Name: Experimentele metastase en CTL adoptieve overdracht Immunotherapie Muis Model (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-26T15:03:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Leer een muismodel voor longmetastasen en adoptieve CTL-overdracht om immunotherapie in vivo te evalueren. Deze methode kwantificeert tumorknobbels met Indiainkt voor effectiviteitsanalyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (CA133085 naar KL) en de American Cancer Society (RSG-09-209-01-TBG naar KL).

1. Experimentele Metastase Muis Model <ol><li> Op de dag voor de tumorcel injecties, zaad een T75 fles met maximaal 1 x 10 7 CMS4-Met-cellen in 10 ml RPMI medium dat 10% serum op de snel groeiende tumor cellen te verkrijgen. Incubeer overnacht bij 37 ° C. </li><li> Op de dag van de injectie, het medium te verwijderen en een keer spoelen van de cellen met PBS, dan is de oogst van het tumorcellen met 0,05% trypsine-EDTA bij 37 ° C gedurende 5 minuten. Stop de reactie met 10 ml RPMI medium dat 10% serum. Overdracht cellen om een ​​conische buis. </li><li> Spin down de cellen bij 1300 rpm in een Sorvall Legend RT centrifuge gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant. Resuspendeer de cellen in 10 ml vers 1X HBSS te wassen, dan weer spin down en resuspendeer op dezelfde manier. </li><li> Tel de tumor cellen op een hemocytometer. Verdun de cellen in HBSS, zodat de cellen die nodig zijn voor elke injectie worden opnieuw gesuspendeerd in een totaal volume van 100 ul. </li><li> Warm de 6-8 week oude BALB / c muizen in een bekerglas ondergedompeld in warm water naar de staart ader te verwijden. Plaats de muis op een staartader restrainer op de bank. Gebruik een micro van 100 ul van tumorcellen te injecteren in de laterale staartader. Gebruik aseptische techniek om infectie te voorkomen. Na injectie van toepassing lichte druk op de injectieplaats tot bloeden is gestopt. </li><li> Zet de muis naar de kooi, en laat de tumor te groeien tot de gewenste podium. </li></ol> 2. Cytotoxische T-lymfocyten (CTL) adoptieve overdracht Immunotherapie <ol><li> Op de dag van de overdracht, pipet op en neer naar gezuiverde cytotoxische T-lymfocyten, of CTL, bereid zoals beschreven in de tekst mengen. Overdracht van al de cellen van de ene plaat naar een 15 ml conische buis, niet laten het volume hoger zijn dan meer dan 2 / 3 van de buis. </li><li> Plaats een steriel Pasteur pipet in de conische buis en leg Lymfocyt scheiding Medium, of LSM, onder de cellen tot het totale volume nadert 14 ml. </li><li> Wees voorzichtig niet om de lagen te verstoren. Centrifugeer bij 2000 rpm gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Geen gebruik maken van het rempedaal naar het rotor langzaam na het spinnen. </li><li> Overdracht van de CTL's om een ​​nieuw 15 ml conische buis. Voeg HBSS tot een volume van ongeveer 10 ml te wassen. </li><li> Tel de cellen. Spin neer op 1300 rpm gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Resuspendeer in HBSS om de benodigde celdichtheid voor injecties, waarbij het totale volume per injectie op 100 pi. </li><li> Gebruik dezelfde staart injectietechniek zoals eerder in deze video zien op de CTL's injecteren in tumor-dragende muizen. </li><li> Zet de muis naar de kooi, en laat de CTL's om te interageren met de tumor. Muizen zijn meestal opgeofferd voor analyse 14-21 dagen na de CTL behandeling. </li></ol> 3. Visualisatie van longmetastasen <ol><li> Te visualiseren longmetastasen, plaats een geofferd muis op zijn rug op een piepschuim bord. Speld de benen om onbelemmerde toegang tot de luchtpijp te verzekeren. Spray de ventrale zijde met 70% ethanol. </li><li> Vanaf het midden van de buik, gebruik van een schaar te snijden langs de middellijn, door middel van de ribbenkast, en omhoog in de richting van de speekselklieren. Expose de luchtpijp. Een tang om weefsels rond de luchtpijp te verwijderen. </li><li> Rijg