Visualiseren Cel-cel Overdracht van hiv met behulp van TL-Klonen van HIV en Live confocale microscopie

Deze procedure maakt gebruik van live-cell imaging om de overdracht van GFP-gelabeld HIV via virologische synapsen tussen HIV-exprimerende jerk CAT T-cellen en niet-geïnfecteerde primaire T-cellen te visualiseren. De cel-naar-cel overdrachtsassay begint met het transfecteren van jerk CAT T-cellen met HIV gag IG FP, een infectieuze fluorescentie-kloon van HIV-1, waardoor de getransfecteerde jerk kat-cellen HIV gag IG FP exprimeren. Deze worden vervolgens gemengd met CMTMRed-gelabelde niet-geïnfecteerde primaire T-cellen en in een imagingkamer geladen, waar de overdracht van GFP-gelabeld HIV via de virologische synaps kan worden waargenomen.

De resulterende gegevens worden geanalyseerd met beeldanalyse-software om de details van de HIV-overdracht via virologische synapsen van T-cellen te onthullen. Hallo, mijn naam is Benjamin Dale van het laboratorium van Ben Chen van de afdeling Geneeskunde aan de Mount Sinai School of Medicine. Mijn naam is Greg McNerney van het laboratorium van Dr. Thomas Huser bij het NSF Center for Biophotonics aan het UC Davis Medical Center.

En ik ben Deanna Thompson, ook uit het laboratorium van Dr. Thomas Huser. Vandaag laten we u een procedure zien voor het visualiseren van de cel-naar-cel overdracht van HIV-1 met behulp van live confocale microscopie. In deze procedure worden Jurkat-cellen getransfecteerd met een infectieuze moleculaire kloon van HIV-1; alleen getraind laboratoriumpersoneel dat werkt in gecertificeerde biosafety-faciliteiten.

De hier getoonde protocol kan worden uitgevoerd in weefkulturruimtes van biosafety level 2+ of biosafety level 3. Werken met infectieus HIV in beeldvormingsfaciliteiten moet zijn goedgekeurd door de lokale institutionele biosafety-afdeling. Houd de jerk cat-cellen die als donorgecellen worden gebruikt op een concentratie tussen 2 × 10⁵ en 8 × 10⁵ cellen per milliliter.

In JERK cat-culturen leidt een celconcentratie in het medium van meer dan 8 × 10⁵ cellen per milliliter tot een afname van de transfectie-efficiëntie. Om de procedure te starten, transfecteert u 5 × 10⁶ JERK cat-cellen met het virale plasmide HIV gag IGFP met behulp van de Amaxa Nucleofector-methode zoals beschreven in het bijbehorende schriftelijke protocol; laat de cellen vervolgens gedurende de nacht herstellen. Perifere bloedmononucleaire cellen worden gezuiverd uit buffy coats van volbloed van mensen via FICO-dichtheidsgradiëntcentrifugatie.

De primaire CD4-positieve T-cellen worden gezuiverd uit de mononucleaire cellen van perifeer bloed via negatieve selectie met behulp van een CD4-positieve T-cel isolatiekit. De negatief geselecteerde CD4-positieve T-cellen worden verzameld uit een magnetische kolom en gekweekt in ons PMI met 10% FPS, aangevuld met 10 units per milliliter recombinant humaan IL-2. Men kan de geïsoleerde primaire CD4-positieve T-cellen ook aliquoteren en invriezen met behulp van cryogene vriescontainers. De vriescontainers worden gedurende minimaal drie tot vier uur geplaatst in een vriezer van -70 °C.

De cellen worden vervolgens overgebracht naar vloeibare stikstof voor langdurige bewaring. Nu de Jurkat-cellen zijn getransfecteerd en de doelwit primaire CD4-positieve T-cellen zijn geïsoleerd, kan men op de dag na de transfectie overgaan tot het reinigen en labelen van de cellen. De Jurkat-cellen brengen nu het infectieuze fluorescente HIV-construct uit.

Bij het werken met infectieuze monsters dragen we een laboratoriumjas die aan de voorzijde sluit en twee paar handschoenen. Verwijder het cellulaire debris van de getransfecteerde cellen door centrifugatie over een medium met een hoge dichtheid (Ficoll). Dispenseer eerst 1,5 milliliter Ficoll op de bodem van een conische buis van 15 milliliter.

