Name: Single-molecule beeldvorming van de nucleaire transporten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: Leer enkelmolecuulmicroscopie voor het visualiseren van nucleair transport door kernporiecomplexen in HeLa-cellen. Deze methode onthult transportdynamica met nanometerresolutie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit project werd ondersteund door de Research Capacity Enhancement Grant (Bowling Green State University).

1. Voorbereiding van de cel-systeem voor single molecule experimenten <ol><li> Ten minste een week van te voren, een verse cultuur van HeLa cellijn starten vanuit een voorraad van ontdooien bij 37 ° C en de invoering van een 25 cm 2 cultuur kolf met 5 ml media, Incubeer de cellen bij 37 ° C binnen 5% CO 2 incubator voor 24 uur en splitsen minstens 3 keer om een ​​optimale conditie voor de cellen. Maar de cellen mogen niet worden gesplitst meer dan 20 keer te wijten aan neiging van hun groei aanzienlijk vertragen. HeLa cellen werden eerder genetisch gemanipuleerd om GFP (groen fluorescerend eiwit) gefuseerd aan het nucleaire envelop porie membraaneiwit POM 121 hebben. Het is noodzakelijk voor een precieze lokalisatie van de nucleaire envelop. </li><li> Een dag voor het experiment, moeten cellen bestemd voor een enkel molecuul experiment worden verspreid op een geautoclaveerd dekglas in een steriele petrischaal. Het dekglaasje moet worden opgeschort in DMEM (Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium, Grand Island, NY), aangevuld met 4,5 g / L glucose, 862 mg / L Glutamax-I, 15 mg / ml fenol rood, 100 U / ml penicilline, 100μg/mL streptomycine en 10% pasgeboren kalf serum. Het volume van een cultuur moet worden 1 ml per dekglas, gelijkmatig verspreid over het oppervlak. Deze petrischalen met de dekglaasjes worden dan geplaatst in de CO 2-incubator en gedurende 24 uur voorafgaand aan het experiment. Om een ​​cel cultuur geschikt zijn voor een enkel molecuul experiment de cel confluentie op de cover slip mag niet meer dan 70% om een ​​goede vrijheid voor wassen buffers en eiwitten van belang het ondergaan van de nucleaire vervoer aan te bieden. </li><li> Op de dag van het experiment werden flow-kamers gebouwd door het toevoegen van een deksel samen slip met twee lijnen van siliconenvet als afstandhouders. Het is essentieel om te zorgen dat de cellen niet uitdrogen tijdens de voorbereiding. We meestal de voorkeur aan hebben twee kamers gemaakt op een dekglas om twee verschillende omstandigheden het toelaten voor het experiment. De top dekglaasjes kleine reepjes van glas dekglas gesneden met een diamant mes op ongeveer 6mm2 werden ondersteboven geplaatst op een Kimwipe. Twee lijnen van siliconenvet werden fijn geplaatst langs hij randen van de dekglaasjes met een 10 ml plastic spuit die een pipettip stevig bevestigd met Parafilm om de grootte van het vet kraal controle had. </li><li> De HeLa-cel gecoate glijbaan was daarna druppelen gedroogd en gemonteerd met vet als lijm in een home-bewerkte aluminium frame - humeur, die diende om de dia in de microscoop monsterhouder te houden. </li><li> De top dekglaasjes met de twee lijnen van vet werden vervolgens opgepikt met een puntige pincet en dan omgekeerd op de cel-gecoate glijbaan, de vorming van een stromingskamer. Een relatief sterke gehechtheid werd gemaakt door te drukken voorzichtig over de ingevette randen van het dekglaasje. </li><li> Aangezien wij twee aparte kamers gemaakt op een cel-gecoate schuif is het essentieel om een ​​goede afdichting om kruisbesmetting te voorkomen. Voor dit doel een aantal lijnen van het siliconenvet werden toegepast in tussen de kamers van de top naar de bodem van de dia om het uit elkaar verzegelen. Verscheidene lijnen van vet waren ook op de buitenkant van de kamers. </li><li> DMEM medium werd vervolgens toegevoegd aan de stroom kamer om de cellen te voorkomen dat uitdroogt. Oplossing doorstroming werd bevorderd door een klein stukje filtreerpapier om de vloeistof te absorberen uit de uitgang kant van de stroom kamers. Met vaste hand, zou oplossing tegelijkertijd worden toegevoegd door micropipet aan een kant van de flow-kamer met een hand, en geabsorbeerd aan de andere kant door filtreerpapier. </li><li> Na de bouw, was de onderkant van de schuif gewassen met een natte wattenstaafje, twee keer met water en vervolgens tweemaal met 100% ethanol. </li><li> Zodra de slide is gemonteerd op de microscoop, de cellen gewassen met 2 X 25 uL import-buffer (20 mM Hepes, 110 mM KOAc, 5 mM NaOAc, 2 mM MgOAc, 1 mM EGTA, pH 7,3). De cellen vervolgens gepermeabiliseerde voor ~ 2 minuten met 2 X 25 pl 40 ug / ml digitonine in import buffer en gewassen opnieuw met 2 X 25 uL import-buffer (20 mM HEPES, 110 mM KOAc, 5 mM NaOAc, 2 mM MgOAc, 1 mM EGTA, pH 7,3) aangevuld met 1,5% polyvinylpyrrolidon (PVP; 360 kDa). Het kan nodig zijn om de permeabilisatie in