T-wave Ion Mobility-massaspectrometrie: Basic Experimentele Procedures voor Protein Complex Analysis
July 31st, 2010
Ion mobility-massaspectrometrie is een nieuwe gas-fase ionen technologie die scheidt, op basis van hun botsing doorsnede en massa. De methode biedt drie-dimensionale informatie over de algemene topologie en de vorm van eiwitcomplexen. Hier schetsen we een basisprocedure voor het instrument instellen en optimaliseren, kalibratie van drift tijden en data interpretatie.
Het algemene doel van het volgende experiment is om de algehele vorm van eiwitcomplexen te bepalen. Dit wordt bereikt door massaspectrometrie met ijzermobiliteit voor eiwitcomplexionen te verwerven en de drifttijdwaarden van elke ladingstoestand te meten. Als tweede stap worden de experimentele omstandigheden gevalideerd om zeker te stellen dat de mobiliteitsmetingen van native eiwitstructuren zijn uitgevoerd.
Vervolgens worden de gemeten drifttijdwaarden gecorreleerd met doorsnedegebieden. De resultaten bepalen de botsingsdoorsnedewaarden van eiwitten of eiwitcomplexen met onbekende driedimensionale structuren. Deze informatie geeft aanwijzingen over hun algehele vorm, subeenheidsverpakking en topologie.
Hallo, ik ben Isaac Leski van het Lab of Mic, afdeling Biologische Chemie aan het Wiseman Institute of Sciences, en ik ben Naam Kirschenbaum, ook van het lab van mij. Vandaag zullen we een procedure laten zien voor het meten van botsingsdoorsnede van eiwitcomplexen met behulp van hybride massaspectrometrie en ijzermobiliteitinstrumenten. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de algehele vorm en de ary-organisatie van eiwitcomplexen te bestuderen.
Dus laten we beginnen. Deze procedure richt zich op ijzermobiliteit, massaspectrometrie of IMM MS-analyse van eiwitcomplexen. De stappen voor de voorbereiding van monsters, instrumentkalibratie en MS en tandem MS-optimalisatieprocedures worden gedemonstreerd in een gerelateerd JO-protocol.
In het algemeen omvat dit protocol lage micromolaire concentraties van complex in een vluchtige buffer zoals ammoniumacetaat. Aangezien er één tot twee microliters per nanoflow-capillair wordt verbruikt, bereid 10 tot 20 microliters voor als minimumvolume om optimalisatie van MS-condities mogelijk te maken. Om deze procedure te starten, stelt u de reisgolf of T-golf synap IMMS in op de volgende bedrijfsmodi: mobiliteit tof, waarbij de tri-golf en drukken automatisch worden ingesteld voor zowel IM als tijd-van-vluchtscheiding van ionen, positieve ionenacquisitie en V-modus, het instellen van de pad van ionen door de vluchtbuis en reflectie. Schakel alle gassen hier in.
Stiekstof wordt gebruikt voor IM-scheiding en argon voor de val- en overdrachtsgebieden. Aanbevolen initiële waarden zijn een gasstroom van 24 milliliter per minuut voor het IMS-apparaat en 1,5 milliliter per minuut voor het valgebied. Stel vervolgens de verhouding van de mastladingsbelasting in voor een onbekend eiwitcomplex.
Gebruik in eerste instantie een breed massabereik, dat vervolgens kan worden verminderd tot de gewenste waarden, pas het MS-profiel dienovereenkomstig aan. Voor maximale transmissie-efficiëntie voor grote complexen moet het acquisitiemasbereik worden ingesteld vanaf 1030 2000 MA-ladingsverhouding en het MS-profiel op auto worden ingesteld. Anders kan het profiel worden ingesteld volgens de weergegeven tabel.
Controleer de RF-instelling en pas deze indien nodig aan op waarden die geschikt zijn voor grote eiwitcomplexen, zoals getoond. Laad vervolgens het monster, pas de capillaire spanning toe en de lage nanoflow-druk. Zodra het spuiten is gestart, probeer de nanoflow-druk tot een minimale waarde te verlagen.
