Name: Kwantificering van γH2AX Foci in reactie op ioniserende straling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-06T19:35:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Leer hoe je γH2AX-foci kwantificeert in menselijke cellen na ioniserende straling met immunofluorescentie. Deze methode monitort DNA-schade en reparatieprocessen voor stralingsbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De steun van het Australian Institute of Nuclear Science and Engineering wordt erkend. TCK was de ontvanger van AINSE awards. Epigenomisch Medicine Lab wordt ondersteund door de National Health en Medical Research Council van Australië (566.559). LM wordt ondersteund door Melbourne Research (Universiteit van Melbourne) en Biomedical Imaging CRC aanvullende beurzen. De ondersteuning van Monash Micro Imaging (Drs Stephen Cody en Iska Carmichael) was van onschatbare waarde voor dit werk.

Celpreparaat <ol><li> Humane keratinocyten (FEP-1811) werden gekweekt in keratinocyten-serum vrij medium (K-SFM; Invitrogen), aangevuld met epidermale groeifactor, runder-hypofyse-extract en 20 ug / ml gentamycine, bij 37 ° C en 5% CO 2. </li><li> Een enkele celsuspensie werd bereid door het losmaken met trypsine-EDTA (0,05% v / v) </li><li> Cellen werden gezaaid in 8-goed Lab Tek II microchamber dia's (10.000 cellen / putje) en dia's werden gedurende 3 dagen bij 37 ° C en 5% CO 2. </li></ol> Bestraling <ol><li> Cellen werden bestraald op ijs met 2 Gy met behulp van een 137 Cs bron (Gammacell 1000 Elite bestraler, Nordion International, ON, Canada, 20,6 seconden / Gy) </li><li> Bestraald controle en 2 Gy bestraalde cellen werden geïncubeerd gedurende 1 uur bij 37 ° C en 5% CO 2. </li></ol> Immunofluorescentiekleuring <ol><li> Media werd getipt en cellen werden gewassen met 300μl van PBS (w / o Ca 2 + of Mg 2 +) per well en werden gedraaid op een orbitale mixer gedurende 5 minuten. </li><li> De buffer werd getipt en 100μl van vers bereide 4% (v / v) paraformaldehyde werd aan elk putje toegevoegd en dia's werden geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Alle incubaties werden uitgevoerd in een vochtige vlekken trog </li><li> Cellen werden vervolgens gewassen met PBS (w / o Ca 2 + of Mg 2 +). Dia's werden geplaatst in een Coplin pot en gedraaid op een orbitale mixer gedurende 5 minuten. Deze wasstap werd herhaald met nog eens twee keer. </li><li> De buffer werd getipt en overtollige PBS werd voorzichtig uitgewist. </li><li> Cellen werden gepermeabiliseerde met behulp van 100ml Triton X-100 (0,1% v / v) per well en een 10 minuten incubatie bij kamertemperatuur. </li><li> De cellen werden gewassen met PBS (w / o Ca 2 + of Mg 2 +), zoals beschreven in stappen 3 en 4 hierboven. </li><li> Niet-specifieke eiwit binding werd geblokkeerd met 100 ml van de BSA (1% v / v) per well en 20 minuten incubatie bij kamertemperatuur. </li><li> Excess BSA was getipt en 100μl van primaire muizen monoklonale anti-fosfo histon-H2AX antilichaam (1:500 verdund in 1% BSA, Millipore), werd aan elk putje toegevoegd voor een een uur incubatie bij kamertemperatuur. </li><li> De cellen werden gewassen met PBS (w / o Ca 2 + of Mg 2 +), zoals beschreven in stappen 3 en 4 hierboven en geïncubeerd met 100μl van secundaire antilichaam (Alexa Fluor 488 geit anti-muis IgG