Injectie van volwassen Drosophila-vliegen: een methode voor samengestelde of labelafgifte
JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologie
0 weergaven • 3:23 min • April 30th, 2023
- Prepare tapered injection needles by pulling thin-walled glass capillaries using a needle puller. Hold a needle under a microscope and break the tip, making sure that the opening is just large enough to pierce the adult fly cuticle without wounding it more than necessary. Measure the injection volume by loading your needle with a sterile dye and salt buffer solution and then ejecting it onto a drop of mineral oil on a stage micrometer. Use the scale on the micrometer to measure the diameter of the ejected droplet, which can be used to calculate the volume dispensed, and calibrate your injector settings accordingly.
Load the needle with your injection solution and mount it onto an injection nozzle. Anesthetize your flies with CO2 and arrange them on a CO2 fly pad that will keep them anesthetized. Once the flies are in the correct orientation for your experiment, proceed with the injections. In the example protocol, we will inject adult flies with fluorescein-labeled particles for in vivo imaging.
- After pulling thin-walled glass capillaries with a needle puller, use a micrometer to hold the needle under a microscope and use number five fine-point stainless steel tweezers to break the tip to a 100 micrometer tip diameter. To measure the volume of liquid that will be injected into each fly, load a capillary needle with sterile 5% food coloring in PBS and expel the liquid onto a drop of mineral oil on a 0.01 millimeter stage micrometer.
Dispense 10 microliters of 1.6 milligrams per milliliter particles onto a small square of parafilm and pull the liquid into the needle. Mount the needle into the injector nozzle and line the anesthetized flies along their designated area on the fly pad, ventral side up, with the heads oriented toward the front of the pad. Place the vials in corresponding areas on the bench and inject the flies at the upper corner of the abdomen with five 100 milliseconds pumps of liquid to deliver about 10 nanoliters of particles total. Transfer each fly into the appropriate vial as it is injected, noting the time on the vial.
Next, load a new needle with 0.4% Trypan Blue solution and set the pneumatic injector to 'gated' to allow a constant flow of air to push the liquid out of the needle. 30 minutes after the initial injection, inject each fly abdomen with Trypan Blue until the abdomens are full and distended. Mount the flies on microscope slides with electrical tape ventral side down, pushing the wings to the side of the fly to secure them to the tape. Then gently push the head into the tape to ensure that the fly will not move.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een protocol voor het injecteren van volwassen vliegen met fluoresceïne-gelabelde deeltjes voor in vivo beeldvorming. De methode omvat het voorbereiden van taps toelopende injectienaalden en het anesthetiseren van de vliegen om nauwkeurige injecties te vergemakkelijken.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Biologie
- In vivo imaging
Achtergrond
- Injectietechnieken zijn cruciaal voor het bestuderen van biologische processen in modelorganismen.
- Met fluoresceïne-gelabelde partikels kunnen geïnjecteerde materialen worden gevisualiseerd.
- Een juiste naaldvoorbereiding en kalibratie zijn essentieel voor een nauwkeurige dosering.
- CO2-anesthesie wordt veelvuldig gebruikt om vliegen tijdens procedures te immobiliseren.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode aan te tonen voor het injecteren van stoffen in volwassen vliegen.
- Om in vivo beeldvorming van biologische processen met behulp van fluorescerende markers te faciliteren.
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor onderzoekers in dit vakgebied.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van taps toelopende injectienaalden met behulp van een naaldtrekker.
- Kalibratie van het injectievolume met een micrometer en steriele kleurstof.
- Anesthesie van vliegen met CO2 en positionering op een fly pad.
- Injectie van fluoresceïne-gelabelde deeltjes en daaropvolgende beeldvorming.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle injectie van deeltjes in het abdomen van volwassen vliegen.
- Visualisatie van geïnjecteerde materialen met behulp van in vivo imaging-technieken.
- Demonstratie van de effectiviteit van het injectieprotocol.
- Vestiging van een methode voor toekomstige studies waarbij vergelijkbare technieken worden gebruikt.
Conclusies
- Het protocol biedt een betrouwbare methode voor het injecteren van stoffen in vliegen.
- In vivo imaging kan effectief worden gerealiseerd met fluoresceïnegelabelde particles.
- Deze techniek kan worden aangepast voor diverse experimentele behoeften in de neurowetenschappen en biologie.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Precieze toediening van verbindingen in modelorganismen maakt mechanische risicoreductie van therapeutische targets mogelijk en ondersteunt de ontwikkeling van assays in een vroeg stadium. Deze methode biedt een schaalbare benadering voor het introduceren van gelabelde verbindingen of biologische stoffen in volwassen Drosophila, wat fenotypische screening en workflows voor targetvalidatie faciliteert. Door het injectievolume te standaardiseren en weefselbeschadiging te minimaliseren, wordt de reproduceerbaarheid in discovery biology-pipelines verbeterd.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door gecontroleerde afgifte van verbindingen of markers aan specifieke weefsels.