een real time via de helder veld monitor. PVP is opgenomen in alle import bufferoplossingen na digitonine tot osmotische zwelling van kernen te voorkomen. De intacte kern, samen met een gecontroleerde cytoplasmatisch omgeving, zorgt voor een sterk vereenvoudigd transport-systeem dat ons in staat stelt te verhelderen de ingewikkelde nucleaire transport stap voor stap. Vorige ensemble en single-molecule experimenten die uitgevoerd in het systeem hebben grote inzichten in de nucleaire transport. </li></ol> 2. De voorbereiding van essentiële eiwitten voor nucleaire transport experiment <ol><li> Door middel van een conventionele bacteriële transformatie van de speciale stammen van E. coli (JM109) werden ontworpen om de genen die verantwoordelijk zijn voor de overexpressiede productie van de bovengenoemde eiwitten van belang en worden op voorraad gehouden bij -80 ° C. (Voor de NLS-2xGFP gebruikten we pTrcHisB vector door Invitrogen). Een entoog met bacterie of ~ 50 ul van bevroren voorraden van fluorescerende eiwitten tot expressie of lading E. Coli cellen worden overgebracht naar 5 ml LB medium met toevoeging van 5μL van ampicilline (U 1000) en aëroob gegroeid met schudden 's nachts bij 37 ° C bij 225 rpm. </li><li> Na 24 uur 500 pi van verzadigde cultuur wordt overgebracht in 500 ml LB media en geschud in de 37 ° C incubator voor 5-6 uur na de toevoeging van 250 pi IPTG (isopropyl _-D-1-thiogalactopyranoside) en geïncubeerd voor een ander 5-6 uur. Het is nodig omdat IPTG is een lactose metaboliet die triggers transcriptie van het lac operon, waar het lacZ-gen vervangen wordt door het gen van interesse en IPTG wordt vervolgens gebruikt om genexpressie te induceren. </li><li> De cultuur wordt vervolgens gesponnen in de koeling hoge snelheid centrifuge bij 12000 rpm gedurende 15 minuten en het supernatant wordt weggegooid. Cellen worden dan opnieuw gesuspendeerd in 40 ml CelLytic B (CelLytic B resulteert in een snelle en efficiënte winning van eiwitten die geschikt zijn voor affiniteit zuivering en analyse.) Het volume moet worden gebaseerd op 10 ml per 1 gram van een pellet. 28 ui van mercapto-ethanol wordt toegevoegd aan disulfidebindingen en 400 ul van phenylmethanesulphonyl fluoride te breken proteasen deactiveren vanaf het verteren van eiwitten van belang na cellysis. Een "protease cocktail" is ook toegevoegd (400 pi van 0,2 mg / ml pepstatine A. 400 pi van 0,2 mg / ml leupeptin, 400 pl van 2 mg / ml trypsine-remmer) om ervoor te zorgen dat de proteïne-extracten niet voor de analyse af te breken voor doelen van belang. Vervolgens hebben we 400 pi 1M imidazol toe te voegen, wordt gebruikt om de gemerkte eiwitten gebonden aan Ni-ionen aan het oppervlak van de parels in de chromatografie kolom en 1 mM van DNase I, gebruikt om ongewenste single-en double-stranded DNA af te breken in 5 phosphodinucleotide en oligonucleotide elueren fragmenten. </li><li> Roer het mengsel in het donker op ijs gedurende 30 minuten tot een voldoende tijd voor de reactie, spin staat op 10000 rpm gedurende 60 minuten in de koeling centrifuge. Oogst de supernatant en ter voorbereiding van chromatografie uitvoeren van de infusie met Ni-NTA (nikkel-nitrilotriazijnzuur Superflow door Qiagen) door het draaien in microfuge centrifugebuis bij max. snelheid voor 3 minuten en wassen met lysisbuffer, herhalen van spinnen en wassen tot het mengsel is uit de buurt van een blauwe tint. Roer het resulterende mengsel langzaam in een donkere container op ijs gedurende 60 minuten. </li><li> Voer de kolomchromatografie die door 12 fracties als volgt. De eerste fractie is een doorstroming van 10 ml supernatant gemengd met Ni-NTA in de vorige stap. De tweede is 10 ml lysis buffer (50 mM Na-fosfaat, 300 mM NaCl, 20 mM imidazool, pH 8,0), de derde 10 ml buffer (10 mM imidazool, 100 mM NaCl, pH 8,0), de vierde en de rest zijn 0,5 ml elutie buffer (250 mM imidazool, 100 mM NaCl, pH 8,0) </li><li> De voorbereiding van de SDS-PAGE polyacrylamide gel en bereiden onze monsters door het mengen van 4 pi van een fractie en een pi van 5x SB (300mm Tris 6.8, 25% BME, 10% SDS, 50% glycerol). Voor de standaard gebruikten we 100 kb DNA-ladder door Invitrogen. Voor het laden we onze samples 5 minuten gekookt. Na het laden we liepen de gel bij 120V gedurende 60 minuten. Dan gaan we gekleurd, ontkleurd en tenslotte gedroogd in een speciale gel droger gedurende 2 uur bij 80C. </li><li> Vervolgens hebben we bekeken de resultaten op de gel en zich de fracties die het beste resultaat opgeleverd. Afhankelijk van het eiwit van onze interesse, moeten de banden respectievelijk gelegen aan de grootte van een eiwit. Deze fractie moet worden geselecteerd voor verdere eiwitzuivering met MonoQ en Superdex 200 (Amersham Pharmacia). </li><li> Concentratie is uitgevoerd door het draaien van de meest geconcentreerde fracties in Nanosep filter met een poriegrootte