een 200 pi pipettip onder de luchtpijp. Houd de tip met een hand, til de luchtpijp omhoog en weg van het lichaam. </li><li> Draai het platform 180 °. Gebruik een 50 ml spuit naar India Ink te injecteren in de longen via de luchtpijp. Volledig opblazen van de longen met inkt totdat je voelt een sterke weerstand. </li><li> Gebruik een schaar om de luchtpijp te snijden. Schuif een pincet onder de longen en til ze uit de muis. Kort Spoel de longen in een 1 liter beker water. </li><li> In een chemische dampkap, overdracht van de longen om een ​​glas scintillatie flacon met 5 ml van de oplossing Fekete's. De tumor weefsel zal verschijnen als witte knobbeltjes op de zwarte longen na een paar minuten. De tumoren kunnen nu worden geteld en opgeslagen in oplossing Fekete is voor onbepaalde tijd. </li></ol> 4. Vertegenwoordiger Metastasen in Gevisualiseerde longen <ol><li> Hier, de longen van muizen die werden ingespoten met mammacarcinoom cellijn 4T1 tonen witte vlekken geven tumoren. Muizen die werden geïnjecteerd met 4T1 cellen getransfecteerd met een IRF8 dominant-negatieve mutant K79E tonen de verbeterde metastatisch potentieel van tumorcellen. </li><li> Deze beelden tonen een histologische analyse van de werkzaamheid van CTL adoptieve overdracht immunotherapie. Tumor-dragende muizen ingespoten met een zoutoplossing toonde meerdere tumoren 6 dagen later, aangegeven met gele pijlen (A). Muizen geïnjecteerd met tumor-specifieke T-cellen, aan de andere kant, toonde een vermindering van de tumoren (B). </li><li> In hetzelfde experiment, India inkt behandeling geeft een eenvoudiger manier om de werkzaamheid van CTL adoptieve overdracht te meten. Hier, de witte tumor knobbeltjes op tumor-dragende longen duidelijk onderscheiden van de longen die met succes hebben ondergaan CTL adoptieve overdracht, en het tellen van de knollen zorgt voor een diplomavan kwantificering niet mogelijk is met histologie. </li></ol> 5. Representatieve resultaten <img src="/files/ftp_upload/2077/2077fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Experimentele regeling voor experimentele tumor metastase en CTL adaptieve overdracht immunotherapie muis model. Rode stippen geven aan tumorcellen en groene stippen aangeven CTL's. <img src="/files/ftp_upload/2077/2077fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Verstoring van IRF8 functie verbeterde de metastatisch potentieel van tumorcellen. Muis mammacarcinoom cellijn 4T1 was stabiel getransfecteerd met vector (4T1.Vector) of vector die een IRF8 dominant-negatieve mutant K79E (4T1.IRF8K79E) (15, 16). Tumorcellen werden geïnjecteerd iv in muis laterale staart aderen. Tumor-dragende longen werden opgeblazen met Oost-Indische inkt om tumoren te visualiseren. Tumoren zijn gemakkelijk te zien als witte vlekken op de zwarte longweefsel achtergrond. <img src="/files/ftp_upload/2077/2077fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Histologische analyse van de werkzaamheid van CTL adoptieve overdracht immunotherapie. Muis sarcoom cellijn CMS4-Met werd geïnjecteerd in muizen iv laterale staart aderen. Drie dagen later werden de zoutoplossing (A) of tumor-specifieke T-cellen (B) geïnjecteerd in de tumor-dragende muizen. Longen werden geanalyseerd zes dagen na CTL behandeling door middel van conventionele H &amp; E histologische kleuring. Tumoren zijn aangegeven met pijlen. <img src="/files/ftp_upload/2077/2077fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Visualisatie van tumoren door de Oost-Indische inkt inflatie. Muis sarcoom cellijn CMS4-Met werd geïnjecteerd in muizen iv laterale staart aderen. Drie dagen later werden zoutoplossing (Control) of tumor-specifieke T-cellen (+ CTL) geïnjecteerd in de tumor-dragende muizen. Longen werden geanalyseerd veertien dagen na de behandeling CTL. De witte vlekken, die tumoren, zorgen voor een gemakkelijke kwantificering van de effectiviteit van CTL behandeling.

