Name: MISSIE esiRNA voor RNAi Screening in zoogdiercellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-12T17:45:00.000+00:00
Duration: 15 min 31 s
Description: Leer esiRNA-screening voor RNAi in zoogdiercellen om celcyclusgenen te identificeren. Deze methode optimaliseert transfectie en analyseert celdeling met hoge doorvoer voor functioneel onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen graag de leden van de Buchholz laboratorium en de Sigma-Aldrich RNAi-team te erkennen voor discussie. We willen graag het Max Planck Instituut en het Bundesministerium für Bildung und Forschung grands Go-Bio [0315105] voor support bedanken. MISSIE ® is een geregistreerd handelsmerk van Sigma-Aldrich Biotechnologie LP

1. Van hoge kwaliteit MISSIE esiRNA bibliotheken <ol><li> Voor elke gen van belang de meest gevoelige en specifieke doelgroepen regio voor RNAi is gekozen gebruik te maken van de DEQOR algoritme (http://cluster-1.mpi-cbg.de/Deqor/deqor.html). DEQOR 4 scoort het zwijgen op te leggen potentieel van alle mogelijk 21 nucleotiden lang siRNA&#39;s in een doel-mRNA gebaseerd op state-of-the-art design-beperkingen 4. Daarnaast wordt elke potentiële siRNA geanalyseerd op mogelijke cross-reactiviteit met andere genen door het uitvoeren van een BLAST search tegen het transcriptoom van het organisme bestudeerd. Het programma biedt daarbij een analyse van de algehele kwaliteit en cross-zwijgen capaciteiten van de potentiële esiRNA (300-600 bp lengte). </li><li> De gekozen gebied van het target-gen cDNA wordt geamplificeerd door PCR met behulp van gen-specifieke primers geflankeerd door bacteriofaag RNA-polymerase-promoter sequenties. </li><li> Elke PCR-product dat wordt gebruikt voor Mission esiRNA productie is geverifieerd voor de identiteit van sequencing en voor zuiverheid Caliper Labchip analyse. </li><li> Lange double-stranded RNA wordt getranscribeerd van de PCR-product door RNA-polymerase, gevolgd door een gloeien van de getranscribeerde strengen. </li><li> esiRNAs worden voorbereid door beperkte enzymatische afbraak van de lange double-stranded RNA met behulp van RNaseIII gevolgd door zuivering via anion-uitwisseling chromatografie gebruik te maken van Q-sepharose spin-kolommen. </li><li> esiRNAs zijn neergeslagen en geresuspendeerd in TE-buffer. De opbrengst wordt gemeten door UV-absorptie metingen en de concentratie wordt aangepast door het oplossen in een geschikt volume van TE-buffer. De algehele kwaliteit van het eindproduct wordt gecontroleerd door Remklauw Labchip analyse. </li></ol> 2. Het kiezen van een cellijn en het optimaliseren van transfectie voor het screenen van <ol><li> Titreer hoeveelheden esiRNA (gebruik Eg5 als positief en renilla-luciferase als negatieve controle) en de steeds grotere hoeveelheden van de transfectie reagens in een 384-wells plaat, toe te voegen cellen en incubeer gedurende 48 uur. Eg5 is een kinesine motor eiwitten die nodig zijn voor een bipolaire assemblage van de spoel en de uitputting leidt tot een mitotische arresteren. Herhaal deze procedure voor verschillende transfectiereagentia en cellijnen. Hier gebruiken we HeLa cellen gekweekt volgens standaard procedures en oligofectamine (Invitrogen) als transfectiereagens. </li><li> Voor het kiezen van de optimale transfectie voorwaarden tel de cellen getransfecteerd met Eg5 esiRNAs dat een mitotische arrestatie (ronde vorm) en het totale aantal cellen getransfecteerd met renilla-luciferase (RLUC) esiRNA met lichtmicroscopie show. Kies de conditie met de minste toxiciteit voor RLUC en de meest uitgesproken fenotype voor Eg5. Een alternatieve methode voor het optimaliseren van transfectie omstandigheden gaat om een ​​stabiele cellijn die EGFP (of een ander geschikt reportergen) onder de controle van een constitutieve actieve promotor. Na transfectie van een esiRNA tegen EGFP (of een ander reportergen) en RLUC (of een ander geschikt negatieve controle esiRNA) te meten knock-down werkzaamheid en de toxiciteit door bijvoorbeeld fluorescentie bijgestaan ​​celsortering (FACS). Zorg ervoor dat de gebruikte esiRNA voor EGFP is volledig complementair aan het doel-mRNA. </li></ol> 3. Instellen van de primaire scherm 5,6 <ol><li> Optimaliseer de pipetteren nauwkeurigheid voor alle gebruikte componenten op een geautomatiseerde pipetteren station (bijvoorbeeld Aquarius, Tecan en WellMate, Matrix). Omdat pipetteren parameters te wijzigen afhankelijk van het type van de oplossing, het volume en de plaat het type deze optimalisatie moet worden herhaald voor elke stap afzonderlijk. Indien mogelijk, moet het pipetteren station worden geplaatst onder een laminaire stroming kap verontreinigingen te voorkomen. Alle gebruikte onderdelen moeten worden opgeschoond voor gebruik hetzij door autoclaveren indien van toepassing of door te besproeien met 75% ethanol. Optimaliseer wash-protocollen, zodat kruisbesmetting van goed tot goed is uitgesloten. Details voor het optimaliseren van geautomatiseerde pipetteren kan niet worden geven voor de ruimte-beperkingen en grotendeels op de gebruikte pipetteren station hangen. Voor verdere informatie wordt verwezen naar de fabrikanten protocol. </li><li> Transfecteren cellen in 384-wells formaat met behulp van de geoptimaliseerde omstandigheden van boven met esiRNAs voor Eg5 en RLUC. Gebruik een afwisselend patroon voor Eg5 en RLUC esiRNA voor de hele plaat. </li><li> Na incubatie gedurende 48 uur de cellen herstellen met koude 100% ethanol, hydrateren in PBS gedurende 15 minuten, vlek 25 minuten in PBS met 1 ug / ml DAPI en 100 ug / ml RNase A (Qiagen). Tenslotte wassen met PBS en bewaar bij 4 ° C. </li><li> Meten de intensiteit van de DAPI-fluorescentie microscopie door bijvoorbeeld op een Olympus ScanR systeem. Het genereren van een histogram door het plotten DAPI intensiteit tegen het aantal cellen en evalueren van de celcyclus verdeling door de berekening van het percentage cellen met het DNA-gehalte 2N voor de G1-fase; &lt;2N&gt; 4N voor de S-fase, 4N voor G2/M-phase en &gt; 4N voor aneuploïdie / polyploïdie. </li><li> Evalueer de homogeniteit van de resultaten over het bord. Verdere optimalisatie is nodig als de resultaten significant verschillen naar positie effe uit te sluitencts. Een veel voorkomend probleem bij het gebruik van multi-well platen wordt versterkt verdamping aan de rand putten tijdens incubatie tijd. Dit leidt tot verschillende experimentele condities in verschillende bronnen, die vaak vertaalt zich in plaat-positie specifieke effecten. Om deze reden adviseren wij om alle rand putten leeg voor een scherm te verlaten. Om verder te minimaliseren verdamping te zorgen dat de couveuses worden gehouden bij hoge luchtvochtigheid. We hebben ook regelmatig dienst verdamping barrières zoals Corning ademend Sealing Tape die verdamping te blokkeren. Ook andere middelen voor positie-effecten moeten worden gehouden, bv. technische variant van de uitlezing systeem (microscoop, plaat lezer, enz.) of variaties in de liquid handling (hellingen, inhomogeniteit van oplossingen, enz.). </li><li> De statistische verschillen tussen de positieve en negatieve controles een maat voor de betekenis van de gebruikte test. Een groot verschil tussen de negatieve controle (of achtergrond lawaai; mock-control) en monster moet worden vastgesteld voordat de eigenlijke screening. Een goede maat voor de statistische significantie is de Z-factor. De Z-factor wordt berekend volgens de formule: Z = 1 - (3 SD [voorbeeld] + 3 SD [mock]) * (| Av [voorbeeld] - Av [mock] |) -1; met SD: standaarddeviatie; Av: gemiddeld. Een Z-factor van 1&gt; Z&gt; 0,5 wijst op een statistisch significante scheiding van negatieve controles (en geluid) van de positieve controles 7. </li></ol> 4. Primaire scherm <ol><li> Bereid 384-well kultuur platen voor transfectie van esiRNAs gebruik te maken van de optimale condities van boven. Hier gebruiken we 15ng esiRNA per goed opgelost in 5μl TE-buffer. Ten minste acht controle posities per plaat dient te worden geladen met de juiste positieve en negatieve controles voor de bestudeerde biologische proces (hier: Eg5 en RLUC). Om te voorkomen dat positie-effecten de rand putten worden geladen met 5μl TE-buffer alleen. </li><li> Voeg 5μl OptiMEM (Invitrogen) met 0.2μl Oligofectamine per goed, meng en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg celsuspensie op de transfectie-mengsel (hier: 40μl van een HeLa celsuspensie bij 25 cellen / ul concentratie, overeenkomend met 1000 cellen per well) en incubeer gedurende 72 uur. </li><li> Meet DNA-inhoud op een geautomatiseerde microscoop (Olympus ScanR, zie boven). Evalueer met behulp van Z-score statistieken voor hit selectie: Z-scores zijn berekend voor alle monster esiRNAs met behulp van het signaal voor de negatieve controle als referentie. Let op, de Z-score is niet hetzelfde als de Z-factor. Z-scores geven een statistische maat voor de significantie van het monster waarden in vergelijking met een (schijn-) controle. Het is berekend volgens de formule: Z = (waarde [Sample] - gemiddelde [mock]) * standaard-deviatie [mock] -1. Voor de hit selectie een drempel moet worden toegepast. Typisch, een betekenis criteria zoals: 2 &lt;Z &lt;-2 is gebruikt, maar afhankelijk van de kwaliteit van de dataset, de bestudeerde biologische proces of simpelweg de omvang van het scherm, verschillende drempels van toepassing kan zijn. Naast de vrij gemakkelijk Z-score statistieken ook meer uitgebreide wiskundige evaluatie methoden kunnen worden gebruikt (een eerste binnen in het brede gebied van de statistische evaluatie van de screening gegevens zijn te vinden in Malo et al.. 8). </li></ol> 5. Tweede scherm en druk op validatie <ol><li> Een tweede scherm volgt de primaire scherm om valse positieven te wijten aan experimentele fouten of off-target effecten te elimineren. Voor de geselecteerde raakt dezelfde procedure als die bij de eerste scherm moet worden herhaald voor een groter aantal herhalingen (3-5) tot een betere statistische evaluatie mogelijk te maken. </li><li> Voor geverifieerd raakt een secundair niet-overlappende esiRNA (of een andere niet-overlappende silencing trigger) ten opzichte van de doelstellingen die in de eerste schermen worden gebruikt. Dezelfde test en lees-out moet worden toegepast als voor de primaire scherm. </li><li> Uiteindelijk is de geselecteerde genen kunnen worden gevalideerd door cross-soort RNAi te redden 9. Daardoor een bacteriële kunstmatig chromosoom (BAC) codering bijvoorbeeld de muis ortholog van het gen is stabiel getransfecteerd in cellen. BAC-construeert het behoud van een gen in zijn genoom context en zorgen voor een bijna-fysiologische expressie. RNAi tegen de endogeen humaan gen zal verlaten met de muis transgenexpressie onveranderd waarin de RNAi-fenotype reddingen. RNAi-rescue levert de gouden standaard voor de controle van RNAi fenotypes beschikbaar zijn tot op heden. </li><li> Ten slotte worden de gevalideerde kandidaten in meer detail bestudeerd om uiteindelijk leiden mechanistisch begrip. In vele gevallen RNAi kan worden gebruikt in deze experimenten, bijvoorbeeld in het voortgezet, meer uitgebreide testen. </li></ol>