Pas bovendien de positie van de capillair ten opzichte van de kegel aan, pas de MS-acquisitieparameters aan om een goed opgelost MS-spectrum te verkrijgen. Optimaliseer de drukgradiënt langs het instrument en de bemonsteringskegel, evenals de potentiële instellingen van de extractiekegel bias val en overdracht zoals beschreven in het bijbehorende JoVE-protocol. Hoewel deze parameters monsterafhankelijk zijn, worden hier de voorwaarden getoond die worden gebruikt voor het verkrijgen van MS-spectra van verschillende ijzermassa's van peptide tot eiwitcomplexen.
Grote ionen vereisen hogere botsingsenergieën en biasspanning. Het wordt ook aanbevolen om de tegendruk te verhogen voor de analyse van grote eiwitcomplexen om de activering van het complex te minimaliseren. Probeer geleidelijk in stappen van ongeveer 10 volt de monsterspoelkegelextractie, kegelval en biasspanningen te verlagen zonder de positie van de piek te veranderen.
Zodra een optimaal massaspectrum is verkregen, moet de drifttijd of IM-profiel worden aangepast bij het analyseren van eiwitassemblages. Optimale omstandigheden voor zowel massa- als mobiliteitsmetingen zijn vaak onverenigbaar. Daarom is het belangrijk om het juiste evenwicht tussen de twee te vinden.
Over het algemeen moet de ijzermobiliteitsplot worden geoptimaliseerd zodat de pieken over het hele drifttijdbereik worden verdeeld en het piekprofiel glad is. Bij benadering van een gian-verdeling kan significante piekasymmetrie gerelateerd zijn aan slechte scheiding van meerdere conformaties. T-golfsnelheid, T-golfhoogte en IMS-gasstroomsnelheid kunnen worden afgestemd om de mobiliteitsscheiding te optimaliseren. Het verhogen van de T-golfsnelheid verbreedt het drifttijdverdelingsprofiel.
Wanneer verhoogde T-golfhoogtewaarden worden gebruikt, vernauwt deze deze, net zoals het verhogen van de IMS-gasstroom vanaf 10 milliliter per minuut minimum, de drifttijdprofiel naar hogere waarden verschuift om het ijzermobiliteitsspectrum te optimaliseren. Door twee van de drie variabelen vast te stellen en de derde te optimaliseren, stelt u de T-golfsnelheid in op 250 meter per seconde en de gasstroom op 24 milliliter per minuut. Stel vervolgens als startpunt de hoogte in op drie volt en verhoog deze vervolgens in stappen van één volt.
Wanneer hoge biasspanningen worden gebruikt, wordt het aanbevolen om de IMS-gasdruk te verlagen en op deze manier de afname van de biasspanning mogelijk te maken. Als gevolg hiervan zullen complexactivering en -dissociatie worden verminderd. Een rollover-effect kan optreden wanneer de omstandigheden niet zijn geoptimaliseerd, waargenomen als een identieke piek in het eerste deel van het drifttijdspectrum en de staartrand.
Wanneer de ionen niet door het IAM-apparaat bewegen, kan hun reis effectief langer duren dan de tijd die nodig is voor de volgende ijzerpakket om in de mobiliteitscel te worden vrijgegeven. Als gevolg hiervan wordt een nieuwe groep ionen vrijgegeven uit het valgebied voordat het vorige pakket in het duwergebied is aangeleverd. Om dit artefact te elimineren, verhoogt u de T-golfhoogte en verlaagt u de T-golfsnelheid en de IMS
Overzicht
Ionenmobiliteits-massaspectrometrie (IM-MS) is een techniek die ionen scheidt op basis van hun botsingskruissectie en massa, en biedt inzichten in de topologie van eiwitcomplexen. Dit artikel schetst een procedure voor het optimaliseren van instrumentinstellingen, het kalibreren van drifttijden en het interpreteren van gegevens.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Massaspectrometrie
- Eiwitcomplexanalyse
- Structurele biologie
Achtergrond
- IM-MS biedt driedimensionale informatie over eiwitstructuren.
- De methode correleert drifttijdwaarden met dwarsdoorsnedegebieden.
