Een dunne-schedel Window Techniek voor chronische Twee-foton In vivo Imaging Murine Microglia in modellen van ontstekingsprocessen

Bij volwassen patiënten die geïnfecteerd zijn met hiv interfereert neuro-inflammatie met de normale synaptische signalering, wat leidt tot neurocognitieve tekortkomingen, waaronder problemen met abstractie, verbale vloeiendheid, aandacht, leren van nieuwe informatie en het geheugen. HIV-1 Tat induceert de secretie van inflammatoire moleculen, die de synaptische dysfunctie kunnen nabootsen die bij hiv-patiënten wordt waargenomen. In dit experiment worden volwassen muizen gebruikt die GFP tot expressie brengen in mononucleaire cellen, waaronder microglia, om HIV-1 Tat-geïnduceerde neuro-inflammatie te onderzoeken met behulp van dunne-schedel tweefotonmicroscopie.

De reacties van microglia na injectie van tat kunnen in vivo worden in beeld gebracht. De resulterende beelden tonen een verkorting en verdikking van microgliaprocessen en de vorming van fagocytose-cupachtige structuren, evenals de migratie van perifere monocyten in cerebrale microvaten. Hallo, ik ben Dan Marker van het laboratorium van Harris Galbard en het Center for Neural Development and Disease aan de University of Rochester.

Hallo, ik ben EF Trombley van het Laboratory of Esca in de Department of Neurobiology and Anatomy aan de University of Rochester. Hallo, ik ben Shain Luu, ook van het Albas Lab. Vandaag laten we u een procedure zien voor tweefoton-imaging met gebruik van een dunne schedelpreparaat.

We gebruiken deze procedure om chronische neuro-inflammatie te bestuderen. Laten we beginnen met het hier getoonde experiment, waarbij muizen worden gebruikt die GFP tot expressie brengen in mononucleaire cellijnen, waaronder microglia.

Verschillende muizenstammen kunnen worden gebruikt om aan de behoeften van een specifiek project te voldoen. Begin met het voorbereiden van een met fentanyl en midazolam geanestheseerde muis voor de chirurgische ingreep. Controleer eerst of het dier niet langer reageert op pijnlijke prikkels, zoals het knijpen in de staart.

Plaats het dier op een warmtemat om hypothermie na de anesthesie te voorkomen. Breng vervolgens een beschermende oogzalf aan op de ogen van het dier om deze vochtig te houden. Alle chirurgische instrumenten moeten zijn geautoclaveerd of zijn gesteriliseerd met een glaskraalsterilisator; desinfecteer de instrumenten verder door ze in 70% ethanol te weken.

Verwijder met een schaar het haar van de hoofdhuid van het dier en desinfecteer het gebied vervolgens met een 10% povidonjodiumoplossing en 70% ethanol. Begin de operatie door met een klein schaartje een midline incisie in de hoofdhuid te maken, beginnend vier tot vijf millimeter craniaal ten opzichte van de schedel en voortschrijdend naar de voorkant van de ogen. Deze incisie moet lang genoeg zijn zodat de huid het vastlijmen van de plaat, die de muizenkop stabiliseert tijdens tweefoton-imaging, niet belemmert.

Breng vervolgens 100% ethanol aan met een steriel wattenstaafje om de membranen bovenop de schedel te drogen. Schraap deze weg met een fijne pincet. Als de membranen niet worden verwijderd, zal de bevestiging van de hoofdplaat onstabiel zijn.

Identificeer onder een dissectiescoop het gebied datten gedund moet worden. Vermijd gebieden van belang die zich direct boven schedelnaden bevinden, aangezien de schedel in deze zones minder stabiel is en onderliggende grote vaten en hersenvliezen de beeldvorming naar het kijkvenster op het betreffende gebied zullen verstoren. Behandel de schedel vervolgens opnieuw met een wattenstaafje met behulp van een 10% oplossing van ijzer(III)chloride.

