Name: T-wave Ion Mobility-massaspectrometrie: Basic Experimentele Procedures voor Protein Complex Analysis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-31T17:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 40 s
Description: Leer T-wave ion mobility-massaspectrometrie voor eiwitcomplexanalyse in de structurele biologie. Deze methode optimaliseert instrumentinstellingen en kalibreert drift tijden om de topologie en subeenheidspakkingsstructuur van eiwitcomplexen te bepalen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedanken de Sharon leden van de groep voor hun kritische review, en voor hun bijdrage aan het manuscript. We zijn dankbaar voor de steun van de Morasha en Bikura Programma&#39;s, de Israel Science Foundation (Grant nrs. 1823-1807 en 378/08), de Josef Cohn Minerva Centrum voor biomembraan onderzoek, de Chais Family Fellows Program voor New Scientists, de Abraham en Sonia Rochlin Foundation; de Wolfson Family Charitable Trust, het Helen en Milton A. Kimmelman Centrum voor Biomoleculaire Structuur en assemblage, het landgoed van Shlomo en Sabine Beirzwinsky; Meil ​​de Botton Aynsley, en Karen Siem, Verenigd Koninkrijk.

<ol><li>Ruotolo, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+mobility-mass+spectrometry+analysis+of+large+proteincomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Ion mobility-mass spectrometry analysis of large proteincomplexes.</a> Nat Protoc. 3 (7), 1139-1152 (2008).</li>
<li>Scarff, C. A., Thalassinos, K., Hilton, G. R., Scrivens, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Travelling+wave+ion+mobility+mass+spectrometry+studies+of+protein+structure%3A+biological+significance+and+comparison+with+X-ray+crystallography+and+nuclear+magnetic+resonance+spectroscopy+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Travelling wave ion mobility mass spectrometry studies of protein structure: biological significance and comparison with X-ray crystallography and nuclear magnetic resonance spectroscopy measurements.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 22 (20), 3297-3304 (2008).</li>
<li>Smith, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+drift+time+measurements+from+travelling+wave+ion+mobility+spectrometry-mass+spectrometry+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Mass+Spectrom+%28Chichester%2C+Eng%29%22%5BJournal%5D)">Deciphering drift time measurements from travelling wave ion mobility spectrometry-mass spectrometry studies.</a> Eur J Mass Spectrom (Chichester, Eng). 15 (2), 113-130 (2009).</li>
<li>Leary, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodology+for+measuring+conformation+of+solvent-disrupted+protein+subunits+using+T-WAVE+ion+mobility+MS%3A+an+investigation+into+eukaryotic+initiation+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Methodology for measuring conformation of solvent-disrupted protein subunits using T-WAVE ion mobility MS: an investigation into eukaryotic initiation factors.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 20 (9), 1699-1706 (2009).</li>
<li>Lorenzen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+stoichiometry+and+conformational+changes+in+the+first+step+of+the+P22+tail+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Determination of stoichiometry and conformational changes in the first step of the P22 tail assembly.</a> J Mol Biol. 379 (2), 385-396 (2008).</li>
<li>Pukala, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+architecture+of+multiprotein+assemblies+determined+using+restraints+from+gas-phase+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Subunit architecture of multiprotein assemblies determined using restraints from gas-phase measurements.</a> Structure. 17 (9), 1235-1243 (2009).</li>
<li>van Duijn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperonin+complexes+monitored+by+ion+mobility+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Chaperonin complexes monitored by ion mobility mass spectrometry.</a> J Am Chem Soc. 131 (4), 1452-1459 (2009).</li>
<li>Ruotolo, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+macromolecular+protein+rings+in+the+absence+of+bulk+water%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evidence for macromolecular protein rings in the absence of bulk water.</a> Science. 310 (5754), 1658-1661 (2005).</li>
<li>Ruotolo, B. T., Robinson, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspects+of+native+proteins+are+retained+in+vacuum%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Aspects of native proteins are retained in vacuum.</a> Curr Opin Chem Biol. 10 (5), 402-408 (2006).</li>
<li>Giles, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+a+travelling+wave-based+radio-frequency-only+stacked+ring+ion+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Applications of a travelling wave-based radio-frequency-only stacked ring ion guide.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 18 (20), 2401-2414 (2004).</li>
<li>McKay, A. R., Ruotolo, B. T., Ilag, L. L., Robinson, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+measurements+of+increased+accuracy+resolve+heterogeneous+populations+of+intact+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Mass measurements of increased accuracy resolve heterogeneous populations of intact ribosomes.</a> J Am Chem Soc. 128 (35), 11433-11442 (2006).</li>
<li>Ruotolo, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+mobility-mass+spectrometry+reveals+long-lived%2C+unfolded+intermediates+in+the+dissociation+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Ion mobility-mass spectrometry reveals long-lived, unfolded intermediates in the dissociation of protein complexes.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 46 (42), 8001-8004 (2007).</li>
<li>Morton, V. L., Stockley, P. G., Stonehouse, N. J., Ashcroft, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+virus+capsid+assembly+from+non-covalent+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom+Rev%22%5BJournal%5D)">Insights into virus capsid assembly from non-covalent mass spectrometry.</a> Mass Spectrom Rev. 27 (6), 575-595 (2008).</li>
<li>Valentine, S. J., Counterman, A. E., Clemmer, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+database+of+660+peptide+ion+cross+sections%3A+use+of+intrinsic+size+parameters+for+bona+fide+predictions+of+cross+sections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">A database of 660 peptide ion cross sections: use of intrinsic size parameters for bona fide predictions of cross sections.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 10 (11), 1188-1211 (1999).</li>
<li>Mesleh, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+information+from+ion+mobility+measurements%3A+effects+of+the+long-range+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural information from ion mobility measurements: effects of the long-range potential.</a> J Phys Chem. 100, 16082-16086 (1996).</li>
<li>Shvartsburg, A. A., Jarrold, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+exact+hard-spheres+scattering+model+for+the+mobilities+of+polyatomic+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Phys+Lett%22%5BJournal%5D)">An exact hard-spheres scattering model for the mobilities of polyatomic ions.</a> Chem Phys Lett. 261, 86-91 (1996).</li>
</ol>