van 10K bij 14 rpm gedurende 5 minuten, te wassen met elutiebuffer elke keer. Het is noodzakelijk om de uiteindelijke eiwitconcentratie gebruik maakt van de BSA-test voor een verdere eiwit labeling procedure te bepalen. </li><li> De intrinsieke groene fluorescentie van NLS-2xGFP kunnen niet worden gebruikt voor single molecule beeldvorming van nucleair transport als gevolg van de slechte foto-stabiliteit en overlapt spectrum met cel autofluorescentie. Zo hebben we het etiket de lading moleculen met een overmaat van een cysteïne-reactieve organische kleurstof (Alexa555 of Alexa 647 maleïmide van Molecular Probes) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur in 50 mM natriumfosfaat, 150 mM NaCl na te verminderen met TCEP tris (2 - carboxyethyl) gedurende 20 minuten. Reacties waren afgeschrikt met 2-mercaptoethanol, en het eiwit oplossingen werden gedialyseerd de vrije kleurstof te verwijderen. </li></ol> 3. Enkel molecuul microscopie <ol><li> Onze microscoop set bestaat uit een Olympus IX81 uitgerust met een 1.4 NA 100x olie-immersie objectief (UPLSAPO 100XO, Olympus), een 35 mW 633 nm He-Ne laser (Melles Griot), een kwik lamp met GFP-filter ingesteld, een op -chip vermenigvuldiging gain charge-coupled device camera (Cascade 128 +, Roper Scientific) en the Slidebook software pakket (Intelligent Imaging Innovations) voor data-acquisitie en-verwerking. Een optische chopper (Newport) werd gebruikt om een ​​on-off-stand van laser excitatie te genereren. GFP en Alexa647 fluorescentie werd opgewekt door een kwiklamp en 633 nm laser respectievelijk. De groene en rode fluorescentie-emissie werd verzameld door hetzelfde doel, gefilterd door een dichroïsche filter (Di01-R405/488/561/635-25x36, Semrock) en een emissie-filter (NF01-405/488/561/635-25X5. 0, Semrock) en afgebeeld door een identieke CCD camera. </li><li> In single molecule experimenten, we kunnen de fluorescentie fotobleken tijd van de single lading molecuul langer dan transport tijd. Voor het bepalen van het photobleaching tijd, zijn 0,1 nM lading moleculen uitgeplaat op een glazen afdekplaat slip en worden immobiel na 30 minuten, vanwege niet-specifieke absorptie. Vervolgens wordt het tijdsverloop van de fluorescentie gemeten. Afhankelijk van het eiwit van belang photobleach keer anders zal zijn gebaseerd op het aantal van cysteins in staat om te reageren met maleïmiden, daarom is de lichtintensiteit en de verlichting gebied moet worden aangepast om niet leiden tot een voorlopige photobleaching en te verzekeren dat de lading moleculen gelabeld met Alexa 647 weer te geven fluorescentie langer dan de ladingen interactie met NPC's. </li><li> Voor invoer experimenten in gepermeabiliseerde cellen, werden de lading en essentiële co-factoren transport bij elkaar opgeteld. Typische import lading reacties bevatte 1 mM GTP, 0,5 uM Importin-, 0,5 uM Importin-1, 2 uM Ran en 1 uM NTF2 voor vergemakkelijkt het transport en 0,1 nM van 10KDa Dextraan voor passieve transport .. Fluorescerende lading concentraties waren&gt; 100 nM in bulk experimenten, en ~ 100 uur voor single molecule assays. Bij deze concentraties, was&gt; 99% van de lading zal naar verwachting complexen met Importin en Importin vorm. Vervoer bedroeg gecontroleerd door epifluorescentie (al was het maar ten opzichte van de tarieven van belang waren) of confocale fluorescentie microscopie (als absolute cijfers waren gewenst). </li><li> Eerst wordt de positie van de nucleaire envelop werd bepaald door de wide-field epifluorescentie microscopie door het aantrekken van een HBO-kwiklamp met een set van GFP filters om een ​​beeld te krijgen van de NE te nemen. De pixel intensiteiten in een rij of kolom zijn ongeveer loodrecht op de NE geschikt waren met Gaussiaans vervagen. De piek posities van de Gaussian voor een bepaalde set van pixel intensiteiten werd beschouwd als de NE positie voor die rij en kolom. De piek posities van een reeks van dergelijke gaussianen werden vervolgens aansluiten bij een tweedegraads polynoom, waardoor het pad van de NE binnen de gehele afbeelding. </li><li> Zodra het NE is gelokaliseerd, is het essentieel om zich te ontdoen van alle autofluorescentie gebruik te maken van een 633 nm He-Ne laser tot deze volledig is photobleached, meestal meer dan 60 seconden is voldoende. </li><li> Monster moleculen moet vervolgens worden bewaard in een 1,5% oplossing van PVP en het mengsel toegevoegd om de stroom kamer in een volume van 25 L en dan gesleept door de kamer het toepassen van een pit van filtreerpapier. Een volslagen zorg moet worden genomen op de toevoeging van de import lading eiwitten om de gepermeabiliseerde cellen direct na de nucleaire envelop lokalisatie, omdat de focus kan gemakkelijk worden verstoord door een heftige beweging. </li><li> Zodra de lading moleculen worden toegevoegd, 633 nm He-Ne laser werd gebruikt om het transport van