<ol><li>Ryan, M. H., Bristol, J. A., McDuffie, E., Abrams, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regression+of+extensive+pulmonary+metastases+in+mice+by+adoptive+transfer+of+antigen-specific+CD8%28%2B%29+CTL+reactive+against+tumor+cells+expressing+a+naturally+occurring+rejection+epitope%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regression of extensive pulmonary metastases in mice by adoptive transfer of antigen-specific CD8(+) CTL reactive against tumor cells expressing a naturally occurring rejection epitope.</a> J Immunol. 167 (8), 4286-4292 (2001).</li>
<li>Caldwell, S. A., Ryan, M. H., McDuffie, E., Abrams, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Fas%2FFas+ligand+pathway+is+important+for+optimal+tumor+regression+in+a+mouse+model+of+CTL+adoptive+immunotherapy+of+experimental+CMS4+lung+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The Fas/Fas ligand pathway is important for optimal tumor regression in a mouse model of CTL adoptive immunotherapy of experimental CMS4 lung metastases.</a> J Immunol. 171 (5), 2402-2412 (2003).</li>
<li>Liu, K., Caldwell, S. A., Greeneltch, K. M., Yang, D., Abrams, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTL+Adoptive+Immunotherapy+Concurrently+Mediates+Tumor+Regression+and+Tumor+Escape%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">CTL Adoptive Immunotherapy Concurrently Mediates Tumor Regression and Tumor Escape.</a> J Immunol. 176 (6), 3374-3382 (2006).</li>
<li>Yang, D., Stewart, T. J., Smith, K. K., Georgi, D., Abrams, S. I., Liu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulation+of+IFN-gammaR+in+association+with+loss+of+Fas+function+is+linked+to+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+cancer%22%5BJournal%5D)">Downregulation of IFN-gammaR in association with loss of Fas function is linked to tumor progression.</a> International journal of cancer. 122 (2), 350-362 (2008).</li>
<li>Pages, F., Berger, A., Camus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effector+memory+T+cells%2C+early+metastasis%2C+and+survival+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Effector memory T cells, early metastasis, and survival in colorectal cancer.</a> N Engl J Med. 353 (25), 2654-2666 (2005).</li>
<li>Galon, J., Costes, A., Sanchez-Cabo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type%2C+density%2C+and+location+of+immune+cells+within+human+colorectal+tumors+predict+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Type, density, and location of immune cells within human colorectal tumors predict clinical outcome.</a> Science. 313 (5795), 1960-194 (2006).</li>
<li>Strater, J., Hinz, U., Hasel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+CD95+expression+predisposes+for+recurrence+in+curatively+resected+colon+carcinoma%3A+clinical+evidence+for+immunoselection+and+CD95L+mediated+control+of+minimal+residual+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Impaired CD95 expression predisposes for recurrence in curatively resected colon carcinoma: clinical evidence for immunoselection and CD95L mediated control of minimal residual disease.</a> Gut. 54 (5), 661-665 (2005).</li>
<li>Camus, M., Tosolini, M., Mlecnik, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+intratumoral+immune+reaction+and+human+colorectal+cancer+recurrence%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Coordination of intratumoral immune reaction and human colorectal cancer recurrence.</a> Cancer research. 69 (6), 2685-2693 (2009).</li>
<li>Dudley, M. E., Wunderlich, J. R., Yang, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+cell+transfer+therapy+following+non-myeloablative+but+lymphodepleting+chemotherapy+for+the+treatment+of+patients+with+refractory+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Adoptive cell transfer therapy following non-myeloablative but lymphodepleting chemotherapy for the treatment of patients with refractory metastatic melanoma.</a> J Clin Oncol. 23 (10), 2346-2357 (2005).</li>
<li>Srivastava, M. K., Sinha, P., Clements, V. K., Rodriguez, P., Ostrand-Rosenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid-derived+suppressor+cells+inhibit+T-cell+activation+by+depleting+cystine+and+cysteine.+Cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Myeloid-derived suppressor cells inhibit T-cell activation by depleting cystine and cysteine. Cancer research.</a> 70 (1), 68-77 (2010).</li>
<li>Nagaraj, S., Gabrilovich, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+escape+mechanism+governed+by+myeloid-derived+suppressor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Tumor escape mechanism governed by myeloid-derived suppressor cells.</a> Cancer research. 68 (8), 2561-2563 (2008).</li>
<li>Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis%3A+from+dissemination+to+organ-specific+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews%22%5BJournal%5D)">Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization.</a> Nature reviews. 9 (4), 274-284 (2009).</li>
<li>Heijstek, M. W., Kranenburg, O., Rinkes, B. orel, H, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+colorectal+cancer+and+liver+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+surgery%22%5BJournal%5D)">Mouse models of colorectal cancer and liver metastases.</a> Digestive surgery. 22 (1-2), 1-2 (2005).</li>
<li>Yang, D., Ud Din, N., Browning, D. D., Abrams, S. I., Liu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+lymphotoxin+beta+receptor+with+tumor-specific+T+lymphocytes+for+tumor+regression%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Targeting lymphotoxin beta receptor with tumor-specific T lymphocytes for tumor regression.</a> Clin Cancer Res. 13 (17), 5202-5210 (2007).</li>
<li>Yang, D., Thangaraju, M., Browning, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN+Regulatory+Factor+8+Mediates+Apoptosis+in+Nonhemopoietic+Tumor+Cells+via+Regulation+of+Fas+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">IFN Regulatory Factor 8 Mediates Apoptosis in Nonhemopoietic Tumor Cells via Regulation of Fas Expression.</a> J Immunol. 179 (7), 4775-4782 (2007).</li>
<li>Yang, D., Thangaraju, M., Greeneltch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repression+of+IFN+regulatory+factor+8+by+DNA+methylation+is+a+molecular+determinant+of+apoptotic+resistance+and+metastatic+phenotype+in+metastatic+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Repression of IFN regulatory factor 8 by DNA methylation is a molecular determinant of apoptotic resistance and metastatic phenotype in metastatic tumor cells.</a> Cancer research. 67 (7), 3301-3309 (2007).</li>
<li>Wexler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+identification+of+experimental+pulmonary+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Accurate identification of experimental pulmonary metastases.</a> Journal of the National Cancer Institute. 36 (4), 641-645 (1966).</li>
</ol>

