In-vivo detectie van eiwit-eiwit interacties op de Micro-oppervlakken met een patroon

Het is van bijzonder belang om het interactienetwerk van moleculen in levende cellen te ontrafelen om de mechanismen te begrijpen die het celmetabolisme en de celfunctie reguleren. Een toenemend aantal methodologieën die kwalitatieve en kwantitatieve informatie verschaffen, vormen de drijvende kracht op weg naar het verkrijgen van een holistisch beeld van de celfunctie. Co-ip, TAP-tagging of photo-crosslinking essays maken de zuivering van pre-moleculen in vitro mogelijk.

Daarnaast zijn verschillende benaderingen ontworpen voor de analyse van proteïne-interacties in de levende cel. Deze omvatten twee hybride screens of complementatie-assays van fluorescerende proteïnen. Bovendien zijn er enkele spectroscopische benaderingen, zoals FRET of FCS, en ook niet-spectroscopische methoden ontwikkeld om deze vraag te beantwoorden.

De bovengenoemde technieken zijn ontwikkeld voor het registreren van grote celpopulaties, maar zijn echter vrij indirect en daarom nauwelijks kwantitatief. In tegenstelling hiermee zijn enkele geavanceerde kwantitatieve benaderingen geïntroduceerd. Het is echter moeilijk om high-throughput-mogelijkheden te combineren met de mogelijkheid om kwantitatieve informatie te extraheren.

Onlangs hebben we een nieuw concept ontwikkeld voor het identificeren van eiwit-eiwitinteracties. De micropatroontechniek hier is een schematische illustratie van de micropatroon SA-roosters van BSA Sci vijf, die zijn geprint op gefunctionaliseerde glazen dekglasplaatjes waarbij de tussenruimtes zijn gevuld met streptavidine, gevolgd door gebiotineerde liganden. In de meeste gevallen zijn dit antilichamen tegen het membraan.

Eiwit-aas in cellen gekweekt op dergelijke microbioomchips. Het aas wordt in het plasmamembraan gerangschikt volgens het antilichaam-micropatroon. Interacties met een tweede fluorescent gelabeld eiwit-prooi worden onderzocht door de graad van co-patronering te meten met behulp van een silicium-master PDMS-stempel met een array van vierkanten met een specifieke kenmerkmaat en -diepte.

De drie micrometerstempels worden uit een gel geproduceerd en uitgesneden. De stempels worden gespoeld met 100% ethanol en dubbel gedestilleerd water en vooraf gedroogd met stikstof. Ze worden geïncubeerd met 0,67 mg/mL sci-fi.

Gelabelde BSA-oplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur tijdens incubatie; epoxy-gemodificeerde glazen dekglasjes worden op dezelfde wijze gereinigd. Op dezelfde manier worden de stempels na het inkten gewassen met PBS en water. Voor BSA sci vijf overdracht.

Een stempel wordt gedroogd met stikstof en direct daarna gedurende 30 minuten onder zijn eigen gewicht onder een glazen dekglas geplaatst. De locatie van het micropatroonveld wordt op de achterzijde van het dekglas gemarkeerd. Na het verwijderen van de stempels worden de dekglazen afgesloten met adhesieve siliconenmaskers.

De kamers worden gevuld met een streptavidine-oplossing van 50 µg/mL, gedurende één uur geïncubeerd en vervolgens gespoeld met 1 mL PBS. Daarna worden de streptavidine-patronen één uur geïncubeerd met 10 µg/mL gebiotinyleerd antilichaam; na het wassen met PBS worden de cellen in de kamer geladen. Zodra de cellen aan het oppervlak zijn gehecht, is het monster klaar voor metingen.

De enige vereiste voor de uitlezing is een fluorescentiemicroscoop die in staat is om het monster te belichten in een configuratie voor totale interne reflectie. Dergelijke systemen zijn commercieel verkrijgbaar bij verschillende leveranciers en zijn de afgelopen jaren gebruiksvriendelijker geworden. Ons detectiesysteem is opgezet op een epifluorescentiemicroscoop.

Argon- en krypton-ionlasers worden gebruikt voor selectieve fluorescentie-excitatie van de gebruikte fluoroforen; monsters worden verlicht in een configuratie voor totale interne reflectie via een objectief, waarbij gebruik wordt gemaakt van een olie-immersie-objectief met 100-voudige vergroting en een hoge NA. Na passende filtering met standaard filtersets wordt de fluorescentie afgebeeld op een camera met achterverlichte CCD. De uitlezing vindt plaats in de tijdvertraging- en integratiemodus (TDI), waardoor grote monstergebieden gescand kunnen worden. Hiervoor worden de monsters verschoven met een gemotoriseerde XY-tafel die is gesynchroniseerd met de regelverschuiving van de camera.

De teruggekaatste laserstraal wordt afgebeeld op een tweedelige fotodiode en het differentiële signaal wordt gebruikt om een Z-piezo aan te sturen voor snelle herfocussering. De reader is uitgerust met een geautomatiseerd focus-behoudsysteem dat werkt tijdens het scanproces, waarbij één scan plaatsvindt bij 488 nanometer voor selectieve excitatie van GFP en de tweede scan bij 647 nanometer voor selectieve excitatie van PS Five. Voor de data-analyse gebruiken we een contrastberekeningsprogramma geschreven in MATLAB, gebaseerd op de fluorescentie-intensiteit binnen en buiten de regio van het gevangen antilichaam.

Het contrastniveau en daarmee de mate van proteïne-interactie wordt geanalyseerd voor een snelle analyse van een groot aantal cellen. Ook commercieel verkrijgbare geautomatiseerde software kan worden gebruikt. Zo is de scan R imaging-software van Olympus succesvol getest voor de contrastevaluatie van micropatterning-experimenten.

We analyseren de bekende interactie tussen CD4 en LCK-eiwitten in vroege T-cel-signalering, zoals hier wordt getoond. Fluorescerend LCK herverdeelt zich duidelijk op regio's die zijn gecoat met CD4-antilichamen. Verstoring van de zink-clasp-structuur, een belangrijke interactieplaats van deze twee eiwitten, door toevoeging van een zinkchelator, vermindert vervolgens het contrast van de LCK-micropatronen.

Samenvattend zijn de belangrijkste voordelen van de micropatterning-techniek als volgt: de kwantificering van lokale, ruimtelijk opgeloste eiwitinteracties. Daarnaast zijn dit de detectie van zwakke interacties, ook in het plasmamembraan van levende cellen, de detectie van gemoduleerde bait-prey-interacties, de analyse van de rusttoestand en de toepasbaarheid van de methode voor high-throughput.