> Monster </td><td> Vereiste </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Volume </td><td> 1-2 pi </td><td> Per capillaire </td></tr><tr><td> Concentratie </td><td> 1-20μM </td><td> Per complex </td></tr><tr><td> Buffer </td><td> Aquanos vluchtige buffer zoals ammonium-acetaat bij pH = 6-8 </td><td> Typisch 5 mM-1M </td></tr><tr><td> Wasmiddel </td><td> Minimaal </td><td> Clusters van wasmiddel moleculen produceren breed en pieken </td></tr><tr><td> Glycerol </td><td> Minimaal is (tot 5%) </td><td> Hecht niet-specifiek aan eiwitten en daardoor zijn brede pieken waargenomen </td></tr><tr><td> Organische oplosmiddelen </td><td> Tot 50% </td><td> Zou denatureren eiwitten complexen </td></tr><tr><td> Zuren </td><td> Tot 4% </td><td> Denatureren eiwitcomplexen </td></tr><tr><td> Zouten </td><td> Minimaal </td><td> Zout adducten leiden tot een breed en pieken </td></tr><tr><td> DTT </td><td> Minimaal </td><td> 1-2 uM kunnen aanwezig zijn </td></tr><tr><td> Chelaatvormers </td><td> Minimaal </td><td> Boven 250 uM leiden tot uitgebreide adductvorming </td></tr></table>

het analyseren van grote eiwitcomplexen de structuurfondsen massaspectrometrie

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Levende cellen te controleren en reguleren van hun biologische processen door middel van de gecoördineerde actie van een groot aantal eiwitten die zichzelf assembleren tot een scala aan dynamische, multi-eiwitcomplexen 1. Te krijgen een mechanistisch begrip van de verschillende cellulaire processen, is het cruciaal om de structuur van een dergelijk eiwit-complexen te bepalen, en hoe hun structurele organisatie hun functie dicteert onthullen. Veel aspecten van multi-eiwit complexen zijn echter moeilijk te karakteriseren, door hun heterogene aard, asymmetrische structuur en dynamiek. Daarom zijn nieuwe benaderingen nodig zijn voor de studie van de tertiaire niveaus van proteïnen organisatie. Een van de opkomende structurele biologie tools voor het analyseren van macromoleculaire complexen is massaspectrometrie (MS) 2-5. Deze methode levert informatie over de complexe eiwitsamenstelling, subunit stoichiometrie, en structurele topologie. De kracht van MS is afgeleid van zijn hoge gevoeligheid en, als gevolg daarvan lage monster vereiste, dat het onderzoek van eiwitcomplexen uitgedrukt in endogene niveaus mogelijk maakt. Een ander voordeel is de snelheid van de analyse, die toezicht van reacties kunnen in real time. Bovendien kan de techniek gelijktijdig meten van de eigenschappen van afzonderlijke populaties naast elkaar bestaan ​​in een mengsel. We beschrijven hier een gedetailleerd protocol voor de toepassing van structurele MS om de analyse van grote verzamelingen van eiwitten. De procedure begint met de voorbereiding van de goud gecoate capillairen voor nanoflow electrospray ionisatie (Nesi). Het gaat dan met monstervoorbereiding, met nadruk op de buffer voorwaarden waaraan moet compatibel zijn met Nesi worden aan de ene kant, en in staat te stellen complexen intact aan de andere kant te houden. We dan uit te leggen, stap-voor-stap hoe u de experimentele condities te optimaliseren voor hoge massa-metingen en het verwerven van MS en tandem MS spectra. Ten slotte hebben we in kaart verwerking van gegevens en analyses die volgen. In plaats van te proberen om elk aspect van verzamelingen van eiwitten te karakteriseren, dit protocol bevat standaard MS-methoden, waardoor de prestaties van MS en MS / MS experimenten op niet-covalente complexen. Het geheel genomen, ons doel is om onderzoekers onbekend met het gebied van structurele MS, met kennis van de belangrijkste experimentele instrumenten.

Massaspectrometrie heeft bewezen een waardevol instrument voor het analyseren van grote eiwitcomplexen worden. Deze methode maakt het mogelijk inzicht in de samenstelling, de stoichiometrie en de algemene structuur van multi-subunit assemblages. We beschrijven hier, stap-voor-stap hoe u een structurele massaspectrometrie analyse uit te voeren, en karakteriseren macromoleculaire structuren.

