Larvale filetvoorbereiding: een methode om intacte sensorische neuronen en bijbehorende epidermale cellen te visualiseren
JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologie
0 weergaven • 3:16 min • April 30th, 2023
- To orient a larva for fillet dissection, place it in a silicone-coated dish containing cold saline and identify its dorsal and ventral sides. Tracheal tubes running along its length mark the dorsal side, while abdominal denticle belts identify the ventral side.
Then, with the ventral side up, gently stretch the larva and pin each end to the bottom of the dish. This position will keep the dorsal clusters of sensory multi-dendritic neurons and the associated epidermal cells intact as the dissection proceeds.
Use dissecting scissors to cut along the ventral midline of the larva. Pin the cuticle to the plate to flatten the preparation and remove internal structures to reveal the underlying muscle tissue. Then, carefully remove the appropriate muscle to expose the epidermis and gain access to previously obscured neurons while preserving their dendritic morphology.
In the example protocol, we will see a detailed demonstration of larval fillet preparation and muscle removal to view sensory da neurons and epidermal cells.
- To begin, add enough cold saline to a silicone elastomer dish to cover the bottom surface. Add the subject larva to the dish and place it under the stereo microscope, ensuring proper placement of light. Position the larva with the ventral side up, which can be identified by the abdominal denticle belts.
Stretch the larva in the anterior-posterior direction, and using insect pins, pin the head and tail to the bottom of the dish. With a pair of fine dissecting scissors, cut along the ventral midline of the larva from one end to the other. Spread the larva open and pin the cuticle tissue at the four corners so that it lies flat.
Using forceps, remove the internal organs, including the CNS, gut, and trachea. Adjust the insect pins so that the fillet is taut, but not maximally stretched.
Locate the dorsal midline of the larva, where muscle tissue is absent and then position a forceps prong at the interior of this boundary. Slide the prong between the muscle and epidermis, taking care to minimize contact with the epidermis.
- To minimize damage to the epidermis, dissect with the flattest possible prongs. And try dissecting in calcium-containing saline. That could help create space between the muscle and the epidermis.
- Next, pull the forceps upwards to break the attachment of the muscle to the body wall at one anchor point. Repeat this process for the remaining muscle segments of interest.
Readjust the insect pens to maximally stretch the larval fillet in all directions.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een protocol voor de dissectie van larvale filets om sensorische neuronen en epidermale cellen bloot te leggen. De methode legt de nadruk op een zorgvuldige behandeling om de neuronale morfologie te behouden terwijl het spierweefsel wordt verwijderd.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Ontwikkelingsbiologie
- Dissectietechnieken
Achtergrond
- Het begrijpen van de structuur van sensorische neuronen is cruciaal voor neurowetenschappelijk onderzoek.
- De bereiding van een fillet maakt directe observatie van de neuronale morfologie mogelijk.
- Het behoud van de weefselintegriteit is essentieel voor een nauwkeurige analyse.
- Calciumhoudende zoutoplossing kan de dissectie vergemakkelijken door ruimte tussen de weefsels te creëren.
Doel van de studie
- Om een methode aan te tonen voor het dissekeren van larvale exemplaren.
- Om sensorische multidendritische neuronen en epidermale cellen bloot te leggen.
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor onderzoekers in het vakgebied.
Gebruikte methoden
- Plaatsing van de larve in koude zoutoplossing voor oriëntatie.
- Identificatie van de dorsale en ventrale zijden aan de hand van anatomische markeringen.
- Dissectie langs de ventrale middellijn om toegang te krijgen tot interne structuren.
- Voorzichtige verwijdering van spierweefsel met behoud van de integriteit van de epidermis.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle blootstelling van sensorische neuronen en epidermale cellen.
- Demonstratie van technieken om schade tijdens de dissectie te minimaliseren.
- Illustratie van de anatomische oriëntatiepunten die in de procedure worden gebruikt.
- Richtlijnen voor het aanpassen van de spanning tijdens de dissectie voor optimale resultaten.
Conclusies
- Het protocol biedt een betrouwbare methode voor de dissectie van larven.
- Het behouden van de weefselintegriteit is cruciaal voor de daaropvolgende analyse.
- Deze techniek kan worden toegepast in diverse neurowetenschappelijke studies.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Deze methode maakt een getrouwe visualisatie van sensorische neuronen en geassocieerde epidermale cellen mogelijk door hinderlijk spierweefsel te verwijderen, terwijl de delicate dendritische morfologie behouden blijft. Voor biofarmaceutische R&D ondersteunen dergelijke preparaten de target-validatie in de neurobiologie door een ziekterelateerd systeem te bieden om de structuur-functie-relaties van neuronen te onderzoeken. De aanpak vergroot het voorspellend vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase door mechanistische ambiguïteit bij de analyse van sensorische paden te verminderen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door directe observatie van de intacte morfologie van sensorische neuronen en epidermale interacties.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbare preparatie die de variabiliteit in immunokleuringen en imaging-assays vermindert.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door de structurele integriteit van neuronale targets te verduidelijken voorafgaand aan compound-screening.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid voor analyse: Genereert gestandaardiseerde biologische systemen die geschikt zijn voor downstream immunofluorescentie- en kwantitatieve imaging-workflows.