Muizen werden gekocht bij het National Cancer Institute (Friderick, MD) en gehuisvest in het Medical College of Georgia dier faciliteit. Experimenten en zorg / welzijn waren in overeenstemming met de federale regelgeving en een goedgekeurde protocol door het Medical College of Georgia IACUC commissie.

Oplossingen: India Ink Oplossing (17): <ol><li> Giet 150 ml gedestilleerd water in een kolf van 250 ml. </li><li> Voeg 4 druppels ammoniumhydroxide aan het gedestilleerd water. </li><li> Voeg 30 ml India voorraad inkt (dat wil zeggen Sanford Black Magic Waterproof tekeninkt 4465 Item 44.011) om de ammoniak en water mengsel. </li><li> Top af met gedestilleerd water tot een volume van 200 ml. Oplossing is klaar voor injectie. </li></ol> Fekete&#39;s Solution (17): Fekete De oplossing wordt gebruikt voor het bleken Oost-Indische inkt-opgeblazen tumor-dragende longen naar wit tumoren te onderscheiden van de zwarte achtergrond van de normale weefsels. <ol><li> Voeg 350ml 95% EtOH tot 1L glazen fles. </li><li> Voeg 150 ml gedestilleerd water </li><li> Voeg 50ml formaldehyde </li><li> Voeg 25ml glaciaal zuur zuur </li></ol>

experimentele metastase en ctl adoptieve overdracht immunotherapie muis model

Experimental Metastasis and CTL Adoptive Transfer Immunotherapy Mouse Model

Experimenteel metastase muismodel is een eenvoudige en toch fysiologisch relevante metastase model. De tumorcellen worden intraveneus geïnjecteerd (iv) in de muis staart aderen en koloniseren in de longen, waardoor, lijkt op de laatste stappen van tumorcellen spontane metastase: overleven in de bloedsomloop, extravasatie en kolonisatie in de distale organen. Vanuit therapeutisch oogpunt, de experimentele metastase model is de eenvoudigste en ideale model, omdat het doel van therapieën is vaak het eindpunt van metastase: opgericht gemetastaseerde tumor in de distale orgel. In dit model worden tumorcellen ingespoten iv in de muis staart aderen en toegestaan ​​om te koloniseren en te groeien in de longen. Tumor-specifieke CTL&#39;s worden vervolgens geïnjecteerd in de uitzaaiingen iv-dragende muis. Het aantal en de grootte van de long metastasen kan worden gecontroleerd door het aantal tumorcellen te worden geïnjecteerd en de tijd van tumorgroei. Daarom verschillende stadia van metastase, van minimale metastase tot uitgebreide metastase, kan worden gemodelleerd. Longmetastasen worden geanalyseerd door de inflatie met inkt, waardoor makkelijker visuele waarneming en kwantificering.