Het protocol hier beschreven staat het definiëren van de botsing doorsnede van eiwitten of eiwitcomplexen met een onbekende driedimensionale structuur, met als doel het verstrekken van informatie over hun algemene vorm, subunit verpakking en topologie. Daartoe eens botsing doorsnede waarden worden weergegeven is het noodzakelijk om deze waarden om te zetten in structurele details. Dit proces vereist extra experimentele inspanningen en computationele analyse, die hieronder kort worden besproken. Om te beginnen, is het raadzaam om eiwitten of eiwitcomplexen te analyseren met bekende structuren. Deze metingen kunnen een nuttige kwaliteitscontrole van de methodologie en de nauwkeurigheid beoordeling van de verwerving parameters kunnen door het vergelijken van de theoretische en gemeten Ω waarden. De theoretische dwarsdoorsneden kunnen worden berekend op basis van de kristalstructuur coördineert het gebruik van de MOBCAL 15,16 software, die een open source FORTRAN gebaseerde software waardoor code editing afhankelijk van de operator nodig heeft. Voor het uitvoeren van dergelijke berekeningen is het noodzakelijk om het programma zodanig dat het aantal van iteratieve berekeningen die zijn uitgevoerd per ingang structuur is verhoogd en dat de coördinatie van bestanden met groot aantal atomen worden geaccepteerd 1 te wijzigen. Een IM-MS strategie voor het definiëren van topologische arrangementen van subeenheden binnen multicomponent assemblies is onlangs voorgesteld 4,6. Bij deze methode wordt de bewaking van dissociatie paden van verzamelingen van eiwitten tot kleinere componenten. Deze dissociatie wordt bereikt door gecontroleerde aanpassing van de oplossing voor de omstandigheden, die aanleiding geeft tot een verdeling van subcomplexes een afspiegeling is van de &quot;bouwstenen&quot; van de assemblages. De gelijktijdige meting van Ω waarden van zowel de intacte complexe en demontage producten genereert structurele beperkingen die vervolgens worden gebruikt voor het berekenen van topologische modellen van de eiwitcomplexen. Het uitgangspunt ten grondslag liggen aan deze methodiek is dat de gegenereerde subcomplexes hun moedertaal-achtige bevestigingen te behouden, ja en recente studies hebben aangetoond dat de oplossing structuur van de demontage producten gehandhaafd blijft en er geen grote herschikking in een van beide oplossing of gas fases hebben plaatsgevonden 4,6. De laatste stap in de toewijzing van quaternaire structuur om gas-fase-eiwit complex ionen is de montage van de botsing doorsnede waarden computer gegenereerde modellen. Modeling benaderingen zijn gebruikt om de verschillende mogelijke topologische arrangementen van subeenheden en hun in silico Ω worden berekend en vergeleken met de experimentele degenen te verkennen. Op dit moment slechts een paar computationele benaderingen worden gebruikt, zoals de spheretype grofkorrelige methode die de diameter van subeenheden 1,8 benadert. Over het geheel, dit gebied is nog in zijn vroege jaren en de verdere ontwikkeling nodig is om deze aanpak generiek, en toepasbaar op een breed scala van complexen.