<ol><li>Ghildiyal, M., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+silencing+RNAs%3A+an+expanding+universe%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Small silencing RNAs: an expanding universe.</a> Nat Rev Genet. 10, 94-108 (2009).</li>
<li>Jackson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+profiling+reveals+off-target+gene+regulation+by+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi.</a> Nat Biotechnol. 21, 635-637 (2003).</li>
<li>Echeverri, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimizing+the+risk+of+reporting+false+positives+in+large-scale+RNAi+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Minimizing the risk of reporting false positives in large-scale RNAi screens.</a> Nat Methods. 3, 777-779 (2006).</li>
<li>Henschel, A., Buchholz, F., Habermann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DEQOR%3A+a+web-based+tool+for+the+design+and+quality+control+of+siRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DEQOR: a web-based tool for the design and quality control of siRNAs.</a> Nucleic Acids Res. 32, W113-W120 (2004).</li>
<li>Kittler, R., Pelletier, L., Buchholz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+biology+of+mammalian+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Systems biology of mammalian cell division.</a> Cell Cycle. 7, 2123-2128 (2008).</li>
<li>Kittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+RNAi+profiling+of+cell+division+in+human+tissue+culture+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-scale RNAi profiling of cell division in human tissue culture cells.</a> Nat Cell Biol. 9, 1401-1412 (2007).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).</li>
<li>Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+practice+in+high-throughput+screening+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Statistical practice in high-throughput screening data analysis.</a> Nat Biotechnol. 24, 167-175 (2006).</li>
<li>Kittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+rescue+by+bacterial+artificial+chromosome+transgenesis+in+mammalian+tissue+culture+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">RNA interference rescue by bacterial artificial chromosome transgenesis in mammalian tissue culture cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 2396-2401 (2005).</li>
<li>Kittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+resources+for+endoribonuclease-prepared+short+interfering+RNAs+for+specific+loss-of-function+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide resources for endoribonuclease-prepared short interfering RNAs for specific loss-of-function studies.</a> Nat Methods. 4, 337-344 (2007).</li>
</ol>

Auteurs verklaren de financiële relaties met commerciële entiteiten die een interesse in het ingezonden werk zou kunnen hebben.