Een experimentele long metastase en CTL immunotherapie muis-model voor de analyse van tumorcellen-T-cel-interactie<em&gt; In vivo</em&gt;.

Experimentele metastase en CTL adoptieve overdracht Immunotherapie Muis Model

Het experimentele metastasemodel bij muizen is een eenvoudig en toch fysiologisch relevant metastasemodel. De tumorcellen worden intraveneus (i.v.) geïnjecteerd in ...

Het algemene doel van deze procedure is om de effectiviteit van in vivo adoptieve transfer-immunotherapie met tumorspecifieke T-cellen te onderzoeken. Dit wordt eerst bereikt door tumorcellen via injectie in de laterale staartvene bij muizen te transplanteren om longmetastasen te induceren. De tweede stap van de procedure is het behandelen van de tumor dragende muizen met tumorspecifieke cytotoxische T-lymfocyten CTLs.De laatste stap is het gebruik van Indische inkt als middel om tumornoduli te visualiseren en te kwantificeren. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de CIE van verschillende behandelingen laten zien door de tumorgrootte te meten en het aantal tumornoduli te kwantificeren. Hallo, mijn naam is Mary Zimmerman en ik ben lid van het laboratorium van Dr. Kevin Lu aan het Medical College of Georgia.Hallo, mijn naam is Shelene Hu. Ik ben een tweedejaars student en ik werk ook in het laboratorium van Dr. Lou. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van traditionele methoden, zoals overlevingscurves, is dat deze procedure zowel kwalitatief als kwantitatief is. De implicaties van deze technieken kunnen worden uitgebreid naar cancertherapie, omdat het de adoptieve T-celimmunotherapie bij menselijke kankerpatiënten nabootst.Laten we beginnen. Zaai op de dag vóór de injecties van de tumorcellen één T 75-fles met maximaal 1 × 10⁷ CMS-4-cellen in 10 mL RPMI-medium met 10% serum. Om snelgroeiende tumorcellen te verkrijgen, worden deze op de dag van de injectie een nacht geïncubeerd bij 37 °C.Verwijder het medium en spoel de cellen één keer met PBS, oogst vervolgens de tumorcellen met 0,05% trypsine EDTA bij 37 °C gedurende vijf minuten. Stop de reactie met 10 ml RPMI-medium dat 10% serum bevat. Breng de cellen over naar een conische buis.Centrifugeer de cellen drie minuten lang bij 1300 RPM in een val legend RT-centrifuge. Verwijder bij kamertemperatuur het supernatant en resuspendeer de cellen in 10 milliliter verse one XHB Ss om te wassen. Centrifugeer vervolgens opnieuw en resuspendeer op dezelfde wijze.Tel de tumorcellen met een hemo.Cytometer. Verdun de cellen in HBSS zodat de voor elke injectie benodigde cellen worden geresuspendeerd. Verwarm de zes tot acht weken oude B SEA-muizen in een bekerglas, ondergedompeld in warm water, in een totaal volume van 100 microliters.Om de staartvene te dilateren, plaatst u de muis in een staartvene-fixatieapparaat op de werkbank. Gebruik een microspuit om 100 µL tumorcellen in de laterale staartvene te injecteren. Hanteer een aseptische techniek om infecties na de injectie te voorkomen.Oefen lichte druk uit op de injectieplaats tot de bloeding is gestopt. Plaats de muis terug in de kooi en laat de tumor groeien tot het gewenste stadium. Pipetteer op de dag van de overdracht herhaaldelijk op en neer om de voorbereide gezuiverde cytotoxische T-lymfocyten of CTL's opnieuw te suspenderen.Zoals in de tekst beschreven, worden alle cellen van één plaat overgebracht naar een conische buis van 15 milliliter, waarbij het volume niet meer dan twee derde van de buis mag beslaan. Plaats een steriele Pasteurpipet in de conische buis en voeg lymfocytenseperatiumedium of LSM voorzichtig toe als laag onder de cellen, totdat het totale volume bijna 14 milliliter bedraagt.Zorg ervoor dat de lagen niet worden verstoord. Centrifugeer bij 2000 RPM gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Gebruik de rem niet om de rotor na het centrifugeren te vertragen; overbreng de CTL's naar een nieuwe conische buis van 15 milliliter.Voeg HBSS toe tot een volume van ongeveer 10 milliliters. Om te wassen. Tel de cellen en centrifugeer deze bij 1300 RPM gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur; resuspendeer in HBSS tot de vereiste celdichtheid voor injecties.Houd het totale volume per injectie op 100 microliters. Gebruik dezelfde techniek voor staartinjectie als eerder in deze video te zien was. Om de CTL's in tumor dragende muizen te injecteren, plaatst u de muis terug in de kooi en laat u de CTL's reageren met de tumor.Muizen worden gewoonlijk 14 tot 21 dagen na de CTL-behandeling geofferd voor analyse. Om longmetastasen te visualiseren, wordt een geofferde muis op de rug op een piepschuimplaat geplaatst. Zet de poten vast om een ongehinderde toegang tot de trachea te garanderen.Spray de ventrale zijde met 70%ethanol, beginnend bij het midden van het abdomen. Gebruik een schaar om langs de middellijn door de ribbenkast en omhoog richting de speekselklieren te knippen. Leg de trachea vrij.Gebruik een pincet om de weefsels rondom de trachea te verwijderen. Schuif een pipetpunt van 200 µL onder de trachea terwijl u de punt met één hand vasthoudt. Til de trachea voorzichtig op en weg van het lichaam.Draai het platform 180 graden. Gebruik een spuit van 50 milliliter om India-inkt via de trachea in de longen te injecteren. Blaas de longen volledig op met inkt totdat u een sterke weerstand voelt.Gebruik een schaar om de trachea door te knippen. Schuif een pincet onder de longen en til deze uit de muis. Spoel de longen kort af in een bekerglas van één liter met water in een zuurkast.Overbreng de longen naar een glazen installatie met vijf milliliter FTI-oplossing. Het tumorweefsel zal verschijnen als witte knobbeltjes op de zwarte longen. Na enkele minuten kunnen de tumoren worden geteld en onbeperkt in FTI-oplossing worden bewaard.Longen van muizen getransfecteerd met mamma-carcinoom. De cellijn 4T1 vertoont witte vlekken die duiden op tumoren. Muizen getransfecteerd met een IRF8 dominant-negatieve mutant K79E vertonen het verhoogde metastatische potentieel van tumorcellen.Deze afbeeldingen tonen een histologische analyse van de effectiviteit van immunotherapie via adoptieve transfer van CTL's. Tumordragende muizen die waren geïnjecteerd met zoutoplossing vertoonden zes dagen later meerdere tumoren, aangegeven door pijlen. Muizen die waren geïnjecteerd met tumorspecifieke T-cellen vertoonden daarentegen een vermindering van tumoren in hetzelfde experiment.Behandeling met Indiase inkt biedt een eenvoudigere manier om de effectiviteit van CTL-adoptieve overdracht te meten. Hier maken de witte tumornoduli op de tumorbevattende longen deze duidelijk onderscheidbaar van longen die succesvol een CTL-adoptieve overdracht hebben ondergaan, en het tellen van de noduli maakt een mate van kwantificering mogelijk die met histologie niet haalbaar is. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om eraan te denken de muizen op te warmen voor eenvoudigere en nauwkeurigere injecties in de staartvene.Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe de effectiviteit van de behandeling kan worden beoordeeld via deze eenvoudige procedure om de tumoromvang en het aantal tumoren te kwantificeren. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