Breng een dunne laag perma bond, nine 10 lijm aan rond de randen van het kijkvenster onder de kopplaat. Plaats vervolgens de plaat met lichte druk over het interessegebied op de schedel van het dier om de lijm te laten hechten. Breng met een spuit een kleine hoeveelheid acryl aan rond de rand van het kijkvenster.

Breng tot slot een kleine hoeveelheid Tite 4 54 aan op de randen van het kijkvenster om lekken te voorkomen. Schroef de kopplaat vast aan de dierenhouder en controleer de stabiliteit onder een dissectiemicroscoop. Door voorzichtig met een pincet te testen, mag er geen beweging van de schedel ten opzichte van de kopplaat waarneembaar zijn.

Plaats een druppel zoutoplossing op het kijkvenster om te controleren of er geen lekken zijn ter voorbereiding op het uitdunnen. Droog de schedel met een combinatie van steriele wattenstaafjes en perslucht. Dun de schedel uit met een IRF 0 0 7 boorbit in een micro-boormachine.

Bij 4 000 RPM. Begin zeer voorzichtig met het dunner maken van een cirkelvormig gebied met een diameter van 2 tot 2,5 millimeter. Gebruik uitsluitend lichte vegende bewegingen die nagenoeg parallel aan de schedel verlopen.

Oefen geen directe neerwaartse druk uit. Stop elke 20 tot 30 seconden met boren om botstof te verwijderen met behulp van perslucht. Deze onderbrekingen tijdens het boren zorgen ervoor dat de schedel kan afkoelen, zodat er geen hitte-geïnduceerde schade aan het onderliggende hersenweefsel optreedt.

Terwijl het boren vordert, let op de overgang naar de vochtigere stekelige botlaag, die de Diplo wordt genoemd. Zodra deze laag is bereikt, dient er extra voorzichtigheid met de boor te worden betracht. Controleer af en toe de dikte van de schedel door zoutoplossing over het dunne gebied aan te brengen en dit onder de dissectiescoop te bekijken.

Zoutoplossing zal de warmteafvoer verder vergemakkelijken. Naarmate de schedel dunner wordt, worden kleinere bloedvaten zichtbaar. Gebruik een dentaal microblad om de uiteindelijke verdunning onder zoutoplossing te voltooien.

Het microblad geeft veel meer tactiele feedback over de stabiliteit van de schedel. Dit maakt veel dunnere preparaten mogelijk dan met alleen de boor. De optimale schedeldikte voor beeldvorming is 10 tot 30 micrometers.

Het gehele verdunningsproces duurt normaal gesproken tussen de 15 en 30 minuten. Controleer tijdens het maken van een dun schedelvenster meerdere malen de dikte van de schedel onder epifluorescentie. De scherpte en diepte van de zichtbare microglia en vasculatuur geven een goede indicatie wanneer het venster klaar is voor beeldvorming.

Zodra het venster gereed is, gebruikt u een glazen pipet met een diameter van 1 mm om een kleine druppel Cy-acryllijm op het dunne gedeelte van de schedel aan te brengen en plaatst u voorzichtig een stukje dekglas daarop. Druk vervolgens zachtjes tegen de schedel om overtollige lijm weg te persen, waarbij u belvorming tussen de schedel en het dekglas voorkomt, aangezien dit het zicht kan belemmeren. Gebruik na het drogen een microblade om voorzichtig alle lijmresten bovenop het dekglas te verwijderen ter voorbereiding op tweefoton-beeldvorming.

Bedek het dunne corticale schedervenster met zoutoplossing en lokaliseer het interessegebied onder epifluorescentie. Om daaropvolgende beeldvorming van het gebied mogelijk te maken, wordt een foto gemaakt met een fotocamera voor beeldvorming. Hier wordt een op maat gemaakte tweefotonmicroscoop gebruikt met een Ti:saffierlaser afgestemd op 920 nanometer.

Fluorescentie wordt gedetecteerd met gebruik van een fotomultiplicatorbuis of PMT in whole field detectiemodus en een 5 81 80 emissiefilter. Gedurende de gehele beeldsessie wordt een 20 x waterimmersielens gebruikt. Stel het maximale laservermogen van het objectief in op een waarde tussen 50 en 65 milliwatts.

Select vervolgens een gebied van interesse in corticale laag één of twee tot 150 µm onder het oppervlak van de schil. Om herhaalde beeldvorming te vergemakkelijken, worden er foto's van hetzelfde gezichtsveld gemaakt bij een digitale zoom van 1x, 2x en 3x. Bloedvaten kunnen dienen als oriëntatiepunten om hetzelfde gezichtsveld tijdens volgende beeldvormingssessies eenvoudig terug te vinden.

Neem bij een vergroting van drie x meerdere Zacks op met elk 80 tot 90 Z-stappen en een stap van 0,69 micrometer elke vijf minuten gedurende maximaal 30 minuten. Dit maakt een goede bemonstering van de microgliamorfologie en het gedrag over tijd mogelijk tussen de acquisities van Zacks; controleer het niveau van de zoutoplossing en de diepte van de anesthesie. Indien nodig kan tijdens de procedure een boosterdosis van een derde van de oorspronkelijke dosis van het anesthesiecocktail worden toegediend om depositie op de spuit en naald tijdens de injectie dagen voor de injectie te voorkomen.

Silaniseer de binnenwand van een naald met maat 35 gauge en een microvolumespuit van 10 µL door de silaniseringsoplossing op te zuigen totdat zowel de naald als de spuit gevuld zijn. Laat de oplossing vijf minuten bij kamertemperatuur inwerken, giet vervolgens de oplossing uit de spuit, verwijder de zuiger en laat de spuit en naald volledig drogen. Was tot slot de spuit en naald grondig met gedeïoniseerd water.

Zodra gesilozeerd, kunnen een spuit en naald gedurende meer dan zes maanden worden gebruikt voordat een nieuwe codering noodzakelijk is. Plaats op de dag van injectie een kleine druppel van de TAT-oplossing op een gesilozeerde glazen objectglas. Gebruik een gesiliconiseerde pipetpunt om de gewenste hoeveelheid oplossing vanuit deze druppel in de microvolumespuit te laden.

Maak met een boortje een kleine craniotomie van 0,5 millimeter diameter, drie millimeter rostraal of lateraal ten opzichte van het dunne corticale schedervenster waar de tweefotonbeelden zijn verkregen. Om dit te bereiken, wordt de schedel voorzichtig dun gemaakt. Gebruik vervolgens een scherp pincet om de dunne botlaag te verwijderen.

Gebruik een micromanipulator om de naald (maat 35 gauge) en de spuit uit te lijnen met de craniotomie. Breng de naald vervolgens voorzichtig naar een diepte van 700 tot 900 micrometers onder het oppervlak van de peel. Dien drie microliters toe bij 80 nanoliters per minuut met behulp van een door een microprocessor gestuurde spuitpomp.

Deze figuur toont met GFP gelabelde microglia gevisualiseerd met tweefoton-imaging na implantatie van het dunne schedel corticale venster, ongeveer 50 micrometers onder het peelingoppervlak. De enkele tweefoton-secties genomen op dag nul, 15 tot 30 minuten na implantatie van het dunne schedel corticale venster, evenals die genomen zeven en 17 dagen later, tonen aan dat de vensters helder blijven terwijl microglia geactiveerd blijven in afwezigheid van inflammatoire stimuli. Dit benadrukt het nut van deze methode voor het onderzoeken van zowel normale als inflammatoire interacties tussen immuun-effectorcellen en andere neurale celtypen.

In vivo vertonen de Z-projecties die zes en 24 uur na injectie van het HIV-neurotoxine TAT zijn genomen, duidelijke morfologische veranderingen van geactiveerde microglia. Dit demonstreert verder ons vermogen om morfologische veranderingen van microglia in real-time te bestuderen in acute en chronische modellen van neuroinflammatie. We hebben zojuist aangetoond hoe u een dun schedervenster kunt prepareren en gebruiken om neuroinflammatie te bestuderen tijdens deze procedure.

Het is belangrijk om te onthouden dat u de tijd moet nemen bij het behandelen van de schedel om schade door de preparatie zelf te voorkomen. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.