Name: Visualiseren Cel-cel Overdracht van hiv met behulp van TL-Klonen van HIV en Live confocale microscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 8 s
Description: Leer cel-cel overdracht van HIV visualiseren met behulp van fluorescente moleculaire klonen en live confocale microscopie. Deze methode maakt real-time observatie van virologische synapsen tussen T-cellen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze recensie werd ondersteund door National Institutes of Health subsidies, AI074420-02, Burroughs Wellcome Investigator Award, Hirschl Career Scientist Awards voor BKC en door de NSF Center for Biofotonica Wetenschap en Technologie, Coöperatieve overeenkomst PHY012099, en een UCD Health System Research Award voor TH UCD CTSC NCRR ULRR024146.

Deze methode werd gebruikt in het onderzoek gerapporteerd in <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/323/5922/1743">Hübner et al., Science 323:. 1743-1747 (2009)</a> . 1. Overzicht Cel-cel verspreiding van HIV werd oorspronkelijk beschreven met behulp van HIV-geïnfecteerde cellen Jurkat als donor cellen en primaire CD4 + T-lymfocyten als acceptor cellen 1,2,3. In deze studies werd het virus aangetroffen in vaste cellen met behulp van antilichaam kleuring. Om spoor van de overdracht van het virus van cel naar cel in levende cellen, maken we gebruik van een recombinant, besmettelijke moleculaire kloon van HIV genaamd HIV Gag-iGFP 4. Het draagt ​​het groen fluorescerend eiwit (GFP) intern ingebracht in de Gag eiwit tussen de MA en CA-domeinen. Deze moleculaire kloon van HIV behoudt besmettelijkheid, zonder de noodzaak voor helper virus. Virusdeeltjes gemaakt van deze kloon zijn stoichiometrisch geladen met groen fluorescerend eiwit, die een sterke fluorescentie signaal naar virale montage en overdracht tussen cellen te controleren. Bij gebruik in combinatie met inert cell-tracking fluorescerende kleurstoffen, ontvangende cellen onderscheiden kunnen worden van input donor cellen, en waardoor een op de overdracht van hiv van een geïnfecteerde T-cel aan een niet-geïnfecteerde T-cel 5 visualiseren. Virologische synapsvorming en overdracht van het virus van de ene cel naar de andere kan dan worden waargenomen in levende cellen terwijl ze worden gekweekt in een gesloten, gas-doorlatende imaging kamer. (Dag 1) 2. Voorbereiding van HIV Gag-iGFP Getransfecteerde Jurkat T-cellen <ol><li> Bereid de menselijke CD4 + T-cellijn Jurkat (ATCC, Manassas, VA) door zorgvuldig onderhoud van de cellen bij een concentratie tussen de 2 x 10 5 en 8 x 10 5 cellen / ml in Jurkat cultuur media (RPMI 1640, 10% foetaal runderserum, 100 eenheden / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine). Sleutel tot succes: Cultuur van de Jurkat cellen in concentraties van meer dan 8 x 10 5 cellen / ml zal resulteren in een vermindering van de transfectie-efficiëntie. Opmerking: De transfectie van HIV Gag-iGFP proviraal DNA in T-cellen, zoals hieronder beschreven, resulteert in de productie van een replicatie-competente humaan immunodeficiëntie virus. Als zodanig, alle procedures worden uitsluitend door geschoold laboratorium personeel in gecertificeerde bioveiligheidsniveau 2 + of bioveiligheid niveau 3 (BL2 + / BL3) weefselkweek kamers. Werken met besmettelijke hiv in de beeldvorming voorzieningen moeten worden goedgekeurd door uw lokale institutionele bioveiligheid kantoor. </li><li> Transfecteren de Jurkats met de virale plasmide, HIV Gag-iGFP met behulp van de Amaxa nucleofection methode (Lonza, Walkersville, MD). Pellet 5 x 10 6 cellen door centrifugatie gedurende 10 minuten bij 150 x g. Aspireren supernatant en was de cellen in steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Centrifugeer de cellen en resuspendeer de pellet tot 97 ul van voorverwarmde, nucleofector oplossing V die de fabrikant aan te vullen. Voeg drie ul van endotoxine gratis HIV Gag-iGFP plasmide (1 pg / pl) om de celsuspensie en meng voorzichtig. Breng de celsuspensie om een ​​cuvet en nucleofect met behulp van het programma S-18. Onmiddellijk overdracht van de cellen tot 3 ml voorverwarmd Jurkat cultuur media zonder antibiotica. </li><li> Voor te bereiden CD4 + doelcellen voor virologisch synapsen, krijgen we humane perifere bloed mononucleaire cellen van buffy coats met behulp van een standaard Ficoll-Paque (GE Healthcare, Uppsala, Zweden) protocol. CD4 + T-cellen worden vervolgens negatief geselecteerd met behulp van een magnetisch bolletje isolatie kit (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Deze kunnen cryogeen worden opgeslagen in vloeibare N2 in porties van 5 x 10 6 cells/500 ul van bevriezing media (90% foetaal runderen serum/10% DMSO). Ontdooid primaire CD4 + T-cellen worden gekweekt in RPMI 10% FBS, aangevuld met 10 eenheden / ml IL-2. </li></ol> (Dag 2) 3. Herstel van de levende cellen van Jurkats getransfecteerd met HIV Gag-iGFP en kleuring van Target Cellen met fluorescente kleurstoffen <ol><li> Laat de Jurkat cellen om &#39;s nachts herstellen van de transfectie. Verwijder vervolgens de cellulaire puin door centrifugeren op een Ficoll Hypaque dichtheidsgradiënt materiaal. Doseer 1,5 ml Ficoll-Paque aan de onderkant van een 15 ml conische buis. Voorzichtig overlay deze gradiënt materiaal met de getransfecteerde Jurkats in een 5 ml volume van RPMI. Centrifugeer de cellen op 400 xg gedurende 20 min bij kamertemperatuur met de rem af. Verwijder voorzichtig de cellen uit de media / Ficoll-interface met behulp van een pipet. Overbrengen naar een nieuwe 15 ml conische buis. Verdun de cellen met RMPI tot een totaal volume van 15 ml en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 minuten. Resuspendeer de pellet in 3 ml Jurkat cultuur media in een 2 cm goed (6-well plaat) en terug de cellen naar de weefselkweek incubator. </li><li> Te onderscheiden doel cellen van donor cellen in cel-cel overdracht experimenten we prelabel de CD4 + doelcellen met fluorescerende kleurstoffen. Primaire CD4 + T-cellen zijn het zelfs het labeling voor gebruik. We hebben een uitstekende succes etikettering T-cellen met zowel CellTracker en CellTrace kleurstoffen (Invitrogen, Carlsbad, CA). Terwijl de kleurstof concentratie en incubatie tijden moeten worden geoptimaliseerd, afhankelijk van de specifieke kleurstof en de gebruikte celtype, een vertegenwoordiger van het protocol volgt. Pellet 4 x 10 6 primaire CD4 + T-cellen door het draaien op 400 xg gedurende 10 minuten. Was de cellen met 5 ml PBS en resuspendeer in 2 ml PBS. Voeg CellTracker Oranje (CMTMR, Invitrogen, Carlsbad, CA) tot een uiteindelijke concentratie van 1,5 uM en incubeer bij 37 ° C gedurende 20 minuten. Voeg 8 mL van complete Jurkat media en centrifugeer op 400 xg gedurende 10 minuten. Resuspendeer de cellen in 3 ml compleet media, aangevuld met 10 eenheden / ml IL-2 en plaats in de weefselkweek incubator &#39;s nachts. </li></ol> (Dag 3) 4. Monitoring Cel-cel Overdracht van HIV Gag-iGFP met behulp van live cell imaging We routinematig gebruik van HIV Gag-iGFP getransfecteerde Jurkat-cellen 48 uur na transfectie. We hebben echter met succes gebruikt cellen al in 24 uur, en zo laat 72 uur na transfectie. <ol><li> Ongeveer 48 uur na transfectie, zijn HIV Gag-iGFP uitdrukken Jurkats geteld, gewassen met CO 2-onafhankelijke media (Invitrogen, Carlsbad, CA), en geresuspendeerd in live cell imaging media (CO 2 onafhankelijke media, 10% foetaal runderserum, 