t-wave ion mobility-massaspectrometrie: basic experimentele procedures voor protein complex analysis

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

Ion mobiliteit (IM) is een methode die de tijd genomen voor een ion te reizen door middel van een druk cel onder invloed van een zwak elektrisch veld maatregelen. De snelheid waarmee de ionen doorkruisen de drift regio is afhankelijk van hun grootte: grote ionen een groter aantal botsingen ervaring met de achtergrond inert gas (meestal N 2) en dus reizen meer langzaam door de IM-apparaat dan de ionen die een kleinere vormen doorsnede. In het algemeen, de tijd die het duurt voor de ionen om te migreren hoewel de dichte gasfase scheidt hen, volgens hun botsing doorsnede (Ω). Onlangs werd IM spectrometrie gekoppeld aan massa spectrometrie en een reizende-wave (T-golf) Synapt ionen mobiliteit massaspectrometer (IM-MS) werd uitgebracht. Het integreren van massaspectrometrie met ion mobiliteit in staat stelt een extra dimensie van het monster scheiding en definitie, waardoor een drie-dimensionale spectrum (massa op te laden, de intensiteit en drift tijd). Deze scheiding techniek kan de spectrale overlap te verminderen, en maakt resolutie van heterogene complexen met zeer vergelijkbare massa, of massa-tot-lading ratio&#39;s, maar verschillende drift tijden. Bovendien is de drift tijd metingen geven een belangrijke laag van structurele informatie, zoals Ω is gerelateerd aan de totale vorm en topologie van het ion. De correlatie tussen de gemeten drift tijd waarden en Ω wordt berekend met behulp van een kalibratie-curve gegenereerd uit kalibratieoplossing eiwitten met gedefinieerde doorsneden 1. De kracht van de IM-MS aanpak ligt in zijn vermogen om het subunit verpakking en algemene vorm van de verzamelingen van eiwitten bij micromolaire concentraties te definiëren, en bijna-fysiologische omstandigheden 1. Verschillende recente studies IM van zowel individuele eiwitten 2,3 en niet-covalente eiwitcomplexen 4-9, met succes aangetoond dat eiwit quaternaire structuur behouden blijft in de gasfase, en benadrukt het potentieel van deze benadering in de studie van de verzamelingen van eiwitten van onbekende geometrie . Hier bieden wij een gedetailleerde beschrijving van de IMS-MS analyse van eiwitcomplexen met behulp van de Synapt (Quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) HDMS instrument (Waters Ltd, de enige commerciële IM-MS instrument op dit moment beschikbaar) 10. Beschrijven we de basis optimalisatie stappen, de kalibratie van de botsing doorsneden, en methoden voor gegevensverwerking en interpretatie. De laatste stap van het protocol bespreekt methodes voor de berekening van de theoretische Ω waarden. Het geheel genomen, is het protocol geen poging om elk aspect van IM-MS karakterisering van verzamelingen van eiwitten te dekken, maar veeleer, haar doel is om de praktische aspecten van de methode te introduceren om nieuwe onderzoekers in het veld.

Ion mobility-massaspectrometrie is een nieuwe gas-fase ionen technologie die scheidt, op basis van hun botsing doorsnede en massa. De methode biedt drie-dimensionale informatie over de algemene topologie en de vorm van eiwitcomplexen. Hier schetsen we een basisprocedure voor het instrument instellen en optimaliseren, kalibratie van drift tijden en data interpretatie.

T-wave Ion Mobility-massaspectrometrie: Basic Experimentele Procedures voor Protein Complex Analysis