de trajecten doorgevoerd moleculen te verlichten. Een optische chopper (Newport) moeten worden betrokken bij ongeveer 5 Hz tot de photobleaching te wijten aan een hoge vermogensdichtheid van de laser, maar ook om een ​​nieuw deel van de niet-photobleached enkele moleculen aan de NE benadering te vermijden. Een serie video's van single molecule translocaties moeten worden genomen met een high-speed CCD-camera die kan oplopen tot 2500 Hz. </li></ol> 4. Representatieve resultaten Correct wordt uitgevoerd, ons protocol liet ons toe om een ​​reeks video's aantonen van de translocatie van een enkele lading moleculen interactie met de nucleaire porie complex in gepermeabiliseerde HeLa POM 121 cellen te verzamelen. (Fig 1). We stellen om beeld en volgen de voorbijgaande vervoer stappen van dextran moleculen door de NPC in digitonine-gepermeabiliseerde HeLa cellen die stabiel tot expressie GFP-POM121. Cellen werden geïncubeerd met lage concentraties van de gelabelde moleculen dextran. Het equatoriale vlak van de kern werd naar voren gebracht, met een duidelijk beeld van de groene ring van de GFP fluorescentie opgewekt door een 488-nm kwiklamp licht. Een lange-time blootstelling van GFP-NE stelt ons in staat om een ​​uitstekende signaal-ruisverhouding (SNR) ratio te verkrijgen te lokaliseren het midden vlak van de NE. Voorheen 10 kDa dextran moleculen werden gevonden om door het NE diffuse binnen ongeveer 2 ms met een ruimtelijke resolutie van ongeveer 20-40 nm door een detectie-frame rate van 500 of 1000 Hz. Zo'n tijdruimtelijke resolutie laat vangen van slechts een tot twee diffusie stappen van dextran moleculen door de NPC, die niet voldoende is om meer ruimtelijke informatie voor de passieve diffusie toe te lichten. Om meer kleine stapjes van dextran moleculen te vangen binnen het NPC met een betere spatiotemporal resolutie, hebben we twee belangrijke verbeteringen uitgevoerd: (i) om een ​​snellere detectie frame rate van 2500 Hz aan te passen aan meer fijne diffusie stappen vast te leggen, en (ii) naar een hoger verlichting optische dichtheid te gebruiken om meer fotonen te wekken van enkele moleculen te verkrijgen een hogere ruimtelijke resolutie. Deze verbeteringen stellen ons in staat om meerdere stappen van voorbijgaande verspreiding van alexa647-gelabeld dextran moleculen vast te leggen over de NE door een 633-nm laser licht aan instraling van 100 kW / cm 2 met een tijd-ruimtelijke resolutie van 12 nm en 400 ms. Zoals weergegeven in figuur 1, werden een reeks stilstaande beelden van typische transport gebeurtenissen van dextran moleculen opgenomen. Door het volgen van de ruimtelijke trajecten van individuele doorgevoerd dextran moleculen, werden de kleine stapjes van diffusie door de NE onderscheiden. Wij vonden dat er ongeveer 30% van interactie evenementen met de NE hebben erkend oorsprong en bestemming compartimenten. Onder hen, dextran moleculen verplaatsen van het cytoplasma naar de NE hebben twee bestemmingen: einde in de kern na diffunderen door het NE of terug te gaan naar het cytoplasma na interactie met de NE De vergelijkbare situaties zich voor de export evenementen: dextran moleculen vanuit de kern voer het cytoplasma of diffuse terug naar de kern na interactie met de NE. Een dergelijke afbeelding serie bevatten informatie over de ruimtelijke positie van de individuele moleculen met betrekking tot de NPC, evenals temporele informatie over de verblijftijd van de moleculen door de NPC. Door het analyseren van de trajecten van dextran moleculen rond het gebied van NE, kan de reistijd, de efficiëntie en de entree frequentie worden bepaald. Het transport tijd in ons werk kunnen worden geïdentificeerd als de import of de uitvoer tijd. Ze werden gedefinieerd als de gemiddelde tijd van dextran moleculen wonen binnen de NPC's die de invoer of uitvoer te ondergaan. De invoer of uitvoer efficiëntie werd gedefinieerd als het percentage van de volledige invoer of de uitvoer gebeurtenissen van de som van de volledige en mislukte evenementen. De invoer of uitvoer ingang frequentie verwijst het aantal moleculen interactie met de NE tijdens een tweede. <img src="/files/ftp_upload/2040/2040fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Geselecteerde video frames van typische transport gebeurtenissen van dextran moleculen door het NE. (A) Een cytoplasma-to-kern evenement. Een enkele dextran molecuul (rode stip), gestart vanuit het cytoplasma, interactie met de NE (groene pixel lijn), en eindigde in de kern. De trajecten van het evenement (blauwe lijnen en open punten) werden bepaald en gelegd met de NE (zwarte lijn). De groene en rode lijnen stellen 100 nm-afstand van het NO op het cytoplasma en de nucleaire kant. C, het cytoplasma. N, de kern. Schaalbalk: 2 mm. (B) Een cytoplasma-to-cytoplasma evenement. (C) A kern-to-kern evenement. (D) een kern-to-cytoplasma evenement.