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine, 10 eenheden / ml IL-2) bij een concentratie van 1-3 x 10 7 cellen / ml. </li><li> Op een soortgelijke manier, wassen en resuspendeer label primaire CD4 + T-cellen bij een concentratie van 1-3 x 10 7 cellen / ml in live cell imaging media. </li><li> Mix HIV Gag-iGFP-getransfecteerd Jurkats met een primaire CD4 + T-cellen op een 1:2 of 1:3 verhouding en laden in een behandeld weefselkweek, zuurstofdoorlatende, microchamber (Ibidi, Verona, WI). Bijvoorbeeld, mix 20 ul van HIV Gag-iGFP getransfecteerd Jurkats met 40 pl van het label primaire CD4 + T-cellen. Belasting 50 ul van dit mengsel in een Ibidi kamer en sluit de kamer met pluggen. Zet de stekkers door het wikkelen de stekker / Ibidi kamer-interface met parafilm. </li></ol> 5. Overwegingen voor microscopie platforms: spinning disk confocale imaging Na het laden van een Ibidi imaging kamer met cellen, hebben we meteen monteren van het apparaat op een omgekeerde optische microscoop (iX71 Olympus, Center Valley, PA). De Ibidi kamer moet worden overgedragen aan de microscoop alleen door BL2 +-geschoold laboratorium personeel het dragen van veiligheids-kleding. Hoewel de live-cell imaging vaak gebruik maakt van dure incubatie kamers te handhaven van een stabiele 37 ° C, dit werd bereikt met behulp van een eenvoudige en economische thermostatische verwarming (ASI 400, Nevtek, Williamsville, VA) samen met een T-type thermokoppel tip gemonteerd naast de het monster voor de juiste temperatuur feedback. Wij hebben gevonden met behulp van CO 2-onafhankelijke media stelt ons in staat om hoge levensvatbaarheid van de cellen te behouden terwijl het vermijden van het gebruik van een CO 2 kamer. Om het platform tegen temperatuurschommelingen buffer in de kamer en te blokkeren achtergrond licht wordt blootgesteld, is een grote zwarte sluier gedrapeerd over de hele microscoop / verwarming setup het creëren van een geïsoleerde luchtzak rond het systeem. Dit reduceert variatie in temperatuur en de bijbehorende temperatuur-gerelateerde sample drift, maar vereist voorverwarmen gedurende 30 minuten voorafgaand aan de montage van het monster. 6. Data Acquisition, Transfer en Beeldverwerking Beelden worden genomen met een 60x 1,42 NA olie-immersie objectief (UPlanApo N, Olympus) als de hoge numerieke apertuur (NA) sterk verbetert resolutie. Voor het maken van 3D-confocale beelden, is het scannen uitgevoerd door een draaiende schijf confocale eenheid (CSU-10, Yokagawa, Japan) die tegelijkertijd gebruik maakt van&gt; 800 confocale plekken om drastisch te verhogen van de scansnelheid. Te complimenteren de snelheid, de CSU-10 is gekoppeld met een zeer gevoelige elektron-vermenigvuldigen charged-coupled device (EMCCD, IXON + 897, Andor Technologies, Ierland) camera aan op een snelle, weinig licht beeldvorming die zowel fotobleken en fototoxiciteit vermindert mogelijk te maken. De fluorescentie lichtbron is een multi-golflengte ArKr ion gas laser (Innova 70C, Coherent, Santa Clara), waar de gewenste golflengte (488 nm) en laser-vermogen gemeten vlak voor de microscoop doelstelling (&lt;1 mW) worden geselecteerd door een akoestisch- optic instelbare filter (AOTF), (Andor Technologies). Verder te verminderen fotobleken en uitbreiding van het Total Imaging tijd, de AOTF snel (microseconden) schakelt de laserstraal elke keer dat de camera niet actief is (10-20 ms), terwijl de nieuw verworven afbeelding is verlost van de CCD (15-30 ms belichting) op de computer. Het laserlicht wordt gekoppeld in het draaiende schijf systeem met behulp van een 405/488/568/647 quad-band dichroïsche spiegel (Semrock, Rochester, NY). Fluorescentie-emissie wordt gefilterd met behulp van een 525/50 bandpass filter (Semrock) in een filter wiel (Ludl Electronic Products, Hawthorne, NY) gemonteerd between de EMCCD camera en de confocale draaiende schijf unit. Alle hardware en acquisitie, waaronder een z-fase (Mad Labs Stad, Madison, WI), worden gecontroleerd door de Andor iQ v1.8-software. Om de snelheid van de overname te maximaliseren rond de 1.2-1.9 seconde 3D-beeld stacks, we gewas de opname regio van de camera van de EMCCD&#39;s naar de cel-pair van de directe omgeving. Bovendien ten koste van bepaalde informatie in z, kan een grote z-stap tussen 0.45-0.75 um worden gebruikt voor het versnellen acquisitie. Beeldvorming onder deze voorwaarden kan duren tot 6 uur - met een continue 20-60 minuten segmenten - met minimale fotobleken. In totaal, elke data segment neemt meestal 50 tot 20 Gb aan ruimte als tienduizenden foto&#39;s worden genomen. Ter vergemakkelijking van het transport en de analyse van de grote gegevensbestanden, elke overname ingesteld moet worden afgebroken en geëxporteerd worden als 1 Gb TIFF-afbeeldingsbestand segmenten met behulp van de Andor iQ v1.8-software. Vanaf hier, veel uitstekende software pakketten zijn beschikbaar voor beeldanalyse, zoals Metamorph, Volocity en ImageJ (wij raden de variatie Fiji). Wanneer twee fluorescerende markers worden gevolgd, hebben we gelijktijdig opnemen beiden zonder te vertragen overname door het gebruik van een &quot;split-screen mode.&quot; Beide markers zijn opgewonden door twee verschillende ArKr laserlijnen in een keer (vaak 488 en 568 nm). Direct ingevoegd vóór de EMCCD camera is een afbeelding splitter (OptoSplit II, Cairn, Kent, Verenigd Koninkrijk) dat de twee verschillende beelden van elkaar scheidt. Elk beeld wordt vervolgens zelfstandig gefilterd met behulp van fluorescentie filters (Semrock) en geprojecteerd side-by-side op de camera in een keer het creëren van de &#39;split-screen &quot;effect. Dit zou dan vereisen handmatige bijsnijden en het afstemmen van de beelden later in beeldverwerking. 7. Overwegingen voor Image Processing en data-analyse We meestal voeren beeldanalyse met Volocity (PerkinElmer, Waltham, MA) op Macintosh-computers (Apple, Inc). Draaiende schijf laser confocale microscopie beelden worden eerst aangepast in hun intensiteit om te corrigeren voor photobleaching, dan deconvolved met Volocity. Intensiteit van metingen en het volgen van de Gag puncta is uitgevoerd met de kwantificering Volocity module. Voor het imago bepaalt waar de beweging ten opzichte van een voorgevormde synaps moet worden berekend, is een geautomatiseerd tracking algorithme gebruikt die tracks van de synaptische knop de hele reeks. Handmatige controle van de regio&#39;s van belang, zoals omschreven door de Automatische spoorvolging software moet worden uitgevoerd om te bevestigen dat de software correct heeft het gewenste object gevolgd. Voor objecten waarbij het contrast met de omringende objecten is te zwak is, kan handmatige tracking worden uitgevoerd op een frame-by-frame basis. De Volocity software pakket laat de export van XYZ locatie, het volume en geïntegreerd signaal binnen de gewenste objecten. De afstand van de synaps en de snelheid van het object gevolgd worden berekend door het normaliseren van bewegingen naar het midden van de synaptische knop. 8. Representatieve resultaten Binnen 10 tot 15 minuten van het mengen moet men in staat zijn om HIV Gag-expressie iGFP Jurkat cellen vast te houden aan de primaire CD4 + T-cellen te visualiseren. Imaging deze conjugaten, kan men beoordelen de bewegingen van de Gag puncta in geïnfecteerde cellen als in target cellen na synaspe. Men kan de beweging van de Gag-iGFP puncta al snel te observeren in doel-cellen na synapsen worden gevormd.