Bedek vervolgens het gradiëntmateriaal voorzichtig met de getransfecteerde jerk hat-cellen in een volume van 5 mL van ons PMI-medium. Op dit punt zijn de getransfecteerde jerk hat-cellen in staat om infectieus HIV te produceren. Daarom moeten alle pipetpunten die in contact komen met de HIV-expresserende cellen worden gedesinfecteerd met een 10% bleekoplossing.

Voordat u de buis in een container in de biosafety cabinet weggooit, sluit u de buis af met een dop, sprayt u de buitenkant van de buis met een 70% ethanol-oplossing en veegt u deze af met een droge Kimwipe. Centrifugeer de cellen 20 minuten bij 400 Gs op kamertemperatuur met de rem uitgeschakeld. Verwijder na centrifugatie voorzichtig de cellen van de interface tussen het medium en de pellet met een pipet en breng de cellen over naar een nieuwe conische buis van 15 milliliter. Verdun de cellen met ons PMI-medium tot een totaalvolume van 15 milliliter en centrifugeer 10 minuten bij 300 GS.

Bij kamertemperatuur suspenderen we het pellet in drie milliliter jerk hat cultuurmedium en brengen we dit over naar een put van twee centimeter van een zes-putsplaat. Plaats de plaat in de weefselkweekincubator tot gebruik op de volgende dag. Label in de avond van dezelfde dag de primaire CD4-positieve T-cellen die als doelcellen worden gebruikt, om ze te kunnen onderscheiden van de donorcellen. Pellet eerst 4 × 10⁶ van de primaire CD4-positieve T-cellen door deze 10 minuten te centrifugeren bij 400 Gs.

Was vervolgens de cellen met vijf milliliters PBS en resuspendeer ze in twee milliliters PBS. Voeg cell tracker orange toe tot een uiteindelijke concentratie van 1,5 micromolar en incubeer gedurende minuten bij 37 graden Celsius. Wanneer de incubatie van de cellen is voltooid, voeg dan acht milliliters compleet chica-medium toe en centrifugeer bij 400 Gs gedurende 10 minuten.

Resuspendeer de cellen in drie milliliter compleet medium aangevuld met 10 units per milliliter IL 2 en plaats deze gedurende de nacht in de weefselkweekincubator. Na de incubatie gedurende de nacht zijn de donor- en doelcellen gereed voor het cel-naar-cel-transferexperiment. Bereid, voorafgaand aan het opzetten van het cel-naar-cel-transferexperiment, de beeldvormingskamer voor om het platform te bufferen tegen temperatuurschommelingen in de ruimte.

Om het omgevingslicht van de kamer buiten te sluiten, wordt een groot zwart scherm over de gehele opstelling van de microscoopverwarming gedrapeerd, waardoor een geïsoleerde luchtlaag rond het systeem ontstaat. De beeldkamer wordt op een stabiele 37 °C gehouden met behulp van een thermostatische verwarming met een T-type thermokoppelpunt dat naast het monster is geplaatst voor temperatuurfeedback. Voorverwarm het systeem 30 minuten voordat het monster wordt gemonteerd.

Spinning-disc confocale beeldvorming met een omgekeerde optische microscoop wordt gebruikt om 3D-confocale beelden te maken van de cel-naar-cel overdracht van HIV. Alle hardware en acquisitie, inclusief een Z-traverse, worden aangestuurd door de IQ versie 1.8 software. Het scannen wordt uitgevoerd door een CS U 10 spinning-disc confocale unit die gelijktijdig meer dan 800 confocale spots gebruikt om de scansnelheid drastisch te verhogen. De CS U 10 is gekoppeld aan een zeer gevoelige electron-multiplying charge-coupled device camera om snelle beeldvorming bij weinig licht mogelijk te maken, waardoor zowel fotobleken als fototoxiciteit worden verminderd.

De fluorescentielichtbron is een argon-krypton iongaslaser met meerdere golflengten. Een AOTF (acousto-optic tunable filter) wordt gebruikt om de gewenste golflengten te selecteren, in dit geval 488 nanometer en 568 nanometer, terwijl de vermogenssterkte wordt geregeld om fotobleking verder te beperken en de beeldvormingstijd te verlengen. De AOTF sluit de laser snel af na elke belichting van 15 tot 30 milliseconden wanneer de camera geen beelden vastlegt, waardoor onnodige blootstelling wordt voorkomen terwijl de beelden van de EMCCD-camera naar de computer worden overgedragen.