RNA-interferentie is uitgegroeid tot een standaard techniek om het verlies-van-functie fenotypes bestuderen. Grootschalige collecties van RNAi-mediators zijn verkrijgbaar bij verschillende leveranciers en bieden een eenvoudige, kosteneffectieve en snelle methode voor het gen-silencing. Dit opende de poort voor de systematische screening voor key-spelers in veel biologische processen waarmee een genoom-schaal perspectief op een breed scala van verschillende soorten en celtypes. Hoge vals positieve en vals negatieve tarieven zijn een gemeenschappelijke uitdaging in RNAi schermen. Om dit probleem, zijn aanzienlijke inspanningen geïnvesteerd om de werkzaamheid te verbeteren en in het bijzonder de specificiteit van het zwijgen triggers. Een belangrijke ontdekking was dat een pool van verschillende siRNA&#39;s gericht op dezelfde doelgroep specificiteit transcript sterk verbetert. Omdat een zeer complexe pool van verschillende siRNA&#39;s wordt geproduceerd door de endoribonuclease, esiRNAs hoog doelwit specificiteit triggers, het verminderen van de vals-positieve tarief in RNAi schermen. esiRNAs hebben ook aangetoond dat een efficiënte knockdowns te bereiken, waardoor ook de valse negatieve rente. Omdat de RNAi-schermen zijn technisch veeleisend, zullen ze waarschijnlijk blijft een uitdaging om uit te voeren op een routine-basis voor bepaalde tijd. Echter, zoals reagentia en-instrumenten beter en meer laboratoria delen hun expertise, is het gebruik van RNAi-schermen in de moderne biologie geacht te verhogen in de toekomst.

<table><tbody><tr><td>MISSION esiRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Voor aanvullende informatie neem contact op via: rnai@sial.com</td></tr><tr><td>Wellmate</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ademende afdichtingsband</td><td>Corning</td><td>Breathable Sealing Tape, Steriel (Product #3345)</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=E7023%7CSIAL&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12346">Ethanol&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>200 proof (absoluut), voor moleculaire biologie</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=P5493%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12347">Fosfaatgebufferde zoutoplossing&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td>BioReagent, 10x concentraat, geschikt voor celcultuur, voor moleculaire biologie</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=D8417%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12348">4&amp;#8242;,6-Diamidino-2-fenylindool dihydrochloride&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417</td><td>Poeder, BioReagent, geschikt voor celcultuur, &amp;gt;98% (HPLC en TLC)</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=R6513%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12349">Ribonuclease A uit runderpancreas&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6513</td><td>Voor moleculaire biologie, &amp;#8805;70 Kunitz units/mg proteïne, gelyofiliseerd poeder</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=T9285%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12350">Tris-EDTA bufferoplossing&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9285</td><td>100 x, voor moleculaire biologie</td></tr></tbody></table>

missie esirna voor rnai screening in zoogdiercellen

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA-interferentie (RNAi) is een elementaire cellulaire mechanisme voor de controle van genexpressie. RNAi wordt veroorzaakt door korte double-stranded RNA&#39;s ook wel bekend als kleine interfererende RNA&#39;s (siRNA&#39;s). De korte dubbelstrengs RNA&#39;s zijn afkomstig uit meer dubbelstrengs voorlopers door de activiteit van Dicer, een eiwit van de RNase III familie van endonucleasen. De resulterende fragmenten zijn onderdelen van de RNA-silencing geïnduceerde complex (RISC), sturen het naar de verwante doel-mRNA. RISC klieft het doel-mRNA waardoor de expressie van het gecodeerde eiwit 1,2,3. RNAi is uitgegroeid tot een krachtige en veel gebruikte experimentele methode voor het verlies van gen functie studies in zoogdiercellen gebruik te maken van kleine interfererende RNA&#39;s. Momenteel zijn er twee belangrijke methoden beschikbaar voor de productie van kleine interfererende RNA&#39;s. Een methode houdt in chemische synthese, terwijl een alternatieve methode maakt gebruik van endonucleolytische splitsing van doel-specifieke lange double-stranded RNA&#39;s door de RNase III in vitro. Daarbij is een gevarieerde pool van siRNA-achtige oligonucleotiden gemaakt, die ook bekend staat als endoribonuclease-en-klare siRNA of esiRNA. Een vergelijking van de werkzaamheid van chemisch afgeleid siRNA&#39;s en esiRNAs blijkt dat beide triggers zijn krachtig in het target-gen silencing. Verschillen kunnen echter worden gezien bij het vergelijken van specificiteit. Veel alleenstaande chemisch gesynthetiseerde siRNA&#39;s te produceren opvallende off-target effecten, terwijl het complexe mengsel die inherent zijn aan esiRNAs leidt tot een meer specifieke knockdown 10. In deze studie presenteren we het ontwerp van genoom-schaal MISSION esiRNA bibliotheken en het gebruik ervan voor de RNAi screening geïllustreerd door een DNA-gehalte scherm voor de identificatie van genen die betrokken zijn in cel-cyclus progressie. We laten zien hoe je de transfectie protocol en de test voor screening in high throughput te optimaliseren. We hebben ook laten zien hoe groot data-sets kunnen statistisch worden geëvalueerd en de methoden waarop primaire treffers te valideren. Tot slot geven we mogelijke aanknopingspunten voor verdere functionele karakterisering van gevalideerde hits.