<ol><li>Blanco, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+level+of+coreceptor-independent+HIV+transfer+induced+by+contacts+between+primary+CD4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">High level of coreceptor-independent HIV transfer induced by contacts between primary CD4 T cells.</a> J Biol Chem. 279, 51305-51314 (2004).</li>
<li>Sourisseau, M., Sol-Foulon, N., Porrot, F., Blanchet, F., Schwartz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inefficient+human+immunodeficiency+virus+replication+in+mobile+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Inefficient human immunodeficiency virus replication in mobile lymphocytes.</a> J Virol. 81, 1000-1012 (2007).</li>
<li>Jolly, C., Kashefi, K., Hollinshead, M., Sattentau, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+cell+to+cell+transfer+across+an+Env-induced%2C+actin-dependent+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">HIV-1 cell to cell transfer across an Env-induced, actin-dependent synapse.</a> J Exp Med. 199, 283-293 (2004).</li>
<li>Hubner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+%28HIV-1%29+Gag+localization+and+oligomerization+monitored+with+live+confocal+imaging+of+a+replication-competent%2C+fluorescently+tagged+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Sequence of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Gag localization and oligomerization monitored with live confocal imaging of a replication-competent, fluorescently tagged HIV-1.</a> J Virol. 81, 12596-12607 (2007).</li>
<li>Hubner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+3D+video+microscopy+of+HIV+transfer+across+T+cell+virological+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative 3D video microscopy of HIV transfer across T cell virological synapses.</a> Science. 323, 1743-1747 (2009).</li>
</ol>