Ionmobiliteit (IM) is een methode die de tijd meet die een ion nodig heeft om door een onder druk gezette cel te bewegen onder invloed van een zwak elektrisch veld. ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het bepalen van de globale vorm van proteïnecomplexen. Dit wordt bereikt door massaspectrometrie-ionmobiliteitsgegevens voor proteïnecomplex-ionen te verkrijgen en de drifttijdwaarden van elke ladingsstaat te meten. Als tweede stap worden de experimentele omstandigheden gevalideerd om mobiliteitsmetingen van natieve proteïnestructuren te garanderen.Vervolgens worden de gemeten drifttijdwaarden gecorreleerd met doorsnedevlakken. De resultaten bepalen de waarden van de botsingsdoorsnede van eiwitten of eiwitcomplexen met onbekende driedimensionale structuren. Deze informatie geeft aanwijzingen over hun algemene vorm, de pakking van subeenheden en de topologie.Hallo, ik ben Isaac Leski van het Lab of Mic, afdeling Biologische Chemie aan het Wiseman Institute of Sciences, en ik ben Noam Kirschenbaum, ook van het lab of mi. Vandaag tonen we een procedure voor het meten van de collision cross-section van proteïnecomplexen met behulp van hybride massaspectrometrie en ionmobiliteitsinstrumenten. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de algemene vorm en ruimtelijke organisatie van proteïnecomplexen te bestuderen.Laten we beginnen. Deze procedure richt zich op ionenmobiliteitsmassaspectrometrie of IMM MS-analyse van proteïnecomplexen. De stappen voor monsterpreparatie, instrumentkalibratie en de optimalisatieprocedures voor MS en tandem-MS worden gedemonstreerd in een gerelateerd JO-protocol.In het algemeen omvat dit protocol lage micromolaire concentraties van het complex in een vluchtige buffer, zoals ammoniumacetaat. Aangezien er één tot twee microliter per nano flow capillair wordt verbruikt, dient een minimumvolume van 10 tot 20 microliter te worden klaargemaakt om optimalisatie van de MS-condities mogelijk te maken. Om deze procedure te starten, stelt u de traveling wave of T-wave synap IMMS in op de volgende bedrijfsmodi: mobility tof, waarbij de tri-wave en druk automatisch worden ingesteld voor zowel IM- als time-of-flight-scheiding van ionen, positieve ionenacquisitie en V-modus, waarbij het pad van de ionen door de vluchtbuis en reflectie wordt ingesteld; schakel hier alle gassen in.Stikstof wordt gebruikt voor de IM-scheiding en argon voor de trap- en transferregio's. De aanbevolen beginwaarden zijn een gasstroom van 24 milliliters per minuut voor het IMS-apparaat en 1,5 milliliters per minuut voor de trap-regio. Stel vervolgens het acquisitiebereik van de massa-ladingverhouding in voor een onbekend eiwitcomplex.Gebruik in eerste instantie een breed massabereik, dat vervolgens kan worden beperkt tot de gewenste waarden, en pas het MS-profiel dienovereenkomstig aan. Voor maximale transmissie-efficiëntie van grote complexen moet het acquisitiemassabereik worden ingesteld op 1030 2000 m/z en het MS-profiel op auto. Anders kan het profiel worden ingesteld volgens de getoonde tabel.Controleer de RF-instelling en pas deze indien nodig aan naar waarden die geschikt zijn voor grote proteïnecomplexen, zoals getoond. Laad vervolgens het monster en breng de capillaire spanning en een lage nanoflow-druk aan. Zodra de spray is gestart, probeert u de nanoflow-druk te verlagen naar een minimale waarde.Pas daarnaast de positie van de capillaire ten opzichte van de kegel aan en stel de MS-acquisitieparameters zo in dat er goed opgeloste MS-spectra worden verkregen. Optimaliseer de drukgradiënt langs het instrument en de bemonsteringskegel, evenals de potentiaalinstellingen van de extractiekegel, bias trap en transfer, zoals gedetailleerd beschreven in het bijbehorende JoVE-protocol. Hoewel deze parameters afhankelijk zijn van het monster, worden hier de condities weergegeven die zijn gebruikt voor het verkrijgen van MS-spectra van diverse ijzermassa's, van peptiden tot proteïnecomplexen.Grote ionen vereisen hogere botsingsenergieën en een hogere bias-spanning. Voor de analyse van grote proteïnecomplexen wordt tevens aanbevolen om de tegendruk te verhogen om de activering van het complex te minimaliseren. Probeer de extractiespanning van de samplecone, de cone trap-spanning en de bias-spanning geleidelijk in stappen van ongeveer 10 volt te verlagen, zonder dat de positie van de piek verandert.Zodra een optimaal massaspectrum is verkregen, moet de drifttijd of het IM-profiel worden aangepast bij het analyseren van eiwitcomplexen. Optimale condities voor zowel massa- als mobiliteitsmetingen zijn vaak incompatibel. Daarom is het belangrijk om de juiste balans tussen beide te vinden.Over het algemeen moet het ijzermobiliteitsdiagram zodanig worden geoptimaliseerd dat de pieken over het gehele drifttijdinterval zijn verdeeld en het piekprofiel vloeiend is. Bij een Gaussische distributie kan een significante piek-asymmetrie worden gerelateerd aan een slechte scheiding van meerdere conformaties. De T-wave-snelheid, T-wave-hoogte en de IMS-gasstroomsnelheid kunnen worden afgestemd om de mobiliteitsscheiding te optimaliseren. Het verhogen van de T-wave-snelheid verbreedt het distributieprofiel van de drifttijd.Terwijl verhoogde T-wave-hoogtewearden het spectrum vernauwen, verschuift een soortgelijke verhoging van de IMS-gasstroom, beginnend bij een minimum van 10 milliliters per minuut, het drifttijdprofiel naar hogere waarden; dit dient om het ionenmobiliteitsspectrum te optimaliseren. Door twee van de drie variabelen vast te leggen en de derde te optimaliseren, wordt de T-wave-snelheid ingesteld op 250 meters per