Het analyseren van grote eiwitcomplexen de Structuurfondsen massaspectrometrie
19 juni 2010
Massaspectrometrie heeft bewezen een waardevol instrument voor het analyseren van grote eiwitcomplexen worden. Deze methode maakt het mogelijk inzicht in de samenstelling, de stoichiometrie en de algemene structuur van multi-subunit assemblages. We beschrijven hier, stap-voor-stap hoe u een structurele massaspectrometrie analyse uit te voeren, en karakteriseren macromoleculaire structuren.
Het algemene doel van het volgende experiment is om grote eiwitcomplexen te karakteriseren met behulp van structurele massaspectrometrie. Dit wordt bereikt door goudgeplateerde capillairen voor te bereiden voor nano flow electro spray ionisatie. Als tweede stap wordt het monster voorbereid en wordt de massaspectrometer gekalibreerd voor metingen met hoge massa.
Vervolgens worden de experimentele omstandigheden geoptimaliseerd om eiwitcomplexen intact te houden in de gasfase. MS en tandem Ms.Spectra worden vervolgens verkregen. De MS Spectra toonden ladingstoestanden die overeenkwamen met de massa van het intacte complex, terwijl tandem MS-experimenten het associatiepatroon van monomeren en ontdekte complexen opleverden.
Hallo, ik ben Naam Kiba van het Laboratorium van Miron in het Whiteman Institute of Science, En ik ben Isaac Ky.Ik kom ook uit het laboratorium van michelon. Vandaag willen we u de basisprocedure laten zien voor het analyseren van grote eiwitcomplexen door structurele spectrometrie toe te passen, En we gebruiken deze procedure in ons laboratorium om eiwitcomplexen te karakteriseren om uw voorraadgeometrie, samenstelling en interactienetwerken te definiëren. Dus laten we beginnen.
Analyse van niet-actuele gebonden eiwitcomplexen wordt uitgevoerd door middel van luchtspray-immunisatietechniek met behulp van emme plus of qua capillairen. Deze capillairen C kunnen worden getrokken tot een fijne punt van ongeveer één micron diameter en vervolgens bedekt worden met geleidend materiaal zoals goud. Deze capillairen zijn commercieel verkrijgbaar zoals u hier kunt zien.
Het is echter veel kosteneffectiever om te gebruiken. De glascapillairen, eh, die dan koel en bedekt kunnen worden tot de gereed-voor-gebruik-toestand. Koelen wordt uitgevoerd op dit naaldpoolapparaat en coating op dit eh-coatingapparaat. Om deze procedure te beginnen, bevestigt u twee stroken dubbelzijdig plakband aan de onderkant van een petrischaal, waarbij de stroken twee centimeter uit elkaar worden gehouden.
Plaats een glazen staaf in het midden van een van de pads. Het plakband houdt de capillairen op hun plaats en de glazen staaf ondersteunt de voorbereide capillairen en zorgt ervoor dat de punten niet breken voor de capillairen. Gebruik Boris silicaatglas capillairen met een buitendiameter van één millimeter en 0,78 millimeter in diameter.
Plaats één capillair in de naald, klonter het capillair voorzichtig op zijn plaats en pas de positie aan zodat het in het midden van het verwarmingsfilament ligt. Draai de klemmen voorzichtig vast totdat de capillairen aan beide uiteinden stevig vastzitten. Trek het capillair met behulp van het vooraf gedefinieerde programma dat hier wordt getoond.
Onthoud echter dat het proces van het programmeren van de puller één van trial and error is. Totdat een acceptabele puntvorm is verkregen, geeft elke getrokken capillair aanleiding tot twee capillairen met een definitieve vorm. Verwijder de getrokken capillairen uit het instrument en inspecteer de punten, gooi de gedeformeerde of gebroken capillairen weg.
Gebruik stompe positioneringstangjes om de capillairen in de petrischaal te plaatsen. De basis van de capillairen is bevestigd aan het plakband en het bovenste gedeelte leunt op de glazen staaf met een punt die omhoog wijst. Blijf de capillairen trekken totdat de petrischaal vol is.