Hier gebruiken we een menselijke esiRNA bibliotheek in een high-throughput screen voor genen die betrokken zijn bij de celdeling. Laten we zien hoe het opzetten en uitvoeren een esiRNA schermen, en hoe te analyseren en valideren van de resultaten.

MISSIE esiRNA voor RNAi Screening in zoogdiercellen

RNA-interferentie (RNAi) is een fundamenteel cellulair mechanisme voor de regulatie van genexpressie. RNAi wordt geïnduceerd door korte dubbelstrengs RNA's, ook wel bekend als ...

Het screenen naar genen die geassocieerd zijn met de celcyclus via RNAi begint met het kiezen van een geschikte knockdown-technologie. RNAi-bibliotheken van Sigma Aldrich maken gebruik van de hoge efficiëntie en specificiteit van endoribonuclease-geprepareerde siRNAs. RNAi-pools zijn complexe mengsels van individuele siRNAs, geprepareerd door enzymatische digestie van lang dubbelstrengs RNA dat complementair is aan het doel-mRNA. Het poolen van siRNAs die hetzelfde transcript targeten, verhoogt de specificiteit en voorkomt het arbeidsintensieve zoeken naar efficiënte en specifieke individuele siRNAs.Dit maakt easy RNA bijzonder geschikt voor loss-of-function screenings op grote en middelgrote schaal. Hier tonen we de stappen die nodig zijn voor het uitvoeren van een grootschalige RNA-eye screening, beginnend bij het opzetten van high-throughput transfectie tot aan de ontwikkeling van een geschikte assay. Dit wordt geïllustreerd door het opzetten van een screening voor genen die betrokken zijn bij de progressie van de celcyclus in zoogdiercellen.Ten eerste laten we zien hoe de transfectie van hilar-cellen wordt geoptimaliseerd, gevolgd door een statistische evaluatie van de assay-kwaliteit. Ten slotte wordt een screen op genoomniveau uitgevoerd waarbij de celcyclusdistributie na depletie van het doelgen wordt gemeten. De hits worden geselecteerd met behulp van de zco-statistiek en geverifieerd met secundaire onafhankelijke easy RNA's.Verder beschrijven we potentiële experimentele procedures die kunnen worden gebruikt als vervolg op de RNA-eye screen. Hoi, ik ben Ty van het Max Plank Institute of Molecular Cell Biology and Genetics. En Tristan.Ik ben Frank Al, ook van het Max Planck Institute in Dresden. Vandaag laten we u een procedure zien voor het opzetten van een loss-of-function screen in zoogdiercellen met behulp van Mission Easy RNA's van Sigma Aldridge. Een assay voor het meten van de celcyclusdistributie in een populatie kweekcellen wordt als voorbeeld gebruikt om te demonstreren hoe genen aan biologische processen kunnen worden gekoppeld via RNAi-screening.Laten we beginnen. Elk RNAi-screeningsproject start met de keuze van silencing-triggers; hiervoor worden endonucleasedigesterende siRNAs, of kortweg esiRNAs, gegenereerd door beperkte enzymatische digestie van lang dubbelstrengs RNA met behulp van RNase III. Elk esiRNA wordt geverifieerd op identiteit via sequencing en op zuiverheid via Caliper LabChip-analyse.Het poolen van individuele siRNA's die allemaal op hetzelfde transcript gericht zijn, verhoogt de specificiteit omdat elk siRNA in de pool hetzelfde on-target doelwit deelt, terwijl de off-target effecten worden verdund. Daarom hebben easy RNA's een goede silencing-efficiëntie en een hoge doelspecificiteit, waardoor off-target effecten worden vermeden. Genome scale easy.RNA-bibliotheken worden geleverd door Sigma Aldrich in 384-wells platen waarbij de buitenste wells leeg blijven. Daarnaast worden acht posities in het midden van de plaat leeggelaten voor controles.Subbibliotheken van easy RNA's worden geleverd in 96-wells platen waarbij alle wells bezet zijn; klanten kunnen zelf bepalen hoe de easy RNA's in deze platen worden gerangschikt. Individuele easy RNA's worden geleverd in enkele buisjes. De transfectie van easy RNA vereist optimalisatie voor verschillende transfectiereagentia en cellijnen.Hier worden onze cellen gekweekt volgens standaardprocedures en wordt oligo als transfectiereagens gebruikt. Gebruik EEG five E-Z-R-N-A-A kinesine-motorproteïne, dat vereist is voor de assemblage van de bipolaire spoel, als positieve controle en ran luciferase easy RNA als negatieve controle. Titreer in een 384-wells plaat verschillende hoeveelheden easy RNA, bijvoorbeeld van 1 ng tot 56 ng met een increment van 5 ng, en toenemende hoeveelheden transfectiereagens van 0,1 µL tot 0,9 µL met een increment van 0,05 µL.Voeg na het mengen van het RNA en het transfectiereagens de cellen toe en incubeer deze gedurende 48 uur. Controleer de cellen met een lichtmicroscoop zodra de incubatieperiode is voltooid. Tel de cellen