- Reproduceerbaarheid: Minimaliseert weefselschade tijdens de dissectie, waardoor een consistente preservering van de epidermale-neuronale interface over verschillende preparaten wordt gewaarborgd.
- Schaalbaarheid: Maakt gebruik van toegankelijke instrumenten (dissectieschaar, insectenpennen, pincetten), waardoor aanpassing aan multi-larvale verwerking voor screening met een medium doorvoersnelheid mogelijk is.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ziekterellevant systeem: Larvale fillets vormen een model voor geconserveerde interacties tussen sensorische neuronen en de epidermis, dat toepasbaar is voor onderzoek naar neuropathische pijn en sensorische stoornissen.
- Translationele continuïteit: Behoud van dendritische arborisatie maakt het mogelijk om structurele fenotypes te correleren met functionele resultaten in preklinische modellen.
- Mechanistische risicoreductie: Maakt voorheen verborgen neuronen zichtbaar, waardoor het risico op fout-negatieve resultaten bij studies naar target engagement wordt verminderd.
Integratie van pipeline en workflow
De bereiding van het larvale fillet-preparaat past binnen het ontdekkingscontinuüm, van het genereren van doelhypothesen via assay-ontwikkeling tot preklinische validatie, en maakt specifiek de visualisatie van sensorische neuronen in een bijna-natuurlijke epidermale context mogelijk.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing door neuronale morfologie bloot te leggen die in whole-mount preparaten verborgen blijft, wat de identificatie van targets en de verduidelijking van signaalpaden vergemakkelijkt.
- Screening: Levert assay-klaar monsters met een gestandaardiseerde blootstelling van de epidermale en neuronale structuren, waardoor de betrouwbaarheid van door verbindingen geïnduceerde fenotypische read-outs wordt verbeterd.
- Analytiek: Maakt kwantitatieve metingen mogelijk van dendritische vertakking, de integriteit van epidermale cellen en co-lokalisatiemeters die essentieel zijn voor het vergelijken van experimentele condities.
- Translationeel onderzoek: Handhaaft de weefselcontinuïteit van de ontdekkingsfase tot aan de preklinische fasen door het behoud van natuurlijke neuron-epidermale associaties die cruciaal zijn voor het modelleren van sensorische functies.
- Bedrijfsbrede herbruikbaarheid: Vestigt een herbruikbare dissectiecapaciteit voor neurowetenschappelijke projecten die hoge-resolutie imaging van perifere sensorische systemen vereisen.
Operationele en organisatorische impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in de validatie van targets door interferentie van spierweefsel bij neuronale beeldvorming te elimineren.
- Operationele waarde: Standardiseert de monstervoorbereiding via gedefinieerde stappen voor oriëntatie, stretching en pinnen, waardoor operator-afhankelijke variabiliteit wordt verminderd.
- Strategische waarde: Verbetert de efficiëntie van go/no-go-beslissingen door in een vroeg stadium van de discovery-pipeline duidelijkere structurele gegevens over neuronale targets te leveren.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van sensorische targets mogelijk op basis van gevalideerde morfologische toegankelijkheid en kleuringskwaliteit.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in microdissectie en larvale anatomie om specimens correct te oriënteren door tracheabuisjes en dentikelbanden als markers te gebruiken.
- Afhankelijk van instrumentatie, waaronder met silicone gecoate schaaltjes, koude zoutoplossing, fijne dissectieschaartjes en insectenspelden voor stabilisatie.
- Vereist standaardisatie tussen teams wat betreft dissectiespanning en pincettechniek om een consistente preservatie van de epidermis te waarborgen.
- Overwegingen voor aanpassing omvatten het wijzigen van de samenstelling van de zoutoplossing (bijv. calciumhoudend), afhankelijk van de larvale soort en het ontwikkelingsstadium, om weefselschade te minimaliseren.
- Praktische beperkingen omvatten het tijdintensieve karakter van handmatige dissectie en de noodzaak van waakzaamheid om scheuren van de epidermis tijdens het verwijderen van spieren te voorkomen.
Veelgestelde vragen over biofarmaceutica
Dissectie van Oenocytes tegen Adult Drosophila melanogaster
Gerelateerde video's
0 Bekeken
-Sonicatie vergemakkelijkt immunofluorescentiekleuring van Late-fase embryonale en larvale
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Visualisatie van het Axonal Projectiepatroon van Embryonische Motor Neuronen in Drosophila
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Visualisatie van larvale Segmentale zenuwen in 3 Rd Instar Drosophila Larvale Voorbereidingen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
In vivo visualisatie van synaptische blaasjes Binnen Drosophila larven Segmentale Axonen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Morfologische Analyse van de Drosophila Larvale Perifere sensorische neuron dendrieten en axonen het gebruik van genetische Mozaïeken
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Microelectrode-Mediated FM Dye Loading and Unloading in Drosophila Larvae Nerve Cells
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Intracellulaire opname, Sensory Velden bij, en het kweken geïdentificeerde neuronen in de Leech, Hirudo medicinalis
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Flat Mount beeldvorming van de huid van muizen en de toepassing ervan op de Analyse van Haarzakje Patterning en Sensorische Axon morfologie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Optical Monitoring van Living zenuwuiteinde Labeling in haarfollikel Lanceolate Endings van de
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 22 augustus 2026