<ol><li>Ma, J., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Snapshots+of+Three-Dimensional+Distribution+of+Transient+Interactions+in+Nuclear+Pore+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Snapshots of Three-Dimensional Distribution of Transient Interactions in Nuclear Pore Complex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Sarma, A., Goryaynov, A., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Imaging+of+the+Calcium-Regulated+Nuclear+Pore+Permeability%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Imaging of the Calcium-Regulated Nuclear Pore Permeability.</a> , Forthcoming Forthcoming.</li>
<li>Yang, W., Musser, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+single+molecules+transiting+through+nuclear+pore+complexes+using+narrow-field+epifluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Visualizing single molecules transiting through nuclear pore complexes using narrow-field epifluorescence microscopy.</a> Methods. 39, 316-328 (2006).</li>
<li>Yang, W., Gelles, J., Musser, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+single-molecule+translocation+through+nuclear+pore+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Imaging of single-molecule translocation through nuclear pore complexes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 12887-12892 (2004).</li>
</ol>

Zorg moet worden genomen om een ​​goede colocalization van NE en enkele moleculen te verzekeren tijdens het experiment. Het is ook belangrijk te zorgen voor een hoge signaal-ruisverhouding, vooral wanneer het signaal laag is als gevolg van slechte etikettering of fotobleken. Lokalisatie precisie wordt beperkt door de ruis (als gevolg van out-of-focus fluorescentie, CCD uitlezing lawaai, donkere huidige en andere factoren).