die zijn getransfecteerd met eeg.Vijf eenvoudige RNA's die een ronde vorm vertonen die indicatief is voor mitose. Tel daarnaast het totale aantal cellen dat is getransfecteerd met een negatieve controle. Gran vanilla luciferase eenvoudig RNA.De optimale transfectieconditie vertoont de minste toxiciteit voor vanilla luciferase en het meest uitgesproken fenotype voor EEG five. Nu de transfectieparameters zijn geoptimaliseerd, kan worden overgegaan tot de opzet en de primaire screening. Geautomatiseerde pipetteerstations, zoals Matrix Wellm Mate of Tecan Aquarius, die worden gebruikt voor het voorbereiden van de primaire screenings, moeten onder een laminaire flowkast worden geplaatst om contaminatie te voorkomen.Alle gebruikte componenten moeten vóór gebruik worden gedesinfecteerd, hetzij door autoclaveren indien van toepassing, of door voor aanvang van de screening te besproeien met 75% ethanol. Deze instrumenten dienen te worden geoptimaliseerd volgens de protocollen van de fabrikant. Optimaliseer de nauwkeurigheid van het pipetteren voor alle gebruikte componenten op het geautomatiseerde pipetteerstation, aangezien de pipetteerparameters variëren afhankelijk van het type oplossing, het volume en het type plaat.Deze optimalisatie moet voor elke stap afzonderlijk worden herhaald. Optimaliseer daarnaast de wasprotocollen om kruiscontaminatie tussen de wells uit te sluiten zodra de geautomatiseerde pipetteerstations gereed zijn. Transfecteer cellen in een 384-wells formaat met gebruik van de eerder vastgestelde geoptimaliseerde condities om er zeker van te zijn dat er geen positie-effecten optreden.Gebruik easy RNA's voor EEG vijf en vanilla luciferase in een afwisselend patroon over de gehele plaat. Laat alle buitenste wells leeg, aangezien een veelvoorkomend probleem bij het gebruik van multi-well platen een verhoogde verdamping in de buitenste wells is tijdens de incubatietijd. Dit leidt tot verschillende experimentele condities in verschillende wells, wat vaak resulteert in plaatpositie-effecten; om verdamping verder te minimaliseren, dient men verdampingsbarrières te gebruiken, zoals Corning ademende sealing tape.Zorg er daarnaast voor dat de incubatoren op een hoge luchtvochtigheid worden gehouden. Houd er echter rekening mee dat er mogelijke bronnen voor positie-effecten zijn, zoals variaties in de vloeistofafhandeling of het uitleessysteem, zoals een platenlezer. Fixeer de cellen na incubatie gedurende 48 uur gedurende twee uur met ijskoude, 100% ethanol en rehydrateer ze vervolgens gedurende 15 minuten in PBS.Kleur de gefixeerde cellen gedurende 25 minuten in PBS bevatten 1 µg/mL DPI en 100 µg/mL RNAs. Was vervolgens drie keer met PBS en bewaar bij 4 °C. Meet daarna de intensiteit van de DPI-fluorescentie met behulp van microscopie.Hiervoor wordt telkens een Olympus-scannersysteem gebruikt. We onderzoeken de cellen en bepalen de relatieve DPI-intensiteit. Genereer een histogram door de DPI-intensiteit uit te zetten tegen het aantal cellen op basis van het histogram.Evalueer de celcyclusverdeling door het percentage cellen te berekenen met een DNA-inhoud van 2N voor de G1/G0-fase, tussen 2N en 4N voor de S-fase, 4N voor de G2/M-fase en groter dan 4N voor aneuploïdie of polyploïdie. Om de homogeniteit van de resultaten over de plaat te evalueren, vergelijkt u de celcyclusverdeling tussen de verschillende wells door het percentage cellen in de G2/M-fase voor EEG5 en luciferase-transfectie te vergelijken. Indien de resultaten over de plaat significant verschillen, is verdere optimalisatie vereist om positie-effecten te elimineren. Zodra de consistentie van de resultaten bevredigend is, berekent u de statistische verschillen tussen de positieve en negatieve controles.Gebruik de hier getoonde Z-factorvergelijking om de statistische significantie van de resultaten te bepalen. SD staat voor standaarddeviatie en AV staat voor gemiddelde. Een Z-factor tussen 1 en 0,5 duidt op een statistisch significante scheiding van negatieve controles en ruis ten opzichte van de positieve controles.Als een dergelijk statistisch verschil is vastgesteld, kan men overgaan tot de primaire screening. Bereid 384-well tissue culture platen voor voor de transfectie van easy RNAs met gebruik van de hierboven vooraf bepaalde geoptimaliseerde condities.15 nanogram easy RNA per well worden opgelost in vijf microliter TE-buffer. Ten minste acht controleposities per plaat worden geladen met geschikte positieve en negatieve controles voor het biologische proces. Hier worden EEG vijf en ranil luciferase bestudeerd.Easy RNA's worden