We beschrijven hier een eenvoudige methode voor het visualiseren van de overdracht van HIV van cel-cel. Recent onderzoek van ons laboratorium en anderen &#39;suggereert dat dit misschien wel de belangrijkste functie van HIV-spread tussen T-cellen. De hier beschreven methode maakt gebruik van een recombinante vorm van HIV, de zogenaamde HIV Gag-iGFP, die een genetisch gecodeerd groen fluorescerend eiwit-tag in de kern van structurele eiwitten, Gag draagt. Omwille van de hoge niveaus van GFP geproduceerd in elk virus deeltje, dit replicatie-competent kloon van HIV stelt onderzoekers in staat om individuele virusdeeltjes track in real time. Dit virus zou vooral nuttig zijn in studies met betrekking tot de montage en de cel-cel overdracht van HIV. De overdracht van HIV door de cel-cel-overdracht is zeer efficiënt. Tijdens een drie uur durende co-cultuur, we routine zien virus overgebracht naar 20-30% van primaire T-cellen als beoordeeld door flowcytometrie. Vergelijkbare rendementen zijn kwalitatief gezien tijdens live cell imaging. Viraal geïnfecteerde T-cellen beginnen de vorming van synapsen met niet-geïnfecteerde primaire T-cellen vrijwel direct na de inleiding van co-cultuur. Interessant, niet alle primaire T-cellen in staat zijn om interactie met HIV-geïnfecteerde cellen Jurkat ondanks de gedwongen interacties met laser een pincet (niet-gepubliceerde waarnemingen, GM). HIV Gag-iGFP zal ongetwijfeld nuttig zijn voor het bepalen van T-cel subsets die het meest gevoelig zijn voor cel-cel transfer, zowel in vitro als in vivo.