single-molecule beeldvorming van de nucleaire transporten

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

Het nut van single molecule fluorescentie microscopie aanpak is bewezen te zijn van een grote maken in het begrijpen van biologische reacties in het afgelopen decennium. Het onderzoek naar moleculaire interacties met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie diep in de cellen is gebleven uitdagend door de inherent zwakke signalen die voortvloeien uit de individuele moleculen. Recente werken van Yang et al.. aangetoond dat smalle veld epifluorescentie microscopie visualisatie van nucleocytoplasmic vervoer kan op de single molecule-niveau. Door de een-molecuul benadering, belangrijk kinetiek, zoals nucleaire transport tijd en efficiëntie, voor signaal-afhankelijke en onafhankelijke lading moleculen zijn verkregen. Hier hebben we beschreven een protocol voor de methodologische aanpak met een verbeterde spatiotemporele resolutie van 0,4 ms en 12 nm. De verbeterde resolutie konden we voorbijgaande actief transport en passieve diffusie gebeurtenissen vast te leggen door middel van de nucleaire porie complexen (NPC) in semi-intacte cellen. We verwachten dat deze methode te gebruiken in het ontrafelen van andere bindende en-handel gebeurtenissen binnen cellen.

Enkel molecuul microscopie Approach die nieuwe inzichten naar nucleaire transport.

Single-molecule beeldvorming van de nucleaire transporten

Het nut van methoden voor fluorescentiemicroscopie op enkelvoudige molecuulniveau is bewezen van grote waarde bij het begrijpen van biologische reacties over de ...