gebruikt om positionele effecten te vermijden. De buitenste wells worden enkel gevuld met 5 µL TE-buffer. Voeg vervolgens 5 µL OptiMEM toe, bevattend 0,2 µL oligo per well-mix, en incubeer dit gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.Voeg na het mengen van het RNA met het transfectiereagens de celсусpensie toe. Er worden 40 µL van een HeR-celсусpensie toegevoegd bij een concentratie van 25 cellen per µL, wat overeenkomomt met 1000 cellen per putje; incubeer gedurende 72 uur. Na de incubatie van 72 uur.Meet het DNA-gehalte op een geautomatiseerde microscoop, zoals de Olympus scan R, zoals eerder aangetoond. Herhaal deze procedure voor alle platen van de bibliotheek voor de selectie van hits. Evalueer de waarden van het DNA-gehalte met behulp van Z-score statistieken.Let op dat de Z-score niet hetzelfde is als de Z-factor Z-score. Deze biedt een statistische maatstaf voor de significantie van een monstervalue in vergelijking met een negatieve controle of een mock-controle. De berekening vindt plaats volgens de hier getoonde vergelijking.Bereken de zco voor alle RNA-monsters met behulp van het signaal van de negatieve vanilla luciferase-controle als referentie voor de selectie van hits. Er moet een drempelwaarde worden toegepast. Doorgaans wordt een significantiecriterium gebruikt waarbij Z groter is dan twee of kleiner dan min twee. Afhankelijk van het bestudeerde biologische proces of de reikwijdte van de screening kunnen echter verschillende drempelwaarden worden toegepast.Voor de selectie van hits kunnen ook meer uitgebreide wiskundige evaluatiemethoden zoals de Q worden gebruikt. Vervolgens worden de geselecteerde hits onderworpen aan een secundaire screening en HIIT-validatie. Een secundaire screening van de geselecteerde HIIT-genen volgt op de primaire screening om fout-positieven als gevolg van experimentele variatie te elimineren.Verifieer eerst de geselecteerde hits met dezelfde procedure als bij de primaire screening, maar gebruik voor de hits een groter aantal replica's, tussen drie en vijf, om een betere statistische evaluatie mogelijk te maken. Gebruik voor de geverifieerde hits dezelfde assay en uitlezing als bij de primaire screening, maar met een secundaire, niet-overlappende easy RNA of een andere niet-overlappende silencing-trigger, zoals een chemisch gesynthetiseerd si. RNA. Valideer de geselecteerde genen uiteindelijk via cross-species analyse.RNAi-redding is tot op heden de gouden standaard voor de verificatie van RNAi-fenotypes. Kort gezegd wordt een bacterieel kunstmatig chromosoom (BAC) dat een ortholoog van het geselecteerde gen uit een andere soort codeert, stabiel getransfecteerd in cellen. BAC-constructen behouden een gen in zijn genomische context en maken een bijna fysiologische expressie mogelijk.RNAi tegen het endogene gen laat de expressie van het ortho-transgen ongewijzigd, waardoor het RNAi-fenotype wordt gered. Ten slotte zijn de gevalideerde kandidaten in meer detail bestudeerd om uiteindelijk een mechanistisch inzicht te verkrijgen. In veel gevallen kan RNAi ook worden gebruikt in deze secundaire, meer uitgebreide assays.Bijvoorbeeld, time-lapse microscopie van RNAi-fenotypes. Hier is een voorbeeld van een celcyclus-screening waarbij de DNA-inhoud van HeLa-cellen werd gemeten na knockdown van meer dan 16.000 genen uit het menselijk genoom. Er werden 1.351 primaire hits geïdentificeerd die noodzakelijk zijn voor celdeling.In de secundaire screening werden 743 hits geverifieerd met een secundaire, onafhankelijke easy RNA-trigger met behulp van een secundaire assay. Knockdowns die resulteerden in een G2-arrest werden gescheiden van knockdowns die resulteerden in een mitotisch arrest. Ten slotte werd een rescue-experiment met RNA uit verschillende soorten voor het gen Lin 54 gebruikt om de rol ervan bij een correcte celdeling te valideren.Vervolgexperimenten toonden aan dat de uitputting van Lin 54 de expressie van veel celcyclusgenen veranderde. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u high-throughput transfectie van mission-easy RNA's opzet en hoe u de celcyclusdistributie analyseert in de humane weefselkweekcellijn. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de transfectiecondities en assays afzonderlijk moeten worden geoptimaliseerd voor elk cellulair systeem en elk biologisch proces.Het gebruik van geautomatiseerde vloeistofbehandelingssystemen wordt aanbevolen, maar is niet onmisbaar, vooral niet voor screens op kleine schaal. Handmatige verwerking is eveneens haalbaar. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