experimental-metastasis-ctl-adoptive-transfer-immunotherapy-mouse

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Het genereren en karakteriseren van tumorspecifieke T-cellen met gehumaniseerde muizen wordt hier beschreven. Human thymusweefsel en genetisch gemodificeerde humane hematopoietische stamcellen worden getransplanteerd in immunodeficiënte muizen. Dit resulteert in de bereiding van een op menselijke immuunsysteem waardoor in vivo onderzoek van anti-tumor immuunrespons.

Met behulp van de BLT Gehumaniseerd Muis als een Stem Cell gebaseerde Gene Therapy tumormodel

De metastatische verspreiding van kanker de belangrijkste oorzaak van kankersterfte. Wij bieden een uitgebreide beschrijving van ons overleven chirurgie methodologie voor de oprichting van een "patiënt-achtige" orthotoop syngeen muis modelsysteem voor het bestuderen van de mechanismen van metastase in vaste orgel tumoren.

Een &quot;Patiënt-Like&quot; Orthotope Syngene Mouse Model van Hepatocellular carcinoom metastase

Een orthotope borstkanker primaire tumor model en chirurgische verwijdering van de primaire tumor de muis het leven uit te breiden tot spontane metastase genereren beschreven. De tumorgroei en progressie worden gecontroleerd en gekwantificeerd luciferase fluorescentiebeeldvorming.

Een orthotope Muis Model van Spontane uitzaaiing van borstkanker

Het vermogen van metastaserende klonen om verre locaties te koloniseren, hangt af van hun proliferatievermogen en/of hun vermogen om te overleven in de micro-omgeving van de gastheer zonder significante proliferatie. Hier presenteren we een diermodel dat kwantitatieve visualisatie van beide typen leverkolonisatie door metastaserende klonen mogelijk maakt.

Geavanceerde diermodel van colorectale metastase in de lever: Imaging technieken en eigenschappen van gemetastaseerde Clones

Hier beschrijven we een murine xenograft model dat functioneel lijkt op een Ommaya reservoir bij patiënten. We ontwikkelden de Murine Ommaya om nieuwe therapieën te bestuderen voor de universeel fatale leptomeningeale ziekte.

Een Murine Ommaya Xenograft-model om direct-gerichte therapie van leptomeningeale ziekte te bestuderen

Hier presenteren we een tumortransplantatieprotocol voor de karakterisering van tumor-inherente en periferie-afgeleide tumor-geïnfiltreerde lymfocyten in een muistumormodel. Specifieke tracering van de instroom van van de ontvanger afgeleide immuuncellen met flowcytometrie onthult de dynamiek van de fenotypische en functionele veranderingen van deze cellen tijdens antitumorimmuunresponsen.

Tumortransplantatie voor het beoordelen van de dynamiek van tumorinfiltrerende CD8 + T-cellen bij muizen

Dit artikel beschrijft een workflow van technieken die worden gebruikt voor het testen van nieuwe kandidaat-mediatoren van melanoommetastase en hun werkingsmechanisme (s).

Een robuust ontdekkingsplatform voor de identificatie van nieuwe mediatoren van melanoommetastase

Het protocol presenteert een kankerimmunotherapiemodel met behulp van celgebaseerde tumorvaccinatie met Flt3L-tot expressie brengend B16-F10 melanoom. Dit protocol demonstreert de procedures, waaronder de voorbereiding van gekweekte tumorcellen, tumorimplantatie, celbestraling, meting van tumorgroei, isolatie van intratumorale immuuncellen en flowcytometrie-analyse.

Experimenteel melanoom immunotherapiemodel met behulp van tumorvaccinatie met een hematopoëtisch cytokine

Dit protocol beschrijft de orthotope implantatie van kankercellen van patiënten in de blindedarmwand van immunodeficiënte muizen. Het model recapituleert gevorderde uitgezaaide ziekte van colorectale kanker en maakt de evaluatie van nieuwe therapeutische geneesmiddelen mogelijk in een klinisch relevant scenario van long- en levermetastasen.

Orthotope implantatie van patiënt-afgeleide kankercellen bij muizen recapituleert gevorderde colorectale kanker

De hier gepresenteerde experimentele opzet biedt een bruikbaar voortplantingsmodel voor de studies van antigeenspecifieke CD8+ T-cellen tijdens lymfekliermetastase (LN), waarbij de verstoring van CD8+ T-cellen van omstanders wordt uitgesloten.

Drainerend lymfekliermetastasemodel voor het beoordelen van de dynamiek van antigeenspecifieke CD8+ T-cellen tijdens tumorigenese

We beschrijven een methode om tumor-infiltrerende lymfocyten (TIL's) van muizen te gebruiken door middel van flowcytometrie voor adoptieve celoverdracht. Dit protocol heeft tot doel de specifieke cytotoxiciteit van TIL's tegen tumoren in een syngene alvleesklierkanker muismodel te verifiëren en inzicht te verschaffen in de ontwikkeling van adoptieve celtherapieën voor alvleesklierkanker.

Op flowcytometrie gebaseerde isolatie en therapeutische evaluatie van tumor-infiltrerende lymfocyten in een muismodel van alvleesklierkanker

Leer een muismodel voor longmetastasen en adoptieve CTL-overdracht om immunotherapie in vivo te evalueren. Deze methode kwantificeert tumorknobbels met Indiainkt voor effectiviteitsanalyse.

Experimentele metastase en CTL adoptieve overdracht Immunotherapie Muis Model

Meer video's verkennen