De kernenvelope van de cel bevat ongeveer 2000 nucleaire poriecomplexen die het transport mogelijk maken van wateroplosbare moleculen zoals RNA, ribosomen, bepaalde eiwitten, koolhydraten en signaalmoleculen. Door gelabelde vrachtmoleculen toe te voegen aan permeabele cellen, kan de beweging van individuele moleculen door de kernporie worden gevisualiseerd met fluorescentiemicroscopie. Time-lapse beelden zijn vereist om de lokalisatie en spatiotemporele kenmerken te bepalen, zoals transporttijd, import- en exportefficiëntie en de frequentie van binnenkomst. Hallo, ik ben Alex ov, promovendus van het laboratorium voor single molecule microscopie van de afdeling Biologie aan de Bowling Green State University.Ik ben Asha P Shema, masterstudent van het single molecule microscope lab. Ik ben Juma. Ik ben postdocfellow hier in het single molecule microscopic lab.Vandaag laten we u een procedure zien voor single molecule imaging van nucleair transport via de nucleaire poriecomplexen in HeLa-cellen. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de translocatie van diverse moleculen door het nucleaire poriecomplex te bestuderen. Laten we beginnen.Om de eiwitten voor het nucleaire transportexperiment voor te bereiden, worden conventioneel getransformeerde JM 1 0 9 E. coli die de genen tot expressie brengen die verantwoordelijk zijn voor de productie van de nucleaire vruchteiwitten gekweekt in LB-medium en geïnduceerd met IPTG. Zodra de cellen zich in de logfase bevinden met een optische dichtheid van 0,7 tot 0,8, wordt de cultuur 15 minuten gecentrifugeerd bij 6.000 ×g bij 4 °C, wordt het supernatant weggegooid en wordt het pellet gewogen. Resuspendeer vervolgens de cellen in 10 milliliter CelLytic B per gram om eiwit te extraheren dat geschikt is voor affiniteitszuivering en analyse.Voeg vervolgens de juiste hoeveelheid proteasecocktail toe aan de midsole DNA's één en bèta me capto ethanol. Roer het mengsel 30 minuten op ijs in het donker. Centrifugeer daarna 20 minuten bij 25.000 ×g bij 4 °C.Breng na het centrifugeren het supernatant over naar een nieuw flesje ter voorbereiding op de chromatografie. Doe 400 µL nikkel-NTA en aceton in vier microcentrifugebuisjes. Centrifugeer 3 minuten lang bij 16 000 ×g.Vier het supernascent weg. Voeg vervolgens 400 µL lysis-wasbuffer toe. Herhaal de voorgaande wasstappen drie keer na de laatste wasbeurt.Resuspendeer het nikkel-NTA in lysisbuffer en voeg alle vier de buisjes toe aan de fles met het celsupernatant. Roer het resulterende mengsel gedurende 60 minuten langzaam in een donere container op ijs terwijl het mengsel wordt geroerd. Bereid een ecno pack chromatografiekolom voor door deze in folie te wikkelen om fotobleking van fluorescerende eiwitten te voorkomen.Plaats daarnaast 12 opvangbuisjes in een rek onder de kolom. Zodra het mengsel 60 minuten heeft geroerd, wordt 10 milliliter van het SNA nikkel NTA-mengsel opgeladen en volledig doorgevoerd. Begin met het opvangen van fracties.Voeg vervolgens 10 milliliters lysis wash buffer toe. Laat dit volledig doorlopen. Voeg daarna 10 milliliters IZO buffer toe en laat dit doorlopen.Ga verder met het verzamelen van fracties. Laat vervolgens 0,5 milliliters elutiebuffer doorstromen en herhaal het doorstromen van de elutiebuffer totdat alle 12 fracties zijn verzameld. Om te bepalen welke fractie de hoogste proteïneconcentratie bevat, wordt 4 µL van elke fractie op een page-gel geladen en vervolgens met Coomassie gestraind.Combine volgens standaardprocedures de meest geconcentreerde fracties en voeg 500 µL toe aan een nano step Filter met een poriegrootte van 10 kDa dat vooraf is gespoeld met elutiebuffer. Concentreer het eiwit door vijf minuten te centrifugeren bij 16 000 ×g. Verwijder de buffer, roer de resterende eiwitfractie en voeg nog eens 500 µL toe aan de filtercentrifuge.Herhaal dit proces voor alle geselecteerde fracties. Vul vervolgens het uiteindelijke volume van het geconcentreerde eiwit aan tot ongeveer 50 µL met elutiebuffer. Terwijl u voorzichtig roert met een micropipet en het monster van het filteroppervlak verzamelt, voert u vervolgens een ionenuitwisselings- en een grootte-uitsluitingschromatografie uit om een zeer zuiver eiwit te verkrijgen, waarna de uiteindelijke eiwitconcentratie wordt bepaald.Label vervolgens de vrachtmoleculen met een overmaat aan een ondersteunende reactieve organische kleurstof, zoals Alexa 555 of Alexa 647. Dit wordt gedaan omdat de intrinsieke groene fluorescentie van GFP niet kan worden gebruikt voor single-molecule imaging van nucleair transport vanwege de slechte fotostabiliteit en het overlappende spectrum met de autofluorescentie van cellen. Het gelabelde eiwit moet worden verdeeld over meerdere fracties van 25 µL en één dag voor de experimenten worden bewaard bij -80 °C. Plaats een geautoclaveerd dekglas in een steriele Petri-schaal van 35 mm en pipetteer 9 mL DMEM hierop.Pipette vervolgens één milliliter van de celcultuur en breng dit gelijkmatig aan op het dekglas. De gebruikte cellen waren vooraf genetisch gemodificeerd om een GFP-gelabeld poriemembraaneiwit, POM 1 21, tot expressie te brengen. Plaats de schaaltjes gedurende 12 uur in de kooldioxide-incubator.Bereid op de dag van het experiment de stroomkamers voor. Haal vervolgens onze met cellen gecoate slide uit de incubator, droog de slide en monteer deze vervolgens met behulp van vacuümvetlijm. In een zelfgefabriceerd aluminium frame is het essentieel om ervoor te zorgen dat de cellen tijdens de voorbereiding niet uitdrogen.Breng met een plastic spuit van 10 milliliter twee lijnen silicon aan op beide zijden van een dekglas met behulp van een pincet. Pak het kleine, voorbereide dekglas met de twee aangebrachte lijnen silicon op, plaats dit omgekeerd op de met cellen gecoate objectglas en druk licht aan om de flowkamer te vormen. Indien er twee afzonderlijke kamers op één met cellen gecoat objectglas worden voorbereid, is het essentieel om een goede afdichting te garanderen om kruiscontaminatie te voorkomen.Breng vervolgens verschillende lijnen siliconenvet aan tussen de kamers, van de bovenkant tot de onderkant van het objectglas, om ze van elkaar af te dichten. Breng daarnaast verschillende lijnen vet aan op de buitenzijden van de kamers. Voeg DMEM toe aan de flowkamer om te voorkomen dat de cellen uitdrogen.Was vervolgens de onderkant van het objectglas twee keer met water en daarna twee keer met 100% ethanol met behulp van een wattenstaafje. Plaats het frame in de microscoop. Was twee keer met 25 µL transportbuffer door dit aan de flowkamer toe te voegen en weg te zuigen.Breng een klein stukje filterpapier aan op de uitgangszijde en permeabiliseer de cellen één keer gedurende ongeveer twee minuten met 25 µL digitonine; de permeabilisatie moet in real-time worden gemonitord met brightfield-microscopie. Was de cellen vervolgens met 25 µL transportbuffer, aangevuld met 1,5% polyvinylpyrrolidon of PVP om osmotische zwelling van de kernen te voorkomen. Zoek de gepermeabiliseerde cellen op onder de microscoop en identificeer een heldergroene fluorescerende ring.Focus vervolgens op de equator van de cel en leg een beeld vast voordat de fluorescente vrachtmoleculen worden toegevoegd. Elimineer eventuele autofluorescentie door het gebied van de kernenvelope te selecteren en te belichten met de 633 nanometer helium-neonlaser totdat deze volledig is gefotobleekt. Normaal gesproken is hiervoor meer dan twee minuten nodig.Voeg het gelabelde dextranmonster, verdund in transportbuffer met 1,5% PVP, in een volume van 25 µL toe aan de flowkamer en laat dit door de kamer vloeien door middel van een filterpapieren lont. Er moet voorzichtig worden gewerkt bij de toevoeging van de import-vrachteiwitten, de permeabele cellen, aangezien de focus gemakkelijk kan worden verstoord door elke krachtige beweging. Activeer de optische chopper op ongeveer vijf hertz om fotobleaching te voorkomen en om een nieuw deel niet-gebleekte enkelvoudige moleculen de kernenvelop te laten naderen.Zodra de monstermoleculen zijn toegevoegd, moet een reeks video's van translocatie van enkelvoudige moleculen worden opgenomen, zodat de translocatie door de nucleaire poriële complexen kan worden vastgelegd. Gebruik de 633 nanometer heliumneonlaser om de transporttrajecten van de translocerende moleculen te belichten, mits correct uitgevoerd. Dit protocol maakt het mogelijk om een reeks beelden te verzamelen die de translocatie van enkelvoudige vrachtmoleculen demonstreert die interageren met het nucleaire poriële complex.In perme, hij r pom 1 21 cellen. Door de ruimtelijke trajecten van individuele transiterende dextranmoleculen te volgen, kunnen de fijne stappen van diffusie door de kernenvelop worden onderscheiden. Een gebeurtenis van cytoplasma naar kern wordt hier getoond, waarbij een enkel dextranmolecuul, weergegeven als een rode stip, startte vanuit het cytoplasma, interacteerde met de kernenvelop, weergegeven als de groene pixellijn, en hier in de kern eindigde.Het dextranmolecuul begon in het cytoplasma, reageerde met de kernenvelope en keerde terug naar het cytoplasma. In dit voorbeeld begon het dextranmolecuul in de kern, reageerde met de kernenvelope en keerde terug naar de kern. En hier begon het dextranmolecuul in de kern, reageerde met de kernenvelope en eindigde in het cytoplasma.Door de ruimtelijke trajecten van individuele transing dextran-moleculen te volgen, kunnen de nauwkeurige stappen van diffusie door de kernenvelope worden onderscheiden. De trajecten van de gebeurtenis, weergegeven als blauwe lijnen en open stippen, zijn bepaald en over de kernenvelope, weergegeven als een zwarte lijn, geplaatst. De groene en rode lijnen representeren een afstand van 100 nanometer vanaf de kernenvelope aan de zijde van het cytoplasma en de kernzijde.We hebben zojuist aangetoond hoe de translocatie van enkelvoudige moleculen door het nucleaire poriecomplex kan worden gevisualiseerd met een resolutie van 10 nanometer bij 400 microseconden. Tijdens deze procedure is het belangrijk om rekening te houden met de noodzaak om een zo hoog mogelijke signaal-ruisverhouding te bereiken en uiterst voorzichtig te zijn bij het uitvoeren van het enkelvoudige moleculexperiment, omdat de focus gemakkelijk verstoord kan worden. Dat is alles.Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