- Inzicht in eiwittopologie helpt bij het verduidelijken van hun functies.
- Kalibratie en optimalisatie zijn cruciaal voor nauwkeurige metingen.
Doel van de studie
- Om de algehele vorm van eiwitcomplexen te bepalen.
- Om experimentele omstandigheden voor nauwkeurige mobiliteitsmetingen te valideren.
- Om inzichten te bieden in de pakking en topologie van subeenheden en eiwitten.
Gebruikte methoden
- Bereiding van eiwitmonsters in een vluchtige buffer.
- Kalibratie van drifttijden en optimalisatie van massaspectrometrie-instellingen.
- Meting van drifttijdwaarden voor verschillende ladingstoestanden.
- Correlatie van drifttijd met botsingskruissectiewaarden.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle verwerving van massaspectrometriegegevens voor eiwitcomplexen.
- Bepaling van botsingskruissectiewaarden voor onbekende structuren.
- Inzichten in de algehele vorm en organisatie van eiwitcomplexen.
- Validatie van experimentele omstandigheden voor nauwkeurige mobiliteitsmetingen.
Conclusies
- IM-MS is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van eiwitcomplexen.
- Optimalisatie van instrumentinstellingen is essentieel voor nauwkeurige resultaten.
- De methode verbetert het begrip van eiwitstructuur en -functie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) provides an additional dimension of separation that resolves heterogeneous protein complexes with similar mass-to-charge ratios but distinct structural conformations. This capability supports target validation by enabling mechanistic de-risking through direct measurement of collision cross-section, which correlates with protein shape, subunit packing, and topology under near-physiological conditions. The method enhances predictive confidence in early discovery by distinguishing native-like assemblies from dissociated or unfolded states, informing go/no-go decisions in lead identification pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by resolving protein complex isoforms and oligomeric states that may influence target function.
- Operational Value: Provides quantitative drift time and collision cross-section outputs that support functional target validation and biological de-risking.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by distinguishing native-like assemblies from non-physiological conformations, reducing mechanistic ambiguity in target selection.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible collision cross-section measurements that enable reliable compound-induced conformational screening.
- Quantitative Output: Delivers three-dimensional data (m/z, intensity, drift time) that reduces spectral overlap and improves resolution of heterogeneous mixtures in screening campaigns.
- Scalability: Optimized instrument settings (T-wave velocity, height, gas flow) allow consistent IM-MS performance across experimental conditions, supporting assay standardization.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains structural relevance from discovery through preclinical validation by preserving near-native protein complex topology in gas-phase measurements.
- Mechanistic De-risking: Correlates experimental collision cross-sections with theoretical models to predict subunit arrangements and assess structural integrity of disease-relevant complexes.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables data-driven decisions on complex stability and formulation suitability by detecting activation-induced unfolding or dissociation under varying solution conditions.
Pipeline & Workflow Integration
IM-MS fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, offering structural insights that inform each stage of protein complex characterization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving conformational heterogeneity and oligomeric states of target complexes.
- Screening: Enables assay readiness through reproducible drift time measurements and collision cross-section calibration using protein standards.
- Analytics: Provides drift time and collision cross-section readouts that allow teams to compare structural states across conditions and interventions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by validating that measured structures reflect solution-phase topology under near-physiological buffers.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform capability for structural triage across multiple targets and projects, reducing redundant method development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct structural measurement.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via calibrated drift time profiles and collision cross-section benchmarks.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of non-native conformations, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by quantifying structural stability and conformational homogeneity of lead candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in ion mobility instrumentation, mass spectrometry optimization, and protein complex preparation in volatile buffers.
- Dependent on Synapt HDMS or comparable IM-MS platform with tunable T-wave parameters and gas flow control.
- Necessitates cross-team standardization of calibration protocols using proteins with known collision cross-sections (e.g., cytochrome C, myoglobin, ubiquitin).
- Involves adaptation across model systems by maintaining consistent IM separation settings (pressure, voltage, T-wave height/velocity) when comparing targets.
- Limited by the need to avoid excessive activation energies that may cause unfolding; requires stepwise voltage titration to preserve native-like structures.