Het analyseren van grote eiwitcomplexen de Structuurfondsen massaspectrometrie

Levende cellen beheersen en reguleren hun biologische processen via de gecoördineerde werking van een groot aantal eiwitten die zich assembleren tot een ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om grote eiwitcomplexen te karakteriseren met behulp van structurele massaspectrometrie. Dit wordt bereikt door goudgeplate capillairen voor nano-flow electrospray-ionisatie voor te bereiden. In een tweede stap wordt het monster klaargemaakt en wordt de massaspectrometer gekalibreerd voor metingen van hoge massa.Vervolgens worden de experimentele condities geoptimaliseerd om eiwitcomplexen intact te houden in de gasfase. Daarna worden MS- en tandem-MS-spectra opgenomen. De MS-spectra vertoonden ladingstoestanden die qua massa overeenkwamen met het intacte complex, terwijl tandem-MS-experimenten associatiepatronen van monomeren en gestripte complexen opleverden.Hallo, ik ben Naam Kiba van het laboratorium van Miron aan het Whiteman Institute of Science, en ik ben Isaac Ky. Ik kom ook uit het laboratorium van michelon. Vandaag willen we u de basisprocedure laten zien voor het analyseren van grote eiwitcomplexen door middel van structurele spectrometrie. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om eiwitcomplexen te karakteriseren en om hun globale geometrie, samenstelling en interactienetwerken te definiëren. Laten we beginnen.De analyse van niet-stroomgebonden eiwitcomplexen wordt uitgevoerd met de air spray immunisatie-techniek met behulp van emme plus of qua capillaren. Deze capillairen kunnen worden uitgetrokken tot een fijne punt met een diameter van ongeveer één micron en vervolgens worden gecoat met een geleidend materiaal zoals goud. Deze capillairen zijn commercieel verkrijgbaar, zoals hier te zien is.Het is echter veel kosteneffectiever in gebruik. De glazen capillairen, die gekoeld en gecoat kunnen worden tot ze klaar zijn voor gebruik, worden gekoeld op dit naaldkoelapparaat en gecoat op dit coatingapparaat. Om met deze procedure te beginnen, bevestigt u twee stroken van een dubbelzijdige plakstrip op de bodem van een Petrischaal, waarbij u de stroken twee centimeter uit elkaar houdt.Plaats een glazen staaf in het midden van een van de kussentjes. Het kleefkussentje houdt de capillairen op hun plaats en de glazen staaf ondersteunt de geprepareerde capillairen en voorkomt dat de uiteinden van de capillairen breken. Er werden borosilicaatglas-capillairen gebruikt met een buitendiameter van 1 millimeter en een binnendiameter van 0,78 millimeter.Plaats één capillair in de naald, klem het capillair voorzichtig vast en pas de positie aan zodat het in het midden van het verwarmingsfilament ligt. Draai de klemmen voorzichtig aan totdat de capillairen aan beide uiteinden stevig vastzitten. Trek het capillair uit met behulp van het hier getoonde vooraf gedefinieerde programma.Houd er echter rekening mee dat het programmeren van de puller een proces van vallen en opstaan is. Totdat een acceptabele tipvorm is verkregen, levert elke getrokken haarbuis twee uiteindelijke gevormde haarbuisjes op. Verwijder de getrokken haarbuisjes uit het instrument en inspecteer de tips; gooi alle haarbuisjes weg die vervormd of gebroken zijn.Gebruik stompe positioneerpincetten om de capillairen in de Petrischaal te plaatsen. De basis van de capillairen is bevestigd aan het plakstripje en het bovenste gedeelte rust op de glazen staaf, waarbij de punt naar boven wijst. Ga door met het trekken van de capillairen totdat de Petrischaal vol is.Ongeveer 80 haarvaten passen in een schaal met een diameter van 10 centimeter. Coat vervolgens de haarvaten met goud. Plaats de plaat in de goud-sputtercoater.Zorg ervoor dat de gastoevoer is gekozen volgens de instructies van de fabrikant en activeer een vooraf gedefinieerde coatingcyclus. De coating wordt drie tot zes keer herhaald totdat de capillairen gelijkmatig goudkleurig zijn. Zodra de capillairen gereed zijn, kan men overgaan tot het kalibreren van de massaspectrometer.De meeste experimenten die met MultiPro-complexen worden uitgevoerd, worden verricht met een Electrospray quadruple time-of-flight massaspectrometer zoals deze. De invoer is afkomstig van Waters en is aangepast voor hoge massa's. Kalibreer de massaspectrometer met cesiumjodide voordat het eiwitmonster wordt geladen.Bereid eerst een oplossing van 100 mg/mL cesium in gezuiverd water voor. Cesium wordt gebruikt voor kalibratie van hoge massa's, aangezien de enkelvoudig geladen zoutclusters een breed massabereik beslaan, van een massa-ladingsverhouding van 393 tot ruim boven de 10.000. Neem met stompe pincetten een gecoate capillair uit de petrischaal en breng 2 µL van de cesiumoplossing in de capillair aan.Gebruik een tip die is geladen met een einor-gel. Schuif de oplossing naar de punt van de capillair, dit kan handmatig of met behulp van een spin-down adapter. Plaats de capillair in de capillairhouder en pas de positie aan zodat de punt ongeveer 10 millimeters van de rand van de houder bevindt.Plaats de capillair onder een optische microscoop en gebruik scherpe pincetten van type AA om de tip bij te snijden. Het is belangrijk om te controleren of er geen luchtbellen in de capillair zitten die de stroom kunnen blokkeren en of de capillair niet verstopt is. Zorg er daarnaast voor dat de goudlaag niet van de capillair is afgesleten.Zo ja, vervang dan de capillair of trim de punt en verwijder het ongecoate gedeelte. Sluit vervolgens de capillairhouder aan op de nano flow ESI-interface. Draai de XY, Z-tafel naar achteren om beschadiging van de capillair te voorkomen en duw de tafel in de geactiveerde positie.De capillair moet op een afstand van 1 tot 10 millimeter van de conusopening worden geplaatst. Breng capillairspanning en een lage nanoflow-druk aan totdat de spray is gestart. Probeer vervolgens de nanoflow-druk tot een minimale waarde te verlagen.Optimaliseer de signaalintensiteit door de positie van de XYZ-stage, de capillaire spanning, de nanostroomdruk en de desolvatatiegasstroom aan te passen. Om een breed massabereik van seizoensgebonden piekseries te detecteren, moeten de versnellingsspanningen worden geoptimaliseerd. De hier gebruikte parameters zijn een capillair van 1,3 tot 1,7 kilovolt, een samplecone van 80 tot 150 volt en een extractiecone van één tot drie volt om de transmissie van ionen met een hoge massa te optimaliseren, waarvoor milde desolvatatiecondities vereist zijn.De tegendruk wordt in de eerste vacuümfase tussen de bron en de analyzer verhoogd naar vijf tot zes millibar. Om de tegendruk te verhogen, wordt de conductantie van de vacuümlijn van de bron naar de scrollpomp voorzichtig verminderd door het isolatieventiel gedeeltelijk te sluiten, terwijl het effect op de signaalintensiteit wordt gemonitord. Wanneer de opstelling van de massaspectrometers is voltooid, worden ongeveer 30 scans verzameld met een snelheid van één scan per seconde bij een master charge ratio-bereik tussen 1000 en 15 000; kalibreer na de acquisitie de vluchttijd met behulp van de overeenkomstige kalibratietabel.Nu de kalibratie is voltooid, kan het eiwitmonster worden geladen. Het monster wordt voorbereid vóór het kalibreren van de massaspectrometer, waarbij lage micromolaire concentraties vereist zijn. Concentreer het monster indien nodig met behulp van centrifugale ultrafiltratie-apparaten.Verifieer dat het proteïnecomplex niet is geadsorbeerd aan het membraan van het apparaat vóór gebruik. Omdat alleen vluchtige oplossingen voor NESI kunnen worden gebruikt door het volume en de UV-absorbentie te controleren, is een bufferuitwisseling vaak noodzakelijk. Een microcentrifuge-gelfiltratiekolom kan worden gebruikt om alle sporen van zouten, buffermoleculen of andere niet-vluchtige adducten te verwijderen.Suspendeer in plaats daarvan de monster. Een waterige ammoniumacetaatoplossing. Deze cruciale stap bepaalt de kwaliteit van de spectra.Herhaal de bufferuitwisseling tot maximaal drie keer met minimale verdunning, minder dan een factor 1,3 per apparaat, totale maximale uitwisseling is bereikt. Indien zowel concentratie als bufferuitwisseling vereist zijn, kunnen deze gecombineerd worden uitgevoerd middels centrifugale ultrafiltratie, zoals zojuist aan het begin van deze sectie is getoond. Laad vervolgens het monster zoals beschreven voor de caesiumjodide-kalibratie en start het sproeien.Begin met de initiële optimalisatie van de spray totdat het signaal wordt gedetecteerd. Gebruik de vergelijking voor de gemiddelde ladingsstaat waarin M de massa van het complex is. De exacte positie van de ladingsstaten is echter, uitgedrukt in Daltons, eiwitafhankelijk.Om complexe dissociatie te voorkomen, mag de ijzerbron niet worden verhit. Schakel de verwarming uit of houd de temperatuur onder 40 °C. Varieer de positie van de capillair en de voltages van de samplecone en de extractor.Om de ijzeroverdracht te maximaliseren, is een mogelijk startpunt de conusspanning van 100 volt, de extractorconusspanning van 1 volt en de capillairspanning van 1,5 kilovolt. Controleer de resulterende verandering in de spectra. Optimaliseer deze parameters in combinatie met een nanostroomdruk om de desolvatie te verbeteren en residueel water en buffercomponenten te verwijderen.Verhoog de bias-spanning in de gasdruk in de botsingscel. Typische bias-spanningen liggen in het bereik van 10 tot 100 volt met een gasstroom in de val van 1 tot 10 milliliters per minuut. Voer dit zorgvuldig uit om associatie van het complex te voorkomen en pas de botsingsenergieën van de val en de overdracht aan.Vaak zijn hogere spanningen, gewoonlijk in het bereik van 10 tot 30 volt, vereist voor de transmissie van ionen met een hoge massa. Op dit punt is het belangrijk om botsingsgeïnduceerde dissociatie van het complex te vermijden, zoals hier wordt getoond. Nadat een stabiel signaal is bereikt, wordt aanbevolen om de nanoflowdruk en de capillaire spanning te verlagen naar minimale waarden, terwijl een stabiele spray wordt behouden.Nadat er verschillende scans zijn verzameld, gaat u over tot het identificeren van de componenten van het complex via tandem-massaspectrometrie. Zodra een optimaal en stabiel signaal voor het proteïnecomplex is verkregen, selecteert u een precursor-ion en stelt u het masscentrum in binnen de isolatiebreedte. Over het algemeen wordt een lage massaresolutie van 12 en een hoge massaresolutie tussen 13 en 15 gebruikt; gebruik eerst een breed massabereik om de dissociatieproducten met een hoge massa en lage lading te detecteren en verlaag dit vervolgens naar de gewenste waarden om de ms uit te voeren.MS dissocieert de precursore IJzern door de botsingsenergie (afgekort als CE) en de druk in de botsingscel te verhogen. Verhoog de CE van de trap of transfer geleidelijk in stappen van 10 tot 20 volt en verhoog de druk van het botsingsgas naar 0 tot 5 ml/min. Monitor de veranderingen in de spectra totdat de optimale activatiecondities zijn bereikt. Een hoge activatie-energie kan de dissociatie van één of meer subeenheden uit het intacte complex induceren en de interactieaffiniteiten van verschillende subeenheden verduidelijken.Selecteer meer dan één lading voor ms MS-analyse. In het geval van overlappende componenten helpt het verkrijgen van een set tandem MS-spectra bij het oplossen van de ladingsreeksen van de verschillende populaties. Bovendien dissocieren hogere ladaingstaten gemakkelijker in vergelijking met lagere ladingstaten; superponeer de MS en ms.Ms-spectra om de isolatie van het gekozen precursor-ion te valideren. Naast de karakterisering van het intacte complex via MS en ms/ms, genereert MS kleinere subcomplexen in oplossing onder milde denaturerende omstandigheden; karakteriseer deze even tevoren.De MS- en ms MS-analyse van subcomplexen vormen de basis voor het definiëren van de subunitarchitectuur van het complex. Voor de gedeeltelijke disruptie van subunit-subunit-interacties worden geleidelijk organische oplosmiddelen toegevoegd tot een concentratie van 50%, of wordt de pH van de oplossing gewijzigd door ammoniak of mierenzuur toe te voegen tot een concentratie van 4%. Ten slotte is het, om de massa's van de individuele subunits die het complex vormen te bepalen, belangrijk om spectra onder denaturerende condities te verkrijgen. Dit kan worden uitgevoerd met zip tip C four met een water-acetonitril-verhouding van 25 tot 75 en 1% mierenzuur als elutie-oplosmiddel. Verwerk en analyseer alle verzamelde gegevens en resultaten zoals gedetailleerd in het bijbehorende schriftelijke protocol. Voordat het eiwitcomplexmonster wordt geladen, zijn de massaspectrometers gekalibreerd met cesiumjodide.De reeks gelijkmatig verdeelde pieken die in het rood zijn aangegeven, strekt zich uit over een breed bereik, van een hoofdladingsverhouding van 393 tot ruim boven de 10.000. Deze worden toegewezen aan enkelvoudig geladen zoutclusters met de algemene samenstelling van het caesium plus complex. Aanvullende signalen tussen de hoofdpieken, aangegeven in het zwart, worden veroorzaakt door dubbel en drievoudig geladen soorten uit de reeks caesium twee plus complex en het caesium drie plus complex.Het verhogen van de druk in de eerste vacuümfase is essentieel voor het detecteren van clusters met een hoge massa. Het effect van druk op de pieken met een hoge massa wordt hier gedemonstreerd met drukmetingen van 1.2 en 5.3 millibar. Het massaspectrum voor de hogere druk wordt hier vergroot weergegeven.Hier is een voorbeeld van massaspectrometrie van een lectinevariantcomplex, wat resulteert in een ladingstoestandsverdeling tussen een massa-ladingsverhouding van 3000 en 5,000. Echter, door een onvoldoende ontzilting van de ionen zijn de pieken breed. Het verhogen van de bias-spanning van vier volt naar 15 volt, wat leidt tot een toename in de versnellingscondities, veroorzaakt het verwijderen van resterend water en buffercomponenten, wat resulteert in een spectrum met een hoge resolutie; de gemeten massa komt overeen met een pentameer complex.De ladingstoestand plus 15 werd vervolgens geselecteerd voor tandem MS-analyse. De toename van de botsingsenergie veroorzaakt de vrijgave van een sterk geladen monomeer gecentreerd op een massa-ladingsverhouding van 1.664 en een gestripte tetramere complex in het bereik van 5.000 tot 8.000 massa-ladingsverhouding. Het lectinvariantcomplex werd ook onder denaturerende omstandigheden onderzocht, wat leidde tot complexassociatie.Op deze manier kan de exacte massa van de individuele subeenheden die het complex vormen, worden bepaald. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe MS- en tandem-MS-spectra van ionen met een hoge massa kunnen worden verkregen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om uw monster correct voor te bereiden en uitsluitend vluchtige buffers te gebruiken die compatibel zijn met massaspectrometrie.Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