seconde en de gasstroom op 24 milliliters per minuut. Stel vervolgens als startpunt de hoogte in op drie volt en verhoog deze stapsgewijs in incrementen van één volt.Wanneer hoge bias-spanningen worden gebruikt, wordt aanbevolen om de IMS-gasdruk te verlagen en op deze manier een verlaging van de bias-spanning mogelijk te maken. Bijgevolg zullen complexe activatie en dissociatie worden verminderd. Wanneer de omstandigheden niet zijn geoptimaliseerd, kan er een rollover-effect optreden, dat wordt waargenomen als een identieke piek in het eerste deel van het drift-tijdspectrum en aan de staartzijde.Wanneer de ionen niet door het IAM-apparaat bewegen, kan hun traject in feite langer duren dan de tijd die nodig is om het volgende ijzerpakket in de mobiliteitscel vrij te laten. Als gevolg hiervan wordt een nieuwe groep ionen uit het trapgebied losgelaten voordat het vorige pakket is afgeleverd in het pushergebied. Om dit artefact te elimineren, dient de T-wave-hoogte te worden verhoogd en de T-wave-snelheid en de IMS-druk te worden verlaagd.Daarnaast kan de tijd voor het vrijlaten uit de val worden aangepast. Bovendien is het belangrijk om te valideren dat de hoogte van de transfer-T-golf is ingesteld op ten minste vijf volt. Dit dient ook om lekkage van ionen naar de IMS-cel te voorkomen.De hoogte van de mobiliteitsval moet op het maximale niveau worden gehouden. Lage snelheden en hoge amplitudes van de overdracht-T-golven kunnen leiden tot rimpelingen in het profiel van de drifttijdverdeling. Dit artefact treedt op wanneer de mobiliteitsscheiding van ionen niet wordt gehandhaafd door de overdrachts- en turbulente regio's, als gevolg van gedeeltelijke synchronisatie tussen de pusha-frequentie en de snelheid van de overdracht-T-golf.Om dit effect te elimineren, moet ofwel de duur van de pusher-puls of de snelheid van de transfer T-golf worden aangepast. Aangezien de pusher-frequentie gerelateerd is aan het massabereik, kan dit artefact opnieuw optreden wanneer deze parameter wordt gewijzigd.De hoogte van de T-golf heeft een gering effect, hoewel een vermindering hiervan ook kan helpen om rimpelingen te elimineren. Zodra de bovengenoemde parameters zijn geoptimaliseerd, kunnen de IMMS-gegevens worden verzameld om een hoge resolutie te bereiken.MS.Peaks-eiwitcomplexen worden vaak geactiveerd binnen de massaspectrometer om het verwijderen van resterend water en buffercomponenten te bevorderen. Wanneer de activeringsenergie echter boven een drempelwaarde stijgt, kan er gedeeltelijke ontvouwing optreden waarbij meerdere intermediaire toestanden worden gevormd; deze komen waarschijnlijk niet overeen met de structuur in de natuurlijke oplossingsstaat. Als gevolg hiervan kan de drift-tijdpiek verschuiven en verbreden, wat de heterogene populatie van ontvouwen structuren weerspiegelt.Om drifttijdgegevens te verkrijgen die consistent zijn met structuren in de vloeistoffase, is het essentieel om de voltages die worden gebruikt voor het versnellen van ionen voorafgaand aan de IM-scheiding zorgvuldig te controleren; verhoog daarom de capillaire- en cone-voltage stapsgewijs terwijl het effect op het drifttijdspectrum wordt gemonitord. Bovendien is het voor een hoge MS-resolutie preferabel om de transfer-voltage te verhogen in plaats van de trap-voltage. Het IM-apparaat is als eerste gepositioneerd, gevolgd door de transferregio en de TOF-analysator.Aangezien de activatie plaatsvindt na de IM-meting, blijven deze onbeïnvloed voor IM, terwijl de MS-nauwkeurigheid kan worden verhoogd om te waarborgen dat de data-acquisitie wordt uitgevoerd onder omstandigheden die de natuurlijke structuur van het complex behouden; het is daarom belangrijk om gegevens te verzamelen over een reeks experimentele condities en oplosingscondities in plaats van vast te houden aan één enkele geoptimaliseerde set parameters. Verhoog om die reden de trap collision voltage stapsgewijs en verzamel gegevens in intervallen van 10 volt, terwijl het effect op het ionenmobiliteitsprofiel wordt gemonitord. Om tot slot de ontvouwen conformaties te identificeren en de verkregen gegevens te beoordelen, wordt de dissociatie van het proteïnecomplex handmatig geïnduceerd door het monster te titreren met azijnzuur over een pH-bereik van twee tot zeven; registreer de gegevens en analyseer deze vervolgens in het T-wave IMS-systeem, waarbij de cross-sectionele oppervlakken worden bepaald via een drift-tijd kalibratiemethode met gebruik van Cain-proteïnen met bekende cross-section waarden.Bereid eerst gedenatureerde kalibratie-eiwitoplossingen voor met een concentratie van elk 10 micromolar. Gebruik equin cytochrome C horse, hartmyoglobine en bovine ubiquitine in een volumeverhouding van 49:49:0,2 van water, methanol en azijnzuur. Verkrijg vervolgens IMMS-gegevens voor de kalibratie-eiwitten onder exact dezelfde instrumentcondities als gebruikt voor het doeleiwit of eiwitcomplex; houd alle voltages en drukwaarden identiek om de IM-scheidingsinstellingen te behouden.Na het verkrijgen van de gegevens worden de experimentele drifttijdwaarden voor elke lading geëxtraheerd. Voor de Cain-eiwitten wordt elke gekalibreerde drifttijd T prime D gecorrigeerd met behulp van de volgende vergelijking, waarbij MOVZ de master-ladingsverhouding van het waargenomen ion is en C de vertragingscoëfficiënt van de enhanced duty cycle (EDC) is. De waarde hiervan ligt doorgaans tussen 1,4 en 1,6 en is afhankelijk van het instrument.De EDC-waarde wordt aangegeven in de acquisitie-instellingen van systeem één, onder het tabblad acquisitie-opstelling, waarbij elke van de kalibratiedoorsneden wordt gecorrigeerd