<table><tbody><tr><td>Jurkat T-cellen</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leukocyten-buffycoats uit volbloed</td><td>New York Blood Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Foetaal kalfserum</td><td>Hyclone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector-systeem en Solution V</td><td>Lonza Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Maxi Prep Kits</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HIV Gag-iGFP-plasmide</td><td>Chen Laboratory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD4+ T-cel isolatiekit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Celltracker/CellTrace-kleurstoffen</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-onafhankelijk medium</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaging-kamers</td><td>Ibidi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX-71 geïnverteerde microscoop</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PlanApo N 1,42 NA 60X olie-objectief</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Innova 70C ArKr ion gaslaser</td><td>Coherent Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CSU-10 Nipkow-type spinning disk confocale unit</td><td>Yokogawa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Di01-T405/488/568/647-13x15x0,5 dichroïsche beamsplitter</td><td>Semrock</td><td></td><td></td></tr><tr><td>525/50 banddoorlaatfilter</td><td>Semrock</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iXon+ 897 electron-multiplied charged coupled device camera</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ASI 400 thermostatische verwarming</td><td>Nevtek</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualiseren cel-cel overdracht van hiv met behulp van tl-klonen van hiv en live confocale microscopie

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

Door het fuseren van het groen fluorescent eiwit aan hun favoriete eiwitten, biologen hebben nu de mogelijkheid om te studeren wooncomplex cellulaire processen met behulp van fluorescentie microscopie video. Om de bewegingen van het humaan immunodeficiëntie virus kern eiwit tijdens de cel-cel overdracht van het humaan immunodeficiëntie virus, hebben we de Gag eiwit in het kader van een besmettelijke moleculaire kloon van HIV, de zogenaamde HIV Gag-iGFP GFP-gelabeld. We bestuderen deze virale klonen met behulp van video-confocale microscopie. In de volgende gevisualiseerd experiment, we transfecteren een humane T-cellijn met HIV Gag-iGFP, en we gebruiken fluorescent gelabelde niet-geïnfecteerde CD4 + T-cellen om te dienen als doelcellen voor het virus. Met behulp van de verschillende fluorescerende labels kunnen we virale productie en het transport gemakkelijk te volgen over intercellulaire structuren, genaamd virologische synapsen. Eenvoudige zuurstofdoorlatende imaging kamers stellen ons in staat synapsen observeren met live confocale microscopie van minuten tot dagen. Deze benaderingen kunnen worden gebruikt om virale eiwitten volgen als ze bewegen in van de ene cel naar de volgende.

Dit gevisualiseerd experiment is een gids voor het gebruik van een fluorescerende moleculaire kloon van HIV voor live confocale imaging experimenten.

Visualiseren Cel-cel Overdracht van hiv met behulp van TL-Klonen van HIV en Live confocale microscopie

Door het groen fluorescerend proteïne te fuseren met hun doeleiwitten, hebben biologen nu de mogelijkheid om levende, complexe cellulaire processen te bestuderen met behulp van ...