analyzing-large-protein-complexes-by-structural-mass-spectrometry

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ion mobility-massaspectrometrie is een nieuwe gas-fase ionen technologie die scheidt, op basis van hun botsing doorsnede en massa. De methode biedt drie-dimensionale informatie over de algemene topologie en de vorm van eiwitcomplexen. Hier schetsen we een basisprocedure voor het instrument instellen en optimaliseren, kalibratie van drift tijden en data interpretatie.

T-wave Ion Mobility-massaspectrometrie: Basic Experimentele Procedures voor Protein Complex Analysis

Affiniteitszuivering van gemerkte eiwitten in combinatie met massaspectrometrie (APM) is een krachtige methode voor systematische mapping van eiwit interactie netwerken en het onderzoeken van de mechanistische basis van biologische processen. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde sequentiële peptide affiniteit (SPA) APM procedure ontwikkeld voor de...

Identificatie van eiwit complexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Met Sequential Peptide Affinity Purification in combinatie met tandem massaspectrometrie

Nauwkeurige massa meting betekent een belangrijke stap tijdens het onderzoek van eiwitten. Matrix-geassisteerde laser desorptie / ionisatie (MALDI) massaspectrometrie (MS) kan worden gebruikt voor deze vaststelling en van zijn belangrijkste voordeel is de tolerantie voor zouten, detergentia en verontreinigingen. Hier tonen we een toegankelijke benadering voor de analyse van eiwitten groter dan 100 kDa door MALDI-MS.