Ongeveer 80 capillairen passen in een schaal met een diameter van 10 centimeter. Vervolgens coat je de capillairen met goud. Plaats de plaat in de goudsputter coater.
Zorg ervoor dat de gastoevoer wordt gekozen volgens de instructies van de fabrikant en activeer een vooraf gedefinieerde coatingcyclus. De coating wordt drie tot zes keer herhaald totdat de capillairen gelijkmatig goudkleurig zijn. Zodra de capillairen klaar zijn, ga je verder met het kalibreren van de massaspectrometer.
De meeste experimenten die worden uitgevoerd op MultiPro-complexen worden uitgevoerd door een al Electrospray quadruple time of flight massaspectrometer zoals deze. Inupt van Waters, die is aangepast voor hoge massa's. Voordat u het eiwitmonster laadt, kalibreert u de massaspectrometer met behulp van cesiumjodide.
Bereid eerst een oplossing van 100 milligram per milliliter cesium in gezuiverd water. Cesium wordt gebruikt voor kalibratie met hoge massa's. Aangezien de eenvoudig geladen zoutclusters zich uitstrekken over een breed massabereik van 393 massa-ladingsverhouding tot ruim 10.000. Gebruik stompe pincetten om een gecoate capillair uit de petrischaal te nemen en laad twee microliters van de cesiumoplossing in de capillair.
Gebruik een einor gel-geladen tip. Schuif de oplossing naar de punt van de capillair, hetzij handmatig of gebruik een spin-down adapter. Plaats de capillair in de capillairhouder en pas de capillair zodanig aan dat de punt ongeveer 10 millimeter van de rand van de houder verwijderd is.
Plaats de capillair onder een optische microscoop en gebruik scherpe AA-type pincetten om de punt te trimmen. Het is belangrijk om te valideren dat er geen luchtbellen in de capillair zijn die de stroom kunnen blokkeren en dat de capillair niet verstopt is. Zorg er bovendien voor dat de goudcoating niet van de capillair is verwijderd.
Indien dit het geval is, vervang de capillair of trim de punt en verwijder het ongecoate gedeelte. Verbind vervolgens de capillairhouder met de nano flow ESI-interface. Draai de XY, Z-standaard achteruit om schade aan de capillair te voorkomen en duw de standaard in de geactiveerde positie.
De capillair moet op een afstand van één tot tien millimeter van de kegelopening worden geplaatst. Pas capillairspanning en lage nano flow-druk toe totdat de spray wordt geïnitieerd. Probeer vervolgens de nano flow-druk tot een minimale waarde te verlagen.
Optimaliseer de signaalintensiteit door de locatie van de XYZ-standaard, de capillairspanning, de nano flow-druk en de diss-solvatiegasstroom aan te passen. Om een breed massabereik van seizoenspiekseries te detecteren, moeten de versnellingsspanningen worden geoptimaliseerd. De hier gebruikte parameters zijn capillair 1,3 tot 1,7 kilovolt, monsterkegel 80 tot 150 volt, een extractiekegel, een tot drie volt om de transmissie van ionen met hoge massa te optimaliseren, die zachte desal-condities vereisen.
De tegendruk wordt verhoogd tot vijf tot zes millibar in de initi
Overzicht
Dit artikel beschrijft een stapsgewijze procedure voor het analyseren van grote eiwitcomplexen met behulp van structurele massaspectrometrie. De methode maakt de karakterisering van macromoleculaire structuren mogelijk en biedt inzichten in hun samenstelling en architectuur.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Structurele biologie
- Massaspectrometrie
- Eiwitcomplexanalyse
Achtergrond
- Massaspectrometrie is een krachtig hulpmiddel voor het analyseren van eiwitcomplexen.
- Het begrijpen van de architectuur van multi-subunit assemblages is cruciaal voor biologisch onderzoek.
- Karakterisering van eiwitcomplexen kan hun samenstelling en interactienetwerken onthullen.
- Dit onderzoek richt zich op het optimaliseren van methoden om eiwitcomplexen intact te houden tijdens analyse.
Doel van het onderzoek
- Om grote eiwitassemblages te karakteriseren met behulp van structurele massaspectrometrie.
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor het voorbereiden van monsters en het uitvoeren van massaspectrometrieanalyse.
- Om het begrip van eiwitcomplexstructuren en hun functionele implicaties te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Bereiding van vergulde capillairen voor nano flow elektro spray ionisatie.
- Calibratie van massaspectrometer voor hoge massametingen.
- Optimalisatie van experimentele omstandigheden om eiwitcomplexen in de gasfase te houden.
- Verkrijging van MS en tandem MS spectra om ladingstoestanden en associatiepatronen te analyseren.
Belangrijkste resultaten
- MS spectra gaven ladingstoestanden aan die overeenkomen met intacte eiwitcomplexen.
- Tandem MS experimenten onthulden associatiepatronen van monomeren en gestripte complexen.
- De methode hield eiwitcomplexen met succes intact tijdens analyse.
- Geoptimaliseerde omstandigheden verbeterden de signaalintensiteit en gegevenskwaliteit.
Conclusies
- Structurele massaspectrometrie is effectief voor het analyseren van grote eiwitcomplexen.
- Het gedetailleerde protocol kan worden gebruikt voor verdere studies in eiwitstructuurkarakterisering.
- De verkregen inzichten kunnen bijdragen aan het begrijpen van eiwitinteracties en functies.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Structural mass spectrometry enables biopharma teams to interrogate the architecture, composition, and interaction networks of large protein complexes at endogenous levels. This capability is critical for mechanistic de-risking and target validation in early discovery, especially for dynamic or heterogeneous assemblies that are challenging to characterize by other means. High-sensitivity MS workflows support predictive confidence and inform portfolio triage by revealing subunit stoichiometry and interaction topology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of protein complex composition and subunit architecture.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying interaction networks and assembly states.
- Provides functional target validation through intact complex analysis and subunit dissociation mapping.
- Facilitates predictive confidence in target selection by resolving heterogeneous or asymmetric assemblies.
Screening & Assay Development
- Prepares validated protein complexes for downstream screening and mechanistic assays.
- Delivers quantitative mass and stoichiometry data to standardize assay inputs.
- Enables reproducible detection of complex integrity and subunit exchange under varying conditions.
- Supports scalability and platform reuse by minimizing sample requirements and enabling rapid analysis.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural insights with disease-relevant protein assemblies when applicable.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by enabling intact complex characterization.
- Reduces translational risk by confirming subunit composition and interaction stability under physiological conditions.
- Provides mechanistic data to inform biomarker or therapeutic hypothesis refinement.
Pipeline & Workflow Integration
Structural MS integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification and preclinical mechanistic studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping complex architecture and subunit interactions.
- Screening: Provides assay-ready, quantitative mass data for reliable compound evaluation and reproducibility.
- Analytics: Delivers high-resolution measurements of intact complexes, subcomplexes, and dissociation products for comparative analysis.
- Translational Research: Enables continuity by characterizing complexes under native and denaturing conditions relevant to disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for diverse protein assemblies, supporting multiple programs and targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes sample preparation and analysis for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk through robust structural data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of targets based on structural integrity and interaction mapping.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mass spectrometry and protein complex handling.
- Demands access to high-mass MS instrumentation and gold-coated nESI capillary preparation.
- Necessitates cross-team standardization of buffer conditions and sample workflows.
- May require adaptation for different protein complex sizes, stabilities, or heterogeneities.
- Sample volatility and buffer compatibility are critical for maintaining complex integrity during analysis.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
0:46
Introduction
1:18
Preparation of Gold-coated Capillaries for Nanoflow Electrospray Ionization
4:12
Calibrating the Mass Spectrometer for High Mass Measurements
7:47
MS Analysis of Intact Protein Complexes
10:45
Tandem Mass Spectrometry: Dissociating Protein Complexes
15:09
Conclusion
13:08
Representative Results of Large Protein Complexes Analysis by Mass Spectrometry