Deze procedure maakt gebruik van live-cell imaging om de overdracht van GFP-gelabeld HIV te visualiseren over virologische synapsen tussen HIV-expresserende jerk CAT T-cellen en niet-geïnfecteerde primaire T-cellen. De cel-op-cel overdrachtassay begint met het transfecteren van jerk CAT T-cellen met HIV gag IG FP, een infectieuze fluorescente kloon van HIV-1, waarbij de getransfecteerde jerk katcellen HIV gag IG FP tot expressie brengen. Deze worden vervolgens gemengd met CMTMR-gelabelde niet-geïnfecteerde primaire T-cellen en geladen in een imagingkamer, waar de overdracht van GFP-gelabeld HIV over de virologische synaps kan worden waargenomen.De resulterende gegevens worden geanalyseerd met behulp van software voor beeldanalyse om de details van de HIV-overdracht via virologische synapsen van T-cellen te onthullen. Hallo, mijn naam is Benjamin Dale van het laboratorium van Ben Chen in de afdeling Geneeskunde aan de Mount Sinai School of Medicine. Mijn naam is Greg McNerney van het laboratorium van Dr. Thomas Huser bij het NSF Center for Biophotonics aan het UC Davis Medical Center.En ik ben Deanna Thompson, ook uit het laboratorium van Dr. Thomas Huser. Vandaag laten we u een procedure zien voor het visualiseren van de cel-naar-cel overdracht van HIV-1 met behulp van live confocale microscopie. In deze procedure worden Jurkat-cellen getransfecteerd met een infectieuze moleculaire kloon van HIV-1; dit mag enkel worden uitgevoerd door getraind laboratoriumpersoneel dat werkt in gecertificeerde biosafety-faciliteiten.De hier getoonde protocol kan worden uitgevoerd in weefselkweekruimtes met bioveiligheidsniveau 2+ of 3. Het werken met infectieus HIV in beeldvormingsfaciliteiten moet zijn goedgekeurd door de lokale institutionele commissie voor bioveiligheid. Houd de jerk cat-cellen die als donorcellen worden gebruikt op een concentratie tussen 2 × 10⁵ en 8 × 10⁵ cellen per milliliter.In de kweek van jerk cat-cellen leidt een mediaconcentratie van cellen die hoger is dan 8 x 10⁵ cellen per milliliter tot een afname van de transfectie-efficiëntie. Om de procedure te starten, transfecteer 5 x 10⁶ jerk cat-cellen met het virale plasmide HIV gag IGFP met behulp van de Amaxa Nucleofector-methode zoals beschreven in het bijbehorende geschreven protocol; laat de cellen gedurende de nacht herstellen. Perifere mononucleaire bloedcellen worden gezuiverd uit buffy coats van volbloed van mensen door middel van FICOL-dichtheidsgradiëntcentrifugatie.De primaire CD4-positieve T-cellen worden gezuiverd uit de mononucleaire cellen van perifeer bloed door middel van negatieve selectie met behulp van een CD4-positieve T-cel isolatiekit. De negatief geselecteerde CD4-positieve T-cellen worden opgevangen uit een magnetische kolom en gekweekt in ons PMI met 10% FPS, aangevuld met 10 units per milliliter recombinant humaan IL-2. De geïsoleerde primaire CD4-positieve T-cellen kunnen ook in aliquoten worden verdeeld en worden ingevroren met behulp van cryogene vriescontainers. De vriescontainers worden gedurende minimaal drie tot vier uur in een vriezer van -70 °C geplaatst.De cellen worden vervolgens overgebracht naar vloeibare stikstof voor langdurige bewaring. Nu de Jurkat-cellen zijn getransfecteerd en de doelwit primaire CD4-positieve T-cellen zijn geïsoleerd, kan men op de dag na de transfectie overgaan tot het reinigen en labelen van de cellen. De Jurkat-cellen brengen nu het infectieuze fluorescerende HIV-construct tot expressie.Bij het werken met infectieuze monsters dragen wij een labjas die aan de voorzijde sluit en twee paar handschoenen. Verwijder het cellulaire debris van de getransfecteerde cellen door centrifugatie over een medium met een hoge dichtheid (Fial High Pack). Doseer eerst 1,5 milliliter Fial Pack op de bodem van een conische buis van 15 milliliter.Bedek vervolgens voorzichtig het gradiëntmateriaal met de getransfecteerde jerk hat-cellen in een volume van vijf milliliter van ons PMI-medium. Op dit punt zijn de getransfecteerde jerk hat-cellen in staat om infectieus HIV te produceren. Daarom moeten alle pipetpuntjes die in contact komen met de HIV-expresserende cellen worden gedesinfecteerd met een 10% bleekoplossing.Sluit de buis af met een dop en spray de buitenkant van de buis met een 70% ethanol-oplossing en veeg deze af met een droge Kimwipe voordat de buis in een container in de veiligheidskast wordt weggegooid. Centrifugeer de cellen 20 minuten bij 400 Gs op kamertemperatuur met de rem uitgeschakeld. Verwijder na centrifugatie voorzichtig de cellen van de interface tussen het medium en de pellet met een pipet en breng de cellen over naar een nieuwe conische buis van 15 milliliter. Verdun de cellen met ons PMI-medium tot een totaal volume van 15 milliliter en centrifugeer 10 minuten bij 300 Gs.Bij kamertemperatuur suspenderen we het pellet in drie milliliter jerk hat cultuurmedium en brengen we dit over naar een putje van twee centimeter van een zes-puts plaat. Plaats de plaat in de weefselkweekincubator tot gebruik de volgende dag. Label in de avond van dezelfde dag de primaire CD4-positieve T-cellen die als doelcellen worden gebruikt, om ze te kunnen onderscheiden van de donorcellen. Pelleteer eerst 4 x 10⁶ van de primaire CD4-positieve T-cellen door te centrifugeren bij 400 G gedurende 10 minuten.Was de cellen vervolgens met vijf milliliter PBS en resuspendeer deze in twee milliliter PBS. Voeg cell tracker orange toe tot een eindconcentratie van 1,5 micromolar en incubeer gedurende minuten bij 37 graden Celsius. Wanneer de incubatie van de cellen is voltooid, voeg acht milliliter compleet chica media toe en centrifugeer 10 minuten bij 400 Gs.Resuspendeer de cellen in drie milliliter volledig medium aangevuld met 10 units per milliliter IL-2 en plaats deze gedurende de nacht in de weefselkweekincubator. Na de incubatie gedurende de nacht zijn de donor- en doelcellen gereed voor het cel-op-cel-transferexperiment. Bereid, voorafgaand aan het opzetten van het cel-op-cel-transferexperiment, de beeldvormingskamer voor om het platform te bufferen tegen temperatuurschommelingen in de ruimte.Om omgevingslicht te blokkeren, wordt een groot zwart scherm over de gehele microscoopopstelling voor verhitting gedrapeerd, waardoor een geïsoleerde luchtlaag rond het systeem ontstaat. De beeldkamer wordt op een stabiele 37 °C gehouden met behulp van een thermostatische verwarming met een T-type thermokoppelpunt dat naast het monster is geplaatst voor temperatuurterugkoppeling. Voorverwarm gedurende 30 minuten voordat het monster wordt gemonteerd.Spinning disc confocale beeldvorming met een geïnverteerde optische microscoop wordt gebruikt om 3D-confocale beelden te maken van de cel-naar-cel overdracht van HIV. Alle hardware en acquisitie, inclusief een Z-tafel, worden aangestuurd door de en of IQ versie 1.8 software; het scannen wordt uitgevoerd door een CS U 10 spinning disc confocale unit die gelijktijdig meer dan 800 confocale spots gebruikt om de scansnelheid aanzienlijk te verhogen ter ondersteuning van de snelheid. De CS U 10 is gekoppeld aan een zeer gevoelige electron multiplying charred coupled device camera om snelle beeldvorming bij weinig licht mogelijk te maken, wat zowel fotobleken als fototoxiciteit vermindert.De fluorescentielichtbron is een argon-krypton iongaslaser met meerdere golflengten. Een akosto-optisch instelbaar filter (AOTF) wordt gebruikt om de gewenste golflengten te selecteren, in dit geval 488 nanometer en 568 nanometer, terwijl het vermogen wordt geregeld om fotobleken verder te verminderen en de beeldvormingstijd te verlengen. De AOTF sluit de laser snel af na elke belichting van 15 tot 30 milliseconde wanneer de camera geen beelden vastlegt, waardoor onnodige blootstelling wordt voorkomen terwijl de beelden van de EMCCD-camera naar de computer worden overgedragen.Het laserlicht wordt in het spinning disc-systeem geïntegreerd met behulp van een 405 488 568 647 quad-band dichroïsche spiegel; de fluorescentie-emissie wordt op basis van golflengte gescheiden met behulp van een 560 nanometer long-pass dichroïsche spiegel met een image splitter. Het groene kanaal wordt gefilterd met een 525/50 nanometer band-pass filter en het rode kanaal wordt gefilterd met een 609/54 nanometer band-pass filter. De twee kanalen worden zij aan zij geprojecteerd op de EMCCD-camera.Terwijl de beeldkamer opwarmt, bereidt u de cellen voor op het experiment voor cel-naar-cel transfer. Gebruik een hemocytometer om de HIV gag IGFP-expresserende ette-cellen te tellen. Plaats de hemocytometer in een petrischaal om directe blootstelling aan de virus-expresserende cellen te voorkomen.Was de cellen met CO2-onafhankelijk medium en resuspendeer deze in medium voor live-cell imaging met een concentratie van 1 tot 3 × 10⁷ cellen per milliliter. Het gebruik van CO2-onafhankelijk medium maakt een CO2-incubatiekamer overbodig. Voor imaging.Tel de cellen vervolgens, was ze en resuspendeer de gelabelde primaire CD4-positieve T-cellen zoals zojuist getoond voor de Jurkat-cellen. Start daarna de cel-op-celtransfer: meng 20 µL HIV gag IGFP-getransfecteerde Jurkat-cellen met 40 µL gelabelde primaire CD4-positieve T-cellen en breng 50 µL over in een gasdoorlaatbare EBD-microkamer die is behandeld voor weefselkweek. Sluit de kamer af met pluggen en bevestig de pluggen door de interface tussen de plug en de EBD-kamer te omwikkelen met parafilm.Veeg de beeldvormingskamer af met een chemisch doekje gedrenkt in 70% ethanol en laat deze kort aan de lucht drogen in de zuurkast. Transporteer de afgesloten beeldvormingskamer in een afgesloten container om accidentele blootstelling te voorkomen. Mocht de kamer tijdens het transport vallen, dan dient men direct na het laden van de IBD-beeldvormingskamer met cellen het apparaat op de microscoop te monteren.Maak beelden van celparen met een 60 x 1,42 NA olie-immersieobjectief, aangezien de hoge numerieke apertuur de resolutie aanzienlijk verbetert om de acquisitiesnelheid per 3D-beeldstack te maximaliseren. Kader het opnamegebied van de camera van de EM CD in op het directe gebied rondom een celpaar. Bovendien kan een grote Z-stap tussen 0,45 en 0,75 micrometers onder deze omstandigheden ook helpen de acquisitie te versnellen.Beelden worden continu geregistreerd met intervallen van 20 tot 60 minuten. Herhaaldelijk beeldvorming van dezelfde monsterplek kan tot zes uur duren met minimale fotobleking tijdens de acquisitie. Elk datasegment bestaat uit tienduizenden beelden die in totaal vijf tot 20 gigabyte kunnen beslaan.Om het transport en de analyse van de grote bestanden te vergemakkelijken, wordt elk bestand opgesplitst en geëxporteerd als TIFF-afbeeldingsbestandssegmenten van één gigabyte. Gebruik voor de analyse van de verkregen beelden een van de diverse beschikbare softwareprogramma's voor beeldanalyse. Raadpleeg het bijbehorende geschreven protocol voor details over de beeldanalyse, inclusief correctie voor intensiteitsverlies door bleaching en automatische en handmatige tracking van gag-puncta.Binnen 10 tot 15 minuten na het mengen kunnen HIV gag IGFP-expresserende Jerk-katcellen worden gevisualiseerd terwijl ze hechten aan primaire CD4-positieve T-cellen. Met deze conjugaten kunnen de bewegingen van gag-puncta in geïnfecteerde cellen evenals in doelcellen worden beoordeeld. Na de synaps, binnen 30 minuten tot drie uur, kan de beweging van gag IG FP-puncta naar doelcellen die met CellTracker zijn gelabeld, worden waargenomen.We hebben zojuist gedemonstreerd hoe de cel-naar-cel overdracht van HIV tussen T-cellen gevisualiseerd kan worden. Bij het uitvoeren van deze procedures is het zeer belangrijk om alle voorzorgsmaatregelen voor biosafety level two plus of biosafety level three in acht te nemen bij het hanteren van monsters die zijn blootgesteld aan HIV-expresserende cellen. Denk er daarnaast aan om goed onderhouden JCA-cellen en endotoxinevrij DNA te gebruiken om de transfectie te optimaliseren.Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