Matrix-laserdesorptie / ionisatie Time of Flight (MALDI-TOF) massaspectrometrische analyse van intacte eiwitten groter dan 100 kDa

De beschreven vergelijkende, kwantitatieve proteomics aanpak is gericht op het verkrijgen van inzicht in de samenstelling van multiprotein complexen onder verschillende omstandigheden en wordt aangetoond door het vergelijken van genetisch verschillende stammen. Voor kwantitatieve analyse gelijke volumes van verschillende fracties van een sucrose dichtheidsgradiënt gemengd en geanalyseerd met massaspectrometrie.

Een nieuwe aanpak voor de Vergelijkende analyse van de multiprotein Complexen Gebaseerd op<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabole Labeling en kwantitatieve massaspectrometrie

Hier presenteren we protocollen voor affiniteitszuivering van eiwitcomplexen en hun scheiding door blauwe natieve PAGE, gevolgd door proteïne correlatie profilering middels label vrije kwantitatieve massaspectrometrie. Deze methode is nuttig voor interactomen in verschillende proteïnecomplexen lossen.

Het oplossen van Affiniteit gezuiverde eiwit complexen door Blue inheemse PAGE en Protein Correlatie Profiling

De architectuur van eiwitcomplexen is essentieel voor hun functie. Diverse massaspectrometrische technieken combineren bewezen krachtige te bestuderen van hun vergadering. Wij bieden protocollen voor chemische dwarsbinding en inheemse massaspectrometrie en laten zien hoe deze complementaire technieken helpen ophelderen van de architectuur van multi subeenheid eiwit assemblages.

Chemische dwarsbinding en massaspectrometrie van Intact eiwitcomplexen te bestuderen de architectuur van multi subeenheid eiwit assembly's combineren

Hier presenteren we een protocol voor het controleren van de montage en demontage van de toxine van de bloedzweer met behulp van biolayer interferometrie (BLI). Na montage/demontage op de biosensor oppervlak, de grote eiwitcomplexen worden vrijgegeven uit het oppervlak voor visualisatie en identificatie van onderdelen van de complexen met behulp van elektronenmicroscopie en massaspectrometrie, respectievelijk.

Analyseren van de dynamische eiwitcomplexen op gemonteerd en vrijgelaten uit Biolayer interferometrie Biosensor met behulp van spectrometrie van de massa en elektronenmicroscopie

De Spectrometrie van de massa (MS) heeft ontpopt als een belangrijk instrument voor het onderzoek naar de structuur en de dynamiek van macromoleculaire assemblages. Hier, wij op basis van MS om te ondervragen eiwit complexvorming en ligand bindende benaderingen worden geïntegreerd.

Analyseren van platforms voor eiwit en eiwit-Ligand complexen door integratieve structurele massaspectrometrie

Een veelzijdig cryoslicing BN-MS protocol met behulp van een microtoom wordt gepresenteerd voor hoge-resolutie complexome profilering.

Hoge-resolutie Complexome profilering door Cryoslicing BN-MS analyse

De experimentele procedures voor het uitvoeren van covalente etikettering op basis van diethylpyrocarbonaat met massaspectrometrische detectie worden beschreven. Diethylpyrocarbonaat wordt eenvoudig gemengd met het eiwit- of eiwitcomplex van belang, wat leidt tot de wijziging van oplosmiddeltoegankelijke aminozuurresiduen. De gemodificeerde residuen kunnen worden geïdentificeerd na proteolytische vergisting en vloeistofchromatografie/massaspectrometrieanalyse.

Covalente etikettering met diethylpyrocarbonaat voor het bestuderen van eiwitstructuur in hogere orde door massaspectrometrie

Leer grote eiwitcomplexen analyseren met structurele massaspectrometrie. Deze methode karakteriseert macromoleculaire structuren en onthult hun samenstelling en architectuur voor biologisch onderzoek.

Het analyseren van grote eiwitcomplexen de Structuurfondsen massaspectrometrie

Meer video's verkennen