Experimentele metastase en CTL adoptieve overdracht Immunotherapie Muis Model

Het algemene doel van deze procedure is om de effectiviteit van tumor-specifieke T-cel adoptieve transfer immunotherapie in vivo te onderzoeken. Dit wordt eerst bereikt door tumorcellen via injectie in de laterale staartvene in muizen te transplanteren om longmetastasen te induceren. De tweede stap van de procedure is het behandelen van de tumordragende muizen met tumor-specifieke cytotoxische T-lymfocyten CTLs.

De laatste stap is het gebruik van India-inkt als middel om tumorknopen te visualiseren en te kwantificeren. Uiteindelijk kunnen resultaten worden behaald die de CIE van verschillende behandelingen laten zien door de tumoromvang te meten en het aantal tumorknopen te kwantificeren. Hallo, mijn naam is Mary Zimmerman en ik ben lid van het lab van Dr. Kevin Lu bij het Medical College of Georgia.

Hallo, mijn naam is Shelene Hu. Ik ben een tweedejaars student en ik werk ook in het laboratorium van Dr. Lou. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van traditionele methoden, zoals overlevingscurves, is dat deze procedure zowel kwalitatief als kwantitatief is. De implicaties van deze technieken kunnen worden uitgebreid naar cancertherapie, omdat het adaptieve T-cel-immunotherapie bij menselijke kankerpatiënten nabootst.

Laten we beginnen. Zaai de dag vóór de injecties van de tumorcellen één T75-fles met maximaal 1 × 10⁷ CMS-4-cellen in 10 ml RPMI-medium met 10% serum. Om snelgroeiende tumorcellen te verkrijgen, worden deze de nacht vóór de dag van de injectie geïncubeerd bij 37 °C.

Verwijder het medium en spoel de cellen één keer met PBS, oog vervolgens de tumorcellen met 0,05%trypsine EDTA gedurende vijf minuten bij 37 °C. Stop de reactie met 10 ml RPMI-medium met 10%serum. Overbreng de cellen naar een conische buis.

Centrifugeer de cellen gedurende drie minuten bij 1300 RPM in een val legend RT-centrifuge. Verwijder bij kamertemperatuur het supernatant, resuspendeer de cellen in 10 milliliter verse one XHB Ss om te wassen. Centrifugeer vervolgens opnieuw en resuspendeer op dezelfde wijze.

Tel de tumorcellen met een hemo.Cytometer. Verdun de cellen in HBSS zodat de cellen die nodig zijn voor elke injectie opnieuw worden gesuspendeerd. Verwarm de zes tot acht weken oude B SEA-muizen in een bekerglas, ondergedompeld in warm water, in een totaal volume van 100 µL.

Om de staartvene te dilateren, plaatst u de muis in een staartvene-fixateur op de werkbank. Gebruik een microspuit om 100 microliters tumorcellen in de laterale staartvene te injecteren. Gebruik een aseptische techniek om infectie na injectie te voorkomen.

Oefen lichte druk uit op de injectieplaats tot de bloeding is gestopt. Plaats de muis terug in de kooi en laat de tumor groeien tot het gewenste stadium. Pipetteer op de dag van de overdracht op en neer om de voorbereide gezuiverde cytotoxische T-lymfocyten of CTL's opnieuw te suspenderen.

Breng, zoals in de tekst beschreven, alle cellen van één plaat over naar een conische buis van 15 milliliter, waarbij het volume niet meer dan twee derde van de buis mag overschrijden. Plaats een steriele Pasteur-pipet in de conische buis en voeg lymfocyten-scheidingsmedium of LSM toe onder de cellen tot het totale volume bijna 14 milliliter bedraagt.

Zorg ervoor dat de lagen niet worden verstoord. Centrifugeer bij 2000 RPM gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Gebruik de rem niet om de rotor na het centrifugeren te vertragen; overbreng de CTL's naar een nieuwe conische buis van 15 milliliter.

Voeg HBSS toe tot een volume van ongeveer 10 milliliters om te wassen. Centrifugeer de cellen bij 1300 RPM gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Resuspendeer in HBSS tot de vereiste celdichtheid voor injecties.

Houd het totale volume per injectie op 100 microliters. Gebruik dezelfde staartinjectietechniek als eerder in deze video getoond. Om de CTL's in tumordragende muizen te injecteren, plaatst u de muis terug in de kooi en laat u de CTL's reageren met de tumor.

Muizen worden gewoonlijk 14 tot 21 dagen na de CTL-behandeling geofferd voor analyse. Om longmetastasen te visualiseren, wordt een geofferde muis op de rug op een piepschuimplaat geplaatst. Zet de poten vast om een onbelemmerde toegang tot de trachea te garanderen.

Sproei de ventrale zijde in met 70%ethanol, beginnend vanaf het midden van het abdomen. Gebruik een schaar om langs de middellijn door de ribbenkast en omhoog richting de speekselklieren te snijden. Leg de trachea vrij.

Gebruik een pincet om het weefsel rondom de trachea te verwijderen. Plaats een pipetpunt van 200 µL onder de trachea terwijl u de punt met één hand vasthoudt. Til de trachea voorzichtig op en weg van het lichaam.

Draai het platform 180 graden. Gebruik een spuit van 50 milliliter om India-inkt via de trachea in de longen te injecteren. Blaas de longen volledig op met inkt totdat u een sterke weerstand voelt.

Gebruik een schaar om de trachea door te snijden. Schuif een pincet onder de longen en til deze uit de muis. Spoel de longen kort af in een bekerglas van één liter met water in een chemische zuurkast.

Overbreng de longen naar een glazen installatie met vijf milliliters FTI-oplossing. Het tumorweefsel zal zichtbaar worden als witte knobbels op de zwarte longen. Na enkele minuten kunnen de tumoren worden geteld en kunnen ze onbepaald bewaard worden in de FTI-oplossing.

Longen van muizen getransfecteerd met mammaire carcinoom. Cellijn 4T1 vertoont witte vlekken die wijzen op tumoren. Muizen getransfecteerd met een IRF8 dominant negatieve mutant K79E vertonen het verhoogde metastatische potentieel van tumorcellen.

Deze afbeeldingen tonen een histologische analyse van de effectiviteit van immunotherapie via adoptieve transfer van CTL's. Tumordragende muizen die waren geïnjecteerd met zoutoplossing vertoonden zes dagen later meerdere tumoren, aangegeven door de pijlen. Muizen die waren geïnjecteerd met tumorspecifieke T-cellen vertoonden daarentegen een afname van het aantal tumoren in hetzelfde experiment.

Behandeling met Indische inkt biedt een eenvoudigere manier om de effectiviteit van adoptieve overdracht van CTL's te meten. Hier maken de witte tumorknobbels op de tumorhoudende longen deze duidelijk onderscheidbaar van longen die succesvol een adoptieve overdracht van CTL's hebben ondergaan; het tellen van de knobbels maakt een mate van kwantificering mogelijk die met histologie niet haalbaar is. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden de muizen op te warmen voor eenvoudigere en nauwkeurigere injecties in de staartвена.

Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe de werkzaamheid van de behandeling kan worden beoordeeld via deze eenvoudige procedure om de tumorgrootte en het aantal tumoren te kwantificeren. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.