voor zowel de ladingstoestand van ijzer als de gereduceerde massa. Hierbij is omega C de gecorrigeerde doorsnede, omega de doorsnede uit de literatuur, Z de ladingstoestand van ijzer, M het molecuulgewicht van het cain-ion en MG het molecuulgewicht van ijzer.Achtergrondgas, dat gewoonlijk stikstof is, plot thelan van T prime D tegenover thelan van omega C. De resulterende curve komt overeen met de volgende vergelijking. De parameters X en A kunnen worden geëxtraheerd door de plot aan een lineair verband te fitten. De helling X komt overeen met de exponentiële proportionele factor, en A vertegenwoordigt de bepaalde constante van de fit.Bereken de correlatiecoëfficiënt van de fit, R kwadraat. Acceptabele waarden voor R kwadraat zijn groter dan 0,95. Een lagere waarde van de correlatiecoëfficiënt kan worden veroorzaakt door onvolledige ontvouwing van het eiwit of veroudering van het monster.Verschillende experimentele condities voor de verschillende eiwitkalibers, een ruisig spectrum en onvolledige gegevensverwerking of een rekenfout. Corrigeer de ca-drifttijd met behulp van de bepaalde exponentiële factor X en valideer uw berekeningen door omega C opnieuw uit te zetten tegen T prime D. Definieer de correlatiecoëfficiënt opnieuw. Waarden hoger dan 0,95 kunnen worden verwacht. Vergelijkbaar met de eerder beschreven stappen, corrigeert u de gemeten drifttijd van het doeleiwit of eiwitcomplex en kalibreert u de drifttijd van het doeleiwit of eiwitcomplex met behulp van de berekende exponentiële factor X. Bereken omega van het doeleiwit of eiwitcomplex met behulp van de via de fit bepaalde constante A, waarbij omega gelijk is aan a TD. Herhaal deze stappen voor elke experimentele conditie.Bij het bepalen van de dwarsdoorsnede van het onbekende eiwit of eiwitcomplex raden wij aan om elk experiment ten minste drie keer te herhalen en de standaarddeviatie van deze triplicaatmetingen te bepalen zodra de waarden voor de botsingsdoorsnede zijn vastgesteld. Er worden modelleringsbenaderingen gebruikt om de topologie of de rangschikking van het complex te voorspellen. Dit gebeurt door de experimentele waarden van de botsingsdoorsnede te fitten aan in silico Omega-waarden die zijn berekend op basis van gegenereerde modelstructuren; over het algemeen bevindt dit vakgebied zich nog in een vroeg stadium en is verdere ontwikkeling nodig om deze benadering generiek en toepasbaar te maken op een breed scala aan complexen.Hier wordt de oppervlaktevoorstelling van de tetramere vorm van runderhemoglobine getoond. Het zuurstoftransportcomplex hemoglobine kan dienen als voorbeeld voor de bovenstaande aanpak. Hemoglobine is een tetrameer eiwitcomplex bestaande uit twee alfabe- en twee betasubunits, respectievelijk blauw en rood gekleurd, die een dimeer vormen van alfa-beta-dimeren.Het IMMS-spectrum van hemoglobine wordt hier getoond. Het verkregen IM ms-spectrum van het complex onthult een belangrijke verdeling van de lade-serie die overeenkomt met het intacte complex en kleinere lade-series, die passen bij de massa's van het alfa-beta-dimeer en de alfa- en beta-monomere subeenheden. De theoretische en gemeten CCS van de verschillende vormen van hemoglobine worden hier getoond.De opgehaalde drift-tijdwaarden voor verschillende ladingsstaten van de dimere en tetramere vormen werden gebruikt om de omega-waarden te berekenen. Deze werden vergeleken met de theoretische waarden. Gezien het feit dat een tetrameer complex drie associatiemogelijkheden heeft: respectievelijk cyclisch, dihedraal of ketenvormige pakkingen.Door de toename in omega te berekenen bij de overgang van een dimeer naar een tetrameer, kan de structurele organisatie worden voorspeld. Eerdere studies en onze eigen experimenten hebben een sterke correlatie aangetoond tussen gemeten ccss en eiwitoppervlakken afgeleid van kristalstructuurgegevens. Deze correlatie kan worden gebruikt om de verwachte toename in oppervlakte van een tetrameer in vergelijking met een dimeer te berekenen voor de verschillende pakkingsvormen.Dit wordt gedaan door elke subeenheid als een asferisch object te beschouwen. Een ketenachtige assemblage zal de CCS van het tetrameer met ongeveer tweemaal verhogen, terwijl een C4- of D2-pakking respectievelijk een toename van ongeveer 1,5 en 1,67 zal opleveren. De berekende ratio tussen de gemeten CCS-waarden van de tetramere en DME-vormen van hemoglobine was 1,57 plus of minus 0,03.Dit getal illustreert dat de natuurlijke structuur niet lineair is georganiseerd, maar is gerangschikt in een compactere vorm, óf als een cycle, óf als een dihedere tetrameer. Bij het herhalen van dezelfde berekening op de opgeloste kristalstructuur van hemoglobine was de ratio van de oppervlakken van tetramere ten opzichte van DME-vormen 1,63, wat past bij een D2-symmetrie. Uiteraard is dit geometrische model vereenvoudigd en zijn eiwitondereenheden niet louter sferisch.Deze berekening demonstreert echter het boeiende potentieel van IMMS voor het onthullen van de pakking van complexen met onbekende structuren met een hoge resolutie. Ik heb zojuist laten zien hoe de drifttijd van het eiwit en de eiwitcomplexen kan worden gemeten en hoe hun waarden voor de botsingsdoorsnede kunnen worden berekend. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de IMMS-gegevens voor de kalibratie-eiwitten te verzamelen onder exact dezelfde omstandigheden als die voor het doeleiwit of de eiwitcomplexen.Bovendien raden we ten zeerste aan om deze experimenten ten minste drie keer te herhalen en de standaarddeviatie van deze triplaatmetingen te bepalen. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

t-wave-ion-mobility-mass-spectrometry-basic-experimental-procedures

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Massaspectrometrie heeft bewezen een waardevol instrument voor het analyseren van grote eiwitcomplexen worden. Deze methode maakt het mogelijk inzicht in de samenstelling, de stoichiometrie en de algemene structuur van multi-subunit assemblages. We beschrijven hier, stap-voor-stap hoe u een structurele massaspectrometrie analyse uit te voeren, en karakteriseren macromoleculaire structuren.

Het analyseren van grote eiwitcomplexen de Structuurfondsen massaspectrometrie

Reactive oxygen species niveau wordt verhoogd wanneer de cellen tegenkomen stress. Hier laten we het voorbeeld van 3'-3 'diaminobenzidine vlekken en cysTMT etikettering en massaspectrometrie om de redox proteoom profileren...

Profilering Thiol Redox Proteome Met behulp van Isotope Tagging massaspectrometrie

De beschreven vergelijkende, kwantitatieve proteomics aanpak is gericht op het verkrijgen van inzicht in de samenstelling van multiprotein complexen onder verschillende omstandigheden en wordt aangetoond door het vergelijken van genetisch verschillende stammen. Voor kwantitatieve analyse gelijke volumes van verschillende fracties van een sucrose dichtheidsgradiënt gemengd en geanalyseerd met massaspectrometrie.

Een nieuwe aanpak voor de Vergelijkende analyse van de multiprotein Complexen Gebaseerd op<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabole Labeling en kwantitatieve massaspectrometrie

Hier beschrijven we een chromatografische test in combinatie met de ion mobiliteit scheiding van peptide precursoren gevolgd door de hoge resolutie (~ 30.000) MS-detectie van peptide fragmenten voor de kwantificering van puntige peptide normen in een monoclonal antilichaam Digest.

Een HS-MRM Assay voor de kwantificering van de gastheercel eiwitten in Protein biofarmaceutica door vloeistofchromatografie Ion mobiliteit QTOF massaspectrometrie

Hier presenteren we protocollen voor affiniteitszuivering van eiwitcomplexen en hun scheiding door blauwe natieve PAGE, gevolgd door proteïne correlatie profilering middels label vrije kwantitatieve massaspectrometrie. Deze methode is nuttig voor interactomen in verschillende proteïnecomplexen lossen.

Het oplossen van Affiniteit gezuiverde eiwit complexen door Blue inheemse PAGE en Protein Correlatie Profiling

We presenteren een protocol om te kwantificeren nauwkeurig eiwitten met isobaar etikettering, uitgebreide fractionering, bioinformatica tools en kwaliteitscontrole stappen in combinatie met vloeibare chromatografie geïnterfacet met een hoge resolutie massaspectrometer.

Diepe Proteoom profilering door isobaar Labeling, uitgebreide vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en Software-bijgewoonde kwantificering

De architectuur van eiwitcomplexen is essentieel voor hun functie. Diverse massaspectrometrische technieken combineren bewezen krachtige te bestuderen van hun vergadering. Wij bieden protocollen voor chemische dwarsbinding en inheemse massaspectrometrie en laten zien hoe deze complementaire technieken helpen ophelderen van de architectuur van multi subeenheid eiwit assemblages.

Chemische dwarsbinding en massaspectrometrie van Intact eiwitcomplexen te bestuderen de architectuur van multi subeenheid eiwit assembly's combineren

De Spectrometrie van de massa (MS) heeft ontpopt als een belangrijk instrument voor het onderzoek naar de structuur en de dynamiek van macromoleculaire assemblages. Hier, wij op basis van MS om te ondervragen eiwit complexvorming en ligand bindende benaderingen worden geïntegreerd.

Analyseren van platforms voor eiwit en eiwit-Ligand complexen door integratieve structurele massaspectrometrie

Een gedetailleerd protocol wordt beschreven voor de scheiding, identificatie en karakterisering van proteoforms in EiwitSteekproeven met behulp van capillaire zone elektroforese-electrospray ionisatie-tandem massaspectrometrie (CZE-ESI-MS/MS). Het protocol kan worden gebruikt voor de hoge-resolutie karakterisatie van proteoforms in simple EiwitSteekproeven en de grootschalige identificatie van proteoforms in complexe Proteoom monsters.

Grootschalige topdown Proteomics met behulp van capillaire Zone elektroforese Tandem massaspectrometrie

Ionenmobiliteitsspectrometrie (IMS) is een interessante aanvulling op massaspectrometrie voor de karakterisering van biomoleculen, met name omdat het gevoelig is voor isomisme. Dit protocol beschrijft een tandem IMS (IMS/IMS) experiment, dat de isolatie van een molecuul en het genereren van de mobiliteitsprofielen van zijn fragmenten mogelijk maakt.

Een cyclische ionenmobiliteitsspectrometer gebruiken voor tandem-ionmobiliteitsexperimenten

Dit artikel beschrijft een experimenteel protocol met behulp van elektrospray-ion mobiliteit-massaspectrometrie, semi-empirische kwantumberekeningen en energie-opgeloste drempelbotsing-geïnduceerde dissociatie om de relatieve thermochemie van de dissociatie van gerelateerde ternaire metaalcomplexen te meten.

Thermochemische studies van Ni (II) en Zn (II) Ternaire complexen met behulp van ionenmobiliteit-massaspectrometrie

Leer T-wave ion mobility-massaspectrometrie voor eiwitcomplexanalyse in de structurele biologie. Deze methode optimaliseert instrumentinstellingen en kalibreert drift tijden om de topologie en subeenheidspakkingsstructuur van eiwitcomplexen te bepalen.

T-wave Ion Mobility-massaspectrometrie: Basic Experimentele Procedures voor Protein Complex Analysis

Meer video's verkennen