mission-esirna-for-rnai-screening-in-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Het endoplasmatisch reticulum speelt een belangrijke rol in de eiwit-biogenese en in de calcium homeostase. We hebben een experimenteel systeem dat ons in staat stelt om de rol van Ca2 + lekkage te verhelpen en om hun vermeende regulerende mechanismen te karakteriseren. Dit systeem houdt in siRNA gemedieerde gene silencing en live cell imaging Ca2 +.

Live-Cell Calcium Imaging Gecombineerd met siRNA gemedieerde gen-silencing Identificeert Ca 2 + Lek Kanalen in het ER membraan en de regulerende mechanismen

De Target ID Library is een plasmide-gebaseerd, genoom-brede collectie van gekloneerde cDNA gebruikt om miRNA targets te identificeren. Hier laten we zien het gebruik en de toepassing.

Genoom-brede scherm voor miRNA Doelen Met behulp van de MISSION Target ID Bibliotheek

Hier gebruiken we een menselijke LentiPlex samengevoegde bibliotheek en traditionele sequencing methoden om gen-doelstellingen het bevorderen van overleving van de cel te identificeren. Laten we zien hoe op te zetten en deconvolute een LentiPlex scherm en valideren van de resultaten.

MISSIE LentiPlex Gepoolde shRNA Library Screening in zoogdiercellen

We beschrijven een gevoelig methode om postembryonic regulatoren van eiwit expressie en lokalisatie...

RNAi screening Postembryonic fenotypes Leg in C. elegans</em

Een stap voor stap-protocol om het isoleren en identificeren van RNA bijbehorende complexen door middel van RIP-Chip.

Werkwijze voor het isoleren en identificeren van mRNAs, microRNA en eiwitcomponenten van ribonucleoproteïne complexen uit celextracten met RIP-Chip

In dit protocol beschrijven we methoden om efficiënt muis macrofaag cellijnen te transfecteren met siRNA's met behulp van het Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle Systeem, de macrofagen te stimuleren met lipopolysaccharide, en de effecten op de productie van inflammatoire cytokinen te monitoren.

Met behulp van RNA-interferentie te onderzoeken de aangeboren immuunrespons in muizenmacrofagen

Hier beschrijven we een methode om een ​​gerichte siRNA "ubiquitome" scherm om nieuwe ubiquitine en ubiquitine-achtige regulatoren van de-HIF1a gemedieerde cellulaire respons op hypoxie identificeren voeren. Dit kan worden aangepast aan elke biologische weg wanneer een robuuste uitlezing van reporter-activiteit beschikbaar.

siRNA Screening naar Ubiquitin en Ubiquitin-achtig systeem regulatoren van biologische pathways identificeren in gekweekte zoogdiercellen

Hier presenteren we een protocol om RNA / eiwit interacties te analyseren. De elektroforetische mobiliteit shift assay (EMSA) is gebaseerd op de differentiële migratie van RNA / eiwit-complexen en vrij RNA in natieve gelelektroforese. Door een radioactief gemerkte RNA-probe, kan RNA / eiwit-complexen worden gevisualiseerd door autoradiografie.

Elektroforetische mobiliteit Shift Assay (EMSA) voor de studie van RNA-eiwit interacties: Het IRE / IRP Voorbeeld

Dit verslag wordt een snelle en betrouwbare methode voor het valideren van mRNA doelstellingen van cellulaire miRNAs beschreven. Het gebruik van de methode synthetische biotinyleerd vergrendeld nucleïnezuur LNA gebaseerde miRNA bootst te vangen target mRNA. Vervolgens daar beklede magnetische kralen pulldown worden gebruikt de doelstelling mRNA voor kwantificering van qPCR polymerase-kettingreactie.

Biotine gebaseerde Pulldown Assay te valideren mRNA doelstellingen van cellulaire miRNAs

SINEUPs zijn synthetische antisense niet-coderende RNAs, die bevatten een bindend domein (BD) en een effector domein (ED) en up-reguleren vertaling van mRNA richten. Hier beschrijven we detectiemethoden voor SINEUPs in gekweekte cellijnen, analyse van hun vertaling-bevordering van activiteiten door Western-blot en een semi-automatische hoge doorvoer imaging systeem.

Cel gebaseerde analyses van SINEUP niet-coderende RNAs die specifiek mRNA vertaling kunnen verbeteren

We ontwikkelden een intronische microRNA-biogenese-reportertest voor gebruik in cellen in vitro met vier plasmiden: één met intronisch miRNA, één met het doelwit, één om een regulerend eiwit te overexpresseren en één voor Renilla luciferase. Het miRNA werd verwerkt en kon de expressie van luciferase controleren door zich aan de doelsequentie te binden.

Een Reporter Assay om intronische microRNA-rijping in zoogdiercellen te analyseren

Leer esiRNA-screening voor RNAi in zoogdiercellen om celcyclusgenen te identificeren. Deze methode optimaliseert transfectie en analyseert celdeling met hoge doorvoer voor functioneel onderzoek.

MISSIE esiRNA voor RNAi Screening in zoogdiercellen

Meer video's verkennen