single-molecule-imaging-of-nuclear-transport

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschrijven we de instrumenten en werkwijzen voor het detecteren enkele fluorescentie-gemerkt eiwitmoleculen interactie met een enkel DNA-molecuul opgehangen tussen twee optisch gevangen microsferen.

De combinatie van Single-molecule Manipulatie en Imaging voor de Studie van eiwit-DNA interacties

Beschrijven we een procedure voor de opsporing van chemische elementen aanwezig in situ in menselijke cellen, alsmede hun kwantificering in vitro . De methode is geschikt voor elk celtype en is vooral nuttig voor de kwantitatieve chemische analyses in afzonderlijke cellen na in vitro metaaloxide nanodeeltjes blootstelling.

In Situ Detectie en eencellige kwantificering van metaaloxide nanodeeltjes met behulp van nucleaire Microprobe analyse

Dit protocol beschrijft een methode om de nucleocytoplasmatische transportsnelheid binnen motor neuronachtige NSC-34 cellen nauwkeurig te meten door de real-time verandering in de nucleaire invoer van een NLS-NES-GFP eiwit te kwantificeren.

Assay voor het meten van nucleocytoplasmisch transport in realtime binnen motor neuronachtige NSC-34 cellen

Dit protocol wordt een nieuwe methode voor de kwantitatieve visualisatie van complexe vorming van SNARE-eiwitten, gebaseerd op Förster resonance energie-overdracht en levensduur van de fluorescentie microscopie imaging waardoor beschreven.

Visualiseren van intracellulaire SNARE mensenhandel door fluorescentie levensduur microscopie Imaging

Hier we illustreren hoe enkel molecuul foto-geactiveerde lokalisatie microscopie kan worden uitgevoerd op de motorische zenuw-terminal van een levende Drosophila melanogaster derde instar larve.

In Vivo Single-molecuul volgen bij de Terminal van de presynaptische motorische zenuw Drosophila

We beschrijven fluorescentiefotoactivatiemethoden om het axonale transport van neurofilamenten te analyseren in enkele gedeinlineerde axonen van perifere zenuwen van transgene muizen die een fotoactief neurofilament-eiwit uitdrukken.

Beeldvorming en analyse van neurofilament transport in accijnzen muis tibial zenuw

De huidige methoden beschrijven een niet-ratiometrische benadering voor hoge resolutie, sub-compartimentale calciumbeeldvorming in vivo in Caenorhabditis elegans met behulp van direct beschikbare genetisch gecodeerde calciumindicatoren.

Subcellulaire beeldvorming van neuronale calciumbehandeling in vivo

Dit protocol beschrijft hoe geautomatiseerde analyses van live celbeeldvormingsgegevens die zijn verkregen door het nucleocytoplasmatisch transport via optogenetische hulpmiddelen efficiënt kunnen worden opgezet en uitgevoerd.

LEXY en LINuS optogenetica-tools en geautomatiseerde beeldanalyse gebruiken om de nucleocytoplasmatische transportdynamiek in levende cellen te kwantificeren

Dit protocol biedt een efficiënte workflow voor single-molecule localisatie microscopiebeeldvorming van geïsoleerde Arabidopsis-kernen, waarbij geoptimaliseerde isolatie, fixatie en labeling wordt gebruikt om betrouwbare nanoschaalvisualisatie van chromatine en RNA Polymerase II te bereiken. Deze benadering kan gemakkelijk worden aangepast aan andere chromatine-geassocieerde eiwitten of histonmodificaties voor beeldvorming met hoge resolutie.

Een gestroomlijnd protocol voor single-molecule localisatiemicroscopie in Arabidopsis-kernen

Membraaneiwit functie wordt geregeld door de celmembraan lipide samenstelling. Deze video-artikel wordt beschreven hoe u een patch met bilaag pleister elektroden, evenals het gebruik van gramicidine kanalen als verslaggevers van veranderde membraan eigenschappen te vormen.

Single Molecule methoden voor monitoring van veranderingen in bilaag elastische eigenschappen

Leer enkelmolecuulmicroscopie voor het visualiseren van nucleair transport door kernporiecomplexen in HeLa-cellen. Deze methode onthult transportdynamica met nanometerresolutie.

Single-molecule beeldvorming van de nucleaire transporten

Meer video's verkennen