Het laserlicht wordt in het spinning disc-systeem geïntegreerd met behulp van een 405/488/561/647 quad-band dichroïsche spiegel; de fluorescentie-emissie wordt op basis van golflengte gescheiden met een 560 nanometer long-pass dichroïsche spiegel met een image splitter. Het groene kanaal wordt gefilterd met een 525/50 nanometer band-pass filter en het rode kanaal wordt gefilterd met een 609/54 nanometer band-pass filter. De twee kanalen worden naast elkaar geprojecteerd op de E-M-C-C-D-camera.

Terwijl de beeldkamer opwarmt, bereidt u de cellen voor voor het experiment voor cel-naar-cel overdracht. Gebruik een hemocytometer om de HIV gag IGFP-expresserende ette-cellen te tellen. Plaats de hemocytometer in een Petrischaal om directe blootstelling aan de virus-expresserende cellen te voorkomen.

Was de cellen met CO₂-onafhankelijk medium en resuspendeer ze in medium voor live-cell imaging met een concentratie van 1 tot 3 × 10⁷ cellen per milliliter. Het gebruik van CO₂-onafhankelijk medium elimineert de noodzaak voor een CO₂-omgevingskamer voor imaging.

Tel de cellen, was ze en resuspendeer de gelabelde primaire CD4-positieve T-cellen zoals zojuist getoond voor de Jurkat-cellen. Begin vervolgens met de cel-naar-celtransfer: meng 20 µL HIV gag IGFP-getransfecteerde Jurkat-cellen met 40 µL gelabelde primaire CD4-positieve T-cellen en breng 50 µL over in een gasdoorlatende EBD-microkamer die is behandeld voor weefselkweek. Sluit de kamer af met pluggen en zet de pluggen vast door de interface tussen de plug en de EBD-kamer te omwikkelen met Parafilm.

Veeg de beeldvormingskamer schoon met een chemisch doekje gedrenkt in 70% ethanol en laat deze kort aan de lucht drogen in de zuurkast. Transporteer de verzegelde beeldvormingskamer in een afgesloten container om accidentele blootstelling te voorkomen. Mocht de kamer tijdens het transport vallen, doe dit dan onmiddellijk nadat de IBD-beeldvormingskamer met cellen is geladen, en monteer het apparaat op de microscoop.

Maak beelden van celparen met een 60 x 1,42 NA olie-immersieobjectief, aangezien de hoge numerieke apertuur de resolutie aanzienlijk verbetert om de acquisitiesnelheid per 3D-beeldstack te maximaliseren. Kader het opnamegebied van de EM CD-camera in op het onmiddellijke gebied van een celpaar. Daarnaast kan een grote Z-stap tussen 0,45 en 0,75 micrometers onder deze omstandigheden ook helpen de acquisitie te versnellen.

Beelden worden continu opgenomen met intervallen van 20 tot 60 minuten. Herhaalde beeldvorming van dezelfde monsterplek kan tot zes uur duren met minimale fotobleking tijdens de acquisitie. Elk datasegment bestaat uit tienduizenden beelden die in totaal vijf tot 20 gigabyte in beslag kunnen nemen.

Om het transport en de analyse van de grote bestanden te vergemakkelijken, wordt elk bestand onderverdeeld en geëxporteerd als TIFF-afbeeltsegmenten van één gigabyte. Gebruik voor de analyse van de verkregen beelden een van de diverse beschikbare softwareprogramma's voor beeldanalyse. Raadpleeg het bijbehorende schriftelijke protocol voor details over de beeldanalyse, inclusief correctie voor intensiteitsbleking en automatische en handmatige tracking van gag-puncta.

Binnen 10 tot 15 minuten na het mengen kan men visualiseren hoe jerk cat-cellen die HIV gag IGFP tot expressie brengen, hechten aan primaire CD4-positieve T-cellen via imaging. Met deze conjugaten kan men de bewegingen van gag-puncta in geïnfecteerde cellen alsmede in doelcellen beoordelen. Na synapsvorming, binnen 30 minuten tot drie uur, kan men de beweging van gag IGFP-puncta waarnemen naar doelcellen die gelabeld zijn met cell tracker.

We hebben zojuist laten zien hoe de cel-naar-cel overdracht van HIV tussen T-cellen kan worden gevisualiseerd. Bij het uitvoeren van deze procedures is het zeer belangrijk om alle voorzorgsmaatregelen voor biosafety level two plus of biosafety level three in acht te nemen bij het hanteren van monsters die zijn blootgesteld aan HIV-expresserende cellen. Denk er daarnaast aan om goed onderhouden JCA-cellen en endotoxinevrij DNA te gebruiken om de transfectie te optimaliseren.

Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.