visualizing-cell-to-cell-transfer-hiv-using-fluorescent-clones-hiv

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een techniek combineert in situ tetrameer vlekken en in situ hybridisatie (ISTH) maakt visualisatie, in kaart brengen en analyseren van de ruimtelijke nabijheid van virus-specifieke CD8 + T-cellen om hun virus-geïnfecteerde targets, en de bepaling van de kwantitatieve relaties tussen deze immuun-effectoren en doelstellingen voor infecties resultaten.

Een techniek om tegelijkertijd Visualiseer virus-specifieke CD8 + T-cellen en virus-geïnfecteerde cellen In situ</em

We hebben een lentivirale vector die, bezit naast de Tat-responsieve LTR, de Rev-respons element (RRE) die reporter genexpressie kan reguleren in een HIV-1-Tat en Rev-afhankelijke manier. De vector maakt de specifieke detectie van HIV-replicatie in levende cellen via de expressie van GFP.

Specifieke markering van de HIV-1 positieve cellen met behulp van een Rev-afhankelijke lentivirale vector uitdrukken van de Green Fluorescent Protein

Dit artikel beschrijft een methode om de vorming van een HIV-1 envelop geïnduceerde virologische synaps op glas ondersteund vlakke dubbellagen door totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie visualiseren. De werkwijze kan ook worden gecombineerd met immunofluorescentiekleuring tot activering en herverdeling van signaalmoleculen die tijdens HIV-1-geïnduceerde envelop virologische synapsvorming detecteren.

Imaging van HIV-1 Envelope-geïnduceerde Virologische Synapse en signalering op synthetische lipidendubbellagen

Detectie van virale RNA door fluorescentie<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie (FISH)

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

We beschrijven een correlatieve microscopie methode die high-speed 3D levende cellen fluorescerend licht microscopie en hoge-resolutie cryo-electron tomografie combineert. We demonstreren het vermogen van de correlatieve wijze dynamische beeldvorming, kleine HIV-1 deeltjes interactie met gastheer HeLa cellen.

Correlatieve microscopie voor 3D Structural Analysis van Dynamic Interactions

Live cell imaging van alphaherpes virusinfecties maakt analyse van de dynamische gebeurtenissen van gerichte transport en intercellulaire verspreiding. Hier presenteren we methodieken die recombinante virale stammen die fluorescerende fusie-eiwitten tot visualisatie van virale assemblages tijdens infectie van primaire neuronen te faciliteren.

Live cell imaging van Alphaherpes Virus Anterograad Transport en Spread

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor een fluorescentiebeeldvormingsbenadering, multiplex immunofluorescent cell-gebaseerde detection van DNA, RNA en protein (MICDDRP), een methode die in staat is tot gelijktijdige fluorescentie eencellige visualisatie van virale eiwitten en nucleïnezuren van verschillende type en gestrandheid. Deze aanpak kan worden toegepast op een breed scala aan systemen.

Eencellige multiplexed fluorescentie beeldvorming om virale nucleïnezuren en eiwitten te visualiseren en HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika-virus en influenza-infectie te controleren

Hier presenteren we een protocol waarin afzonderlijke cellen worden gecontroleerd op acute gebeurtenissen en productieve HIV-1-infectie op een nanofluïdisch apparaat. Beeldvormingsgegevens definiëren virus-host receptorinteracties en signaalroutedynamiek. Dit is de eerste methode voor nanofluïdische longitudinale eencellige cultuur en beeldvorming met hoge doorvoer om signaalkinetiek en moleculaire interacties te bestuderen.

Eencellige karakterisering van calciuminstroom en HIV-1-infectie met behulp van een Multiparameter Optofluidic Platform

Deze methode biedt een toegankelijk en flexibel protocol voor de voorbereiding van elektronenmicroscopieroosters (EM) voor in situ cellulaire cryotomografie en correlatieve licht- en elektronenmicroscopie (CLEM).

Monstervoorbereiding voor in situ cryotomografie van zoogdiercellen

Leer cel-cel overdracht van HIV visualiseren met behulp van fluorescente moleculaire klonen en live confocale microscopie. Deze methode maakt real-time observatie van virologische synapsen tussen T-cellen mogelijk.

Visualiseren Cel-cel Overdracht van hiv met behulp van TL-Klonen van HIV en Live confocale microscopie

Meer video's verkennen