- Operationele waarde: Ondersteunt functionele targetvalidatie door directe beoordeling van de opname en distributie van verbindingen in vivo mogelijk te maken.
- Voorspellende waarde: Verhoogt het vertrouwen in gegevens over target-engagement door variabiliteit als gevolg van inconsistente dosering te verminderen.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid voor analyse: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream fluorescentie-gebaseerde read-outs en imaging-toepassingen.
- Kwantitatieve output: Maakt gestandaardiseerde toediening van verbindingen mogelijk, wat reproduceerbare screeningscampagnes ondersteunt.
- Schaalbaarheid: Faciliteert hergebruik van het platform voor meerdere targets of series van verbindingen door middel van consistente naaldkalibratie en injectieparameters.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ziekterelevantie: Ondersteunt het gebruik van Drosophila als een ziekterevant systeem voor het bestuderen van geconserveerde pathways en doelmechanismen.
- Translationele Continuïteit: Slaat een brug tussen ontdekkingsbevindingen en preklinische validatie door consistente modellen voor blootstelling aan verbindingen mogelijk te maken.
- Risico-gecorrigeerde Beslissingen: Informeert go/no-go-criteria via betrouwbare meting van de afgifte en biologische beschikbaarheid van verbindingen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van hypothesetesten van targets tot lead-identificatie, in het bijzonder wanneer de lokalisatie van verbindingen of targetmodulatie in vivo gevisualiseerd moet worden.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing door nauwkeurige aflevering van probes of verbindingen mogelijk te maken om de activiteit van doelpaden te beoordelen.
- Screening: Verbetert de reproduceerbaarheid van assays door gekalibreerde injectievolumes en gestandaardiseerde afleveringsprotocollen.
- Analytica: Genereert kwantitatieve imaging-uitlezingen waarmee de distributie van verbindingen en de target engagement onder verschillende condities kunnen worden vergeleken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt vroege targetvalidatie met preklinische continuïteit door blootstelling aan verbindingen te modelleren in de context van een volledig organisme.
- Bedrijfbrede hergebruikbaarheid: Fungeert als een herbruikbare capaciteit voor meerdere projecten die in vivo aflevering van verbindingen in Drosophila vereisen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen in doelwitvalidatie door mechanische ambiguïteit als gevolg van variabele blootstelling aan verbindingen te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en reproduceerbaarheid tussen laboratoria door naaldkalibratie en controles van injectieparameters.
- Strategische waarde: Ondersteunt betere go/no-go-beslissingen door betrouwbare gegevens over de toediening van verbindingen te verschaffen, waardoor biologische risico's in een laat stadium worden verminderd.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van doelwitten mogelijk op basis van consistente bewijzen van in vivo toediening en doelwitmodulatie.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in microschirurgie en microscopie voor de bereiding van naalden en het hanteren van vliegen.
- Is afhankelijk van toegang tot een naaldtrekker, micrometer en pneumatische injector voor volumekalibratie.
- Vereist standaardisatie van de anesthesie en het tijdstip van injectie tussen teams voor reproduceerbare resultaten.
- Houdt rekening met aanpassingen bij toepassing op verschillende vliegenstammen, leeftijden of viscositeiten van verbindingen.
- Wordt beperkt door de fysieke beperkingen van de vliegformaat en het injectievolume, wat de laadcapaciteit van de verbinding kan beperken.
Veelgestelde vragen over biofarmaceutica
Intraperitoneale injectie in de Adult zebravis
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Insuline-injectie en hemolymfe Extraction om de gevoeligheid voor insuline meten in het volwassenenonderwijs Drosophila melanogaster
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Oprichting van virale infectie en analyse van Host-Virus interactie bij Drosophila Melanogaster
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Micro-injectie technieken voor het bestuderen van mitose in de Drosophila melanogaster Syncytieel Embryo
Gerelateerde video's
0 Bekeken
RNAi Interferentie door dsRNA Injectie in Drosophila Embryo's
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Micro-injection van Drosophila Verpleegkundige Cellen: Een Methode van Intracellulaire Levering
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Micro-injection van Levende Embryo's Drosophila: Vroege Levering van Reagentia aan het Ontwikkelende Embryo
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Micro-injectie wondproef en
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Systemische bacteriële infectie en afweer Phenotypes in
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Levering van nucleïnezuren door middel van Embryo micro-injectie in de Worldwide Landbouw Pest Insect,
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026