Name: Generatie van transgene C. elegans Door biolistische Transformatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-23T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Leer biolistische transformatie om transgene C. elegans te genereren voor genregulatieonderzoek. Deze methode biedt een effectief alternatief voor micro-injectie bij het creëren van transgene wormlijnen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door zaad middelen van de universiteit van Pittsburgh en de NIH subsidie ​​AG028977 naar ALF

Overzicht Traditioneel transgene wormen werden gegenereerd door microinjecting transgen DNA in de C. elegans kiembaan 1,2,3,4. Hoewel succesvol, deze aanpak vereist gespecialiseerde apparatuur en de ontwikkeling van ervaring met worm anatomie en de micro-injectie techniek. Meer recent biolistische bombardement is ontwikkeld als een alternatieve benadering die DNA-gecoate gouddeeltjes gebruikt om vreemd DNA te introduceren in de geslachtscellen 5,6. Deze aanpak vergt minder tijdsinvestering in termen van de praktijk om succesvol te worden. De biolistische bombardement van C. elegans om transgene wormen genereren heeft een lage efficiëntie op het niveau van de individuele worm, zodat succes vereist een grote hoeveelheid dieren. Deze kunnen worden gekweekt op verschillende manieren, maar we gebruiken ei platen om het werk en het aantal betrokken platen te verminderen. Ons protocol begint met de voorbereiding van de ei-platen en wormen en vervolgens richt zich op het bombardement protocol met behulp van de Bio-Rad PDS-1000/He Hepta System. We passen ons protocol in een deel van het werk van de Berezikov et al. 7. Met bombardement, is de unc-119-gen doorgaans gebruikt als een marker voor transgene dieren. Worm stammen dragen deze mutatie zijn sterk ongecoördineerd en nauwelijks bewegen, zijn Dumpy in verschijning, en zijn niet in staat om Dauer larven 8 te vormen. Het Dauer is een alternatieve larvale stadium die wordt gebruikt om de ontwikkeling vertraging van een reproductieve volwassen onder ongunstige omstandigheden, en de inwerkingtreding van Dauer wordt geregeld door meerdere genen 9. Verschillende stammen het dragen van de unc-119-gen zijn verkrijgbaar bij de C. elegans Genetics Center (CGC, Minneapolis, MN). De oorspronkelijke DP38 stam (unc-119 (ED3)) draagt ​​ook een onafhankelijke Dauer-formatie constitutieve (daf-c) mutatie die van invloed kunnen stroomafwaarts experimenten. Een aantal laboratoria hebben outcross deze mutatie, en de HT1593 stam is verkrijgbaar bij de CGC. We vinden dat transgene dieren wat gemakkelijker te identificeren met de DP38-stam en hebben de neiging om deze stam te gebruiken voor het creëren van transgene dieren. Indien nodig maken we gebruik van HT1593 om de transgene wormen te kruisen met de DAF-c mutatie te verwijderen. Aan de DP38 wormen om te groeien is een van de traagste stappen in het protocol, dus houden we een voorraad van groeiende platen, terwijl de voorbereiding van de transgenen. Expressie van de UNC-119 marker, samen met het gen van interesse maakt een eenvoudige identificatie van de dieren de uiting van de transgen gebaseerd op redding van de normale beweeglijkheid en de lichaamsgrootte 5. De UNC-119 gen kan worden verkregen uit verschillende bronnen, en vectoren met behulp van de unc-119 genomisch DNA, unc-119 promotor en cDNA, en de genomische DNA voor de kleinere C. briggsiae gen worden gebruikt 8,10. We hebben onlangs beschreef een eenvoudig protocol om een unc-119 cassette toe te voegen aan een plasmide dat een ampicilline