verdund 1:500, in 1% BSA ; Invitrogen) per goed voor 45 minuten bij kamertemperatuur in het donker. (Verwaterd antilichaam werd in het donker bewaard gedurende de procedure) </li><li> De cellen werden gewassen met PBS (w / o Ca 2 + of Mg 2 +), zoals beschreven in stappen 3 en 4 hierboven. Echter, was de blootstelling aan het licht geminimaliseerd via folie. </li><li> Nucleaire tegenkleuring werd uitgevoerd met 100 ml TOPRO3 (verdund 1:500, Invitrogen) per goed en een 10 minuten incubatie bij kamertemperatuur </li><li> De cellen werden gewassen met PBS (w / o Ca 2 + of Mg 2 +), zoals beschreven in stap 10 hierboven. </li><li> De kamers werden zorgvuldig verwijderd uit de dia's, werd overtollig vocht uitgewist en dia's mochten aan de lucht drogen. </li><li> Een druppel ProLong GOLD anti-fade-oplossing (Invitrogen) werd per well toegevoegd en dia's werden gemonteerd (22x50 mm dekglaasje) en de overtollige vloeistof rond de randen van de glijbaan was weggevaagd. </li><li> De dia's werden bewaard in het donker nog eens 30 minuten bij kamertemperatuur alvorens afdichten met nagellak. </li><li> De dia's werden gedurende de nacht bewaard bij 4 ° C in het donker voor de analyse. </li></ol> Microscopie / Analyse <ol><li> Zeiss LSM510 Meta Confocale Microscpe gebruikt om beelden met behulp van de standaard GFP te verwerven (voor γH2AX - Alexa Fluor 488 geit anti-muis IgG) en ver rode lasers (voor TOPRO-3). Meestal wordt een 63 x olie-immersie objectief gebruikt. Beelden worden verworven in een Z-serie patroon met een stapgrootte van 0,5 micrometer. Een stapgrootte van 0,5 um werd gekozen om het verlies van foci aanwezig te minimaliseren in verschillende vlakken in de kernen. Tijdens de analyse worden individuele vliegtuigen deconvoluted en gestapeld tot een maximum geprojecteerde beeld om de overlap van foci (Top-hat filter toegepast) te minimaliseren produceren. </li><li> Metamorph (Molecular Devices, USA) werd gebruikt om het aantal foci te analyseren. Het programma quantitates het aantal haarden in elke cel nadat de drempel is toegepast op de achtergrond uit te sluiten. De informatie wordt geregistreerd in een Microsoft Excel spreadsheet voor verdere analyse. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1957/1957fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Immunofluorescentie visualisatie van γH2AX foci (groen) in onbehandeld humane keratinocyten en in cellen bestraald met 2 Gy en geïncubeerd gedurende nog eens 1 uur bij 37 ° C, 5% CO 2. DNA werd gekleurd met TOPRO-3 (blauw). Beelden werden verkregen met behulp van een Zeiss LSM 510 Meta confocale microscoop. Bar = 10 urn. e_content "&gt; <img src="/files/ftp_upload/1957/1957fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Immunofluorescentie visualisatie van γH2AX foci (groen) in de menselijke keratinocyten en in cellen bestraald met 2 Gy en geïncubeerd gedurende nog eens 1 uur bij 37 ° C, 5% CO 2. Beelden werden verkregen met behulp van een Zeiss LSM 510 Meta Confocale microscoop met behulp van 0,5 micrometer Z-snijden (1-9) om te zorgen dat alle foci werden verworven. De beelden is vervolgens gestapeld voor kwantificering met behulp van Metamorph. DNA werd gekleurd met TOPRO-3 (blauw). De gestapelde γH2AX en blauwe beelden werden gestapeld voor visualisatie. Bar = 10 urn.

<ol><li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).</li>
<li>Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma+H2AX+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Gamma H2AX and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).</li>
<li>Savic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+Dynamic+%5Bgamma%5D-H2AX+Domains+along+Broken+DNA+Strands+Is+Distinctly+Regulated+by+ATM+and+MDC1+and+Dependent+upon+H2AX+Densities+in+Chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Formation of Dynamic [gamma]-H2AX Domains along Broken DNA Strands Is Distinctly Regulated by ATM and MDC1 and Dependent upon H2AX Densities in Chromatin.</a> Molecular Cell. 34 (3), 298-310 (2009).</li>
<li>Downs, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+chromatin-modifying+activities+to+phosphorylated+histone+H2A+at+DNA+damage+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Binding of chromatin-modifying activities to phosphorylated histone H2A at DNA damage sites.</a> Mol Cell. 16 (6), 979-990 (2004).</li>
<li>Chowdhury, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5Bgamma%5D-H2AX+Dephosphorylation+by+Protein+Phosphatase+2A+Facilitates+DNA+Double-Strand+Break+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">[gamma]-H2AX Dephosphorylation by Protein Phosphatase 2A Facilitates DNA Double-Strand Break Repair.</a> Molecular Cell. 20 (5), 801-809 (2005).</li>
<li>Nakada, S., Chen, G., Gingras, A., Durocher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PP4+is+a+gamma+H2AX+phosphatase+required+for+recovery+from+the+DNA+damage+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">PP4 is a gamma H2AX phosphatase required for recovery from the DNA damage checkpoint.</a> EMBO Rep. 9 (10), 1019-1026 (2008).</li>
<li>Altaf, M., Auger, A., Covic, M., Côté, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connection+between+histone+H2A+variants+and+chromatin+remodeling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Connection between histone H2A variants and chromatin remodeling complexes.</a> Biochem Cell Biol. 87 (1), 35-50 (2009).</li>
<li>Kusch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylation+by+Tip60+Is+Required+for+Selective+Histone+Variant+Exchange+at+DNA+Lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Acetylation by Tip60 Is Required for Selective Histone Variant Exchange at DNA Lesions.</a> Science. 306, 2084-2087 (2004).</li>
<li>Hurlin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+human+papillomavirus+type+18-immortalized+human+keratinocytes+to+a+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (2), 570-574 (1991).</li>
<li>Dickey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX%3A+functional+roles+and+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">H2AX: functional roles and potential applications.</a> Chromosoma. , Forthcoming (2009).</li>
</ol>

Na blootstelling aan ioniserende straling (γ-stralen), γH2AX foci vorm snel en foci nummers oplopen tot tussen de 30-60 minuten 2. Daarom is onze 1 uur na de bestraling tijdstip weerspiegelt de initiële vorming van DSB. Wij hebben gebruik gemaakt van de klinisch relevante stralingsdosis van 2 Gy voor ons experiment. Toch kan de methode worden gebruikt voor straling doses tot 4 Gy voor de detectie van de eerste DSB formatie; belangrijke overlapping van foci sluit accurate kwantificering bij hogere doseringen. ...

<table><tbody><tr><td>Keratinocyte-Serum Free Medium (K-SFM)</td><td>Media</td><td>Invitrogen</td><td>17005042</td><td>Keratinocytenmedium aangevuld met humaan recombinant Epidermal Growth Factor 1-53 (EGF 1-53) en Bovine Pituitary Extract (BPE).</td></tr><tr><td>Lab Tek lI Chamber Slides (8-well)</td><td>Kamerslides</td><td>Nalge Nunc international</td><td>NUN154534</td><td></td></tr><tr><td>Dekglasjes (22x50mm)</td><td>Dekglasjes</td><td>Menzel-Glaser</td><td>CS2250100</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>BSA (1%) wordt gebruikt om aspecifieke antilichaambinding te blokkeren. Primaire en secundaire antilichamen worden verdund in BSA.</td></tr><tr><td>PBS (zonder Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; en Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;)</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>17-517Q</td><td></td></tr><tr><td>0,5% Trypsine-EDTA x10</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>15400-054</td><td>Trypsine-EDTA (0,05%) wordt gebruikt om cellen los te maken van kweekflessen.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Triton X-100 (0,1%) wordt gebruikt om cellen te permeabiliseren.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td>Paraformaldehyde (4%) wordt gebruikt om cellen te fixeren.</td></tr><tr><td>Muismonoklonaal anti-phospho histon-H2AX antilichaam</td><td>Primair antilichaam</td><td>EMD Millipore</td><td>16193</td><td>Verdunning van primair antilichaam (1:500), in 1% BSA.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 geit anti-muis IgG (H+L)</td><td>Secundair antilichaam</td><td>Invitrogen</td><td>11029</td><td>Verdunning van secundair antilichaam (1:500), in 1% BSA.</td></tr><tr><td>TOPRO3</td><td>DNA-kleuring</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td>Veelgebruikte DNA-kleuring: 4,6-diamidino-2-fenylindool dihydrochloride (DAPI). Kan alleen worden gebruikt met microscopen met de juiste excitatielaser.</td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Anti-fade oplossing</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td>Brekingsindex van 1,42 bij 20&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>Weefselkweekfles, geventileerde dop</td><td>Kweekfles</td><td>BD Biosciences</td><td>353112</td><td></td></tr><tr><td>Weefselkweekschaal (150x25mm)</td><td>Petrischaal</td><td>BD Biosciences</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>Coplin-pot, glas</td><td></td><td>Grale Scientific P/L</td><td>1771-OG</td><td></td></tr><tr><td>Kleurbad</td><td></td><td>Grale Scientific P/L</td><td>V1991.99</td><td></td></tr><tr><td>Gammacell 1000 Elite irradiator</td><td>Gamma-irradiator</td><td>Nordion International Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 510 Meta Confocal</td><td>Confocale microscoop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>Software voor beeldanalyse</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kwantificering van γh2ax foci in reactie op ioniserende straling

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA dubbel-breuken (DSB&#39;s), die worden veroorzaakt door een endogene metabole processen of door exogene bronnen, zijn een van de meest kritische DNA-laesies met betrekking tot de overleving en behoud van de genomische integriteit. Een vroege reactie op de inductie van DSB is fosforylatie van het H2A histon-variant, H2AX, op de serine-139 residu, in de zeer geconserveerd C-terminale SQEY motief, de vorming van γH2AX<sup&gt; 1</sup&gt;. Na inductie van DSB&#39;s, is H2AX snel gefosforyleerd door het fosfatidyl-inosito 3-kinase (Pikk) familie van eiwitten, ataxie telangiectasia gemuteerd (ATM), DNA-eiwit kinase katalytische subeenheid en ATM en RAD3-gerelateerde (ATR)<sup&gt; 2</sup&gt;. Gewoonlijk worden slechts een paar baseparen (bp) betrokken bij een DSB, is er echter aanzienlijke signaalversterking, gezien het belang van chromatine modificaties in DNA-schade signaleren en repareren. Fosforylatie van H2AX gemedieerd hoofdzakelijk door ATM zich uitbreidt naar aangrenzende gebieden van chromatine, die ongeveer 0,03% van het totale cellulaire H2AX per DSB<sup&gt; 2,3</sup&gt;. Dit komt overeen met fosforylering van ongeveer 2000 H2AX moleculen verspreid over ~ 2 Mbp regio&#39;s van chromatine rond de site van de DSB en resulteert in de vorming van discrete γH2AX haarden, die gemakkelijk kunnen worden gevisualiseerd en gekwantificeerd door immunofluorescentie microscopie<sup&gt; 2</sup&gt;. Het verlies van γH2AX bij DSB weerspiegelt reparatie, maar er is enige controverse over wat definieert volledige reparatie van DSB, het is voorgesteld dat hereniging van beide strengen van het DNA is echter voldoende, is het ook gesuggereerd dat opnieuw het de originele chromatine toestand van verdichting is noodzakelijk<sup&gt; 4-8</sup&gt;. De verdwijning van γH2AX omvat ten minste gedeeltelijk, defosforylering door fosfatasen, fosfatase 2A en fosfatase 4C<sup&gt; 5,6</sup&gt;. Verder is het verwijderen van γH2AX door herverdeling met histon-uitwisseling met H2A.Z zijn betrokken<sup&gt; 7,8</sup&gt;. Belangrijker is dat de kwantitatieve analyse van γH2AX foci geleid tot een breed scala aan toepassingen in de medische en nucleair onderzoek. Hier tonen we de meest gebruikte immunofluorescentie methode voor de evaluatie van de eerste DNA-schade door detectie en kwantificatie van γH2AX foci in γ-bestraalde aanhanger humane keratinocyten<sup&gt; 9</sup&gt;.

Kwantificering van DNA dubbel-strengs strepen met behulp van γH2AX vorming als een moleculaire marker is uitgegroeid tot een onmisbaar instrument in straling biologie. Hier laten we zien het gebruik van een immunofluorescentie assay voor de kwantificering van γH2AX foci na blootstelling van cellen aan straling.

Kwantificering van γH2AX Foci in reactie op ioniserende straling

DNA-dubbelstrengsbreuken (DSB's), die worden geïnduceerd door zowel endogene metabole processen als door exogene bronnen, behoren tot de meest kritieke DNA...

Hallo, ik ben Ian Ma van het Epigenomic Medicine Lab onder leiding van Dr. Tom Caris bij het Baker Eye, DI Heart and Diabetes Institute. Ik promoveer momenteel, waarbij de focus sterk ligt op de effecten van straling op Gamma H2AX, de moleculaire marker voor dubbelstrengse breuken. Vandaag demonstreer ik een experiment voor de kwantificering van Gamma H2AX in reactie op gammastraling in menselijke keratinocyten.Dit immunokleuringsprotocol kan worden gebruikt om zowel de initiële DNA-schade als DNA-herstel te monitoren. Deze methode is ook nuttig voor het evalueren van de effectiviteit van potentiële stralingsmodificerende verbindingen. Zo zullen radiosensitizers, waarvan wordt verwacht dat ze de DNA-schade verhogen, resulteren in hogere aantallen gamma H2AX-foci, terwijl radioprotectoren het tegenovergestelde effect zouden hebben met lagere aantallen gedetecteerde foci als gevolg van een vermindering in DNA-dubbelstrengsbreuken.Laten we nu beginnen met het experiment. De cellen die in dit experiment worden gebruikt zijn menselijke cytes, die zijn voorbereid op kamerslides met 10.000 cellen per putje. De slides worden drie dagen vóór de bestraling geïncubeerd bij 37 °C in 5% koolsto

quantification-of-h2ax-foci-in-response-to-ionising-radiation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Kwantificering van DNA dubbelstrengs breuken aan de hand van γH2AX foci is uitgegroeid tot een instrument van onschatbare waarde, met name in de biologie straling, voor de evaluatie van weefsel stralingsgevoeligheid en de effecten van de straling wijzigen van verbindingen. Hier laten we zien het gebruik van een immunofluorescentie test voor kwantificatie van γH2AX foci in weefselmonsters.

Kwantificatie van γH2AX Foci in weefselmonsters

Microscopische analyse van γH2AX foei, welke vorm na de fosforylatie van H2AX op Ser-139 in reactie op DNA dubbelstrengs breuken, is uitgegroeid tot een onmisbaar instrument in straling biologie. Hier hebben we gebruik gemaakt van een antilichaam aan mono-gemethyleerde histon H3 op lysine 4 als een epigenetische marker van actief transcriberen euchromatin, om de ruimtelijke verdeling van de straling-geïnduceerde γH2AX formatie binnen de kern te evalueren.

Evaluatie van de ruimtelijke verdeling van γH2AX volgende ioniserende straling

Een protocol om veranderingen in DNA-schadeniveaus en DNA-reparatievermogen te evalueren die kunnen worden geïnduceerd door chronische in vivo lage dosis bestraling in muis miltlymfocyten, door gemeten gefosforyleerd histon H2AX, een marker voor DNA-dubbelstrengsbreuken, met behulp van flowcytometrie wordt gepresenteerd.

Het meten van DNA-schade en herstel in Mouse Splenocyten Na Chronische<em&gt; In Vivo</em&gt; Blootstelling aan zeer lage doses van bèta en gamma-straling

Dit manuscript biedt een protocol voor de analyse van DNA dubbele-strand einden door immunofluorescentie microscopie van γH2AX en 53BP1.

Immunofluorescentie microscopie van γH2AX en 53BP1 voor het analyseren van de vorming en de reparatie van DNA dubbele-strand einden

Reparatie van dubbele streng DNA pauzes is een dynamisch proces, waarbij niet alleen de vorming van reparatie complexen in de pauzes, maar ook hun resolutie na de laesie is gericht. Hier, gebruiken we immunofluorescentie microscopie voor voorbijgaande en langdurige double-stranded pauzes als een instrument om te ontleden dit genoom onderhoud mechanisme.

Karakterisering van de DNA-herstelsynthese op Transiënten- en Long-lasting Double-streng DNA-einden door immunofluorescentie microscopie

De gepresenteerde methode combineert de kwantitatieve analyse van DNA Double-strand Breaks (DSBs), celcyclus verdeling en apoptosis om de celcycluspecifieke evaluatie van de inductie en reparatie van DSB mogelijk te maken, evenals de gevolgen van herstel fouten.

Celcyclus-specifieke meting van γH2AX en apoptosis na genotoxische stress door flow Cytometrie

De door straling veroorzaakte DNA-schaderespons die wordt geactiveerd door neutronenmixstraal die wordt gebruikt in de boorneutronvangtherapie (BNCT) is nog niet volledig vastgesteld. Dit protocol biedt een stapsgewijze procedure voor het detecteren van door straling geïnduceerde foci (RIF) van reparatie-eiwitten door immunofluorescentie kleuring in menselijke darmkankercellijnen na bestraling met de neutronen gemengde straal.

Immunofluorescentie beeldvorming van DNA Schade en Reparatie Foci in human Colon Kankercellen

Na DNA-schade activeren menselijke cellen essentiële hersteltrajecten om de integriteit van hun genoom te herstellen. Hier beschrijven we de methode van indirecte immunofluorescentie als een middel om DNA-hersteleiwitten te detecteren, hun ruimtelijke en temporele rekrutering te analyseren en de eiwitinteractie op de sites van DNA-schade te helpen ondervragen.

Visualisatie van DNA Repair Proteins Interaction door Immunofluorescentie

Dit protocol presenteert de diavoorbereiding en geautomatiseerde scoring van de γ-H2AX foci assay op perifere bloedlymfocyten. Om de methode en gevoeligheid van de test te illustreren, werden geïsoleerde lymfocyten in vitrobestraald . Deze geautomatiseerde methode van DNA DSB-detectie is nuttig voor snelle en high-throughput biologische dosimetrietoepassingen.

Een geautomatiseerde microscopische scoringsmethode voor de γ-H2AX foci assay in menselijke perifere bloedlymfocyten

Dit protocol presenteert een methode om de vorming en reparatie van DNA-dubbelstrengsbreuken te beoordelen door de gelijktijdige detectie van γH2AX- en 53BP1-foci in interfasekernen van met bleomycine behandelde menselijke perifere lymfocyten.

Dubbele immunofluorescentie van γH2AX en 53BP1 in humane perifere lymfocyten

Hier presenteren we een eenvoudig en snel protocol voor de detectie van eiwitinteractie op DNA-schadeplaatsen.

Nabijheidsligandtest om eiwitten te lokaliseren op plaatsen van DNA-schade

Leer hoe je γH2AX-foci kwantificeert in menselijke cellen na ioniserende straling met immunofluorescentie. Deze methode monitort DNA-schade en reparatieprocessen voor stralingsbiologisch onderzoek.

Kwantificering van γH2AX Foci in reactie op ioniserende straling

Meer video's verkennen