resistentie-gen door homologe recombinatie 11 en een methode om worm fosmids wijzigen om de unc-119 gen dragen door Cre-lox recombinatie voor het genereren van transgene dieren 12. De plasmiden zijn verkrijgbaar bij Addgene Inc (Cambridge, MA). Terwijl de inspanning die betrokken zijn bij het uitvoeren van een enkele bombardement is aanzienlijk, maar beheersbaar, de extra werkzaamheden in verband met het uitvoeren van meerdere bombardementen op een enkele dag is minimaal. Daarom zijn wij regelmatig cluster voor de productie van transgene wormen aan het werk betrokken zijn bij het genereren van iedere daling. 1. Ei Plate Voorbereiding De UNC-119 mutant wormen zijn moeilijk te op de standaard NGM platen te groeien, want met hun verminderde mobiliteit hebben ze de neiging om te verhongeren op delen van een plaat, terwijl andere delen van de plaat bevatten nog steeds eten. Ei platen op te lossen dit probleem op als de dikke laag op voedsel ei platen maakt unc-119 wormen gemakkelijker kruipen en over te nemen al de plaat 7. Het ei platen hebben ook het voordeel van ondersteuning van de groei van een groot aantal wormen, zodat er minder platen nodig zijn 13. Meestal 5 ei borden voldoende zijn om wormen te kweken voor een bombardement. Het onderstaande recept maakt ongeveer 50 platen, maar kan worden gehalveerd om minder indien gewenst. Het ei platen kunnen gemakkelijk besmet raken, zodat we zowel de antibiotica en antimycotica gebruik in de platen en alleen gebruik maken van eieren die door hypochloriet behandeling voor het zaaien van de platen. Dag 1: <ol><li> Bereid LB (400 ml) in een 500ml fles. Autoclaaf voor 20min. </li><li> Giet ~ 50 10 cm NGA platen met behulp van 1 liter NGA met 2% agar. We voegen nystatine 10 ml per liter en streptomycine tot 200 ug / ml 13. </li><li> Grow een 40 ml &#39;s nachts de cultuur van de OP50-1 in LB met 200 ug / ml streptomycine. Deze soort is bestand tegen streptomycine en beschikbaar bij CGC. </li><li> Autoclaaf een 500ml fles voorvolgende dag. </li></ol> Dag 2: <ol><li> Afzonderlijke dooiers van 10 kippeneieren in de steriele fles. We maken gebruik van een dooier separator (verkrijgbaar bij winkels voor huishoudelijke artikelen, waaronder Target). Shake. </li><li> Breng het volume op 400 ml met LB. Schudden </li><li> Incubeer bij 60 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Afkoelen tot kamertemperatuur. </li><li> Voeg 40ml van de OP50-1. Schudden </li><li> Verdeel 5-8 mL van het mengsel per plaat. </li><li> Laat platen een nacht af te wikkelen bij kamertemperatuur. </li></ol> Dag 3: <ol><li> Giet de overgebleven vloeistof uit platen. Laat met deksel drogen op bij kamertemperatuur gedurende de nacht. </li></ol> Dag 4: <ol><li> Doe platen in een doos of een plastic zak en bewaar bij 4 ° C totdat het nodig is. Deze platen lijken op OK om te gebruiken voor 1-2 maanden. </li></ol> 2. Zaaien Egg Platen <ol><li> Vouw de DP38 wormen op 6 cm NGA platen door toevoeging van geconcentreerde OP50 de laatste tijd uitgehongerd platen. Voor een enkele bombardement, maken we gebruik ~ 6 kleine platen om zaad 5 ei platen. Voor meerdere bombardementen, gebruiken we de kleine plaatjes om in plaats daarvan zaad 2 verrijkt pepton borden voor het zaaien het ei platen. </li><li> Isoleer eieren van de DP38 wormen via het gebruik van hypochloriet 13,14. Resuspendeer de eieren in steriele S-basale of M9 buffers 13,14. </li><li> Voeg de eieren (&gt; 10.000 per plaat) naar het juiste aantal eieren platen. Groeien de wormen op ei-platen bij 20 ° C gedurende 7-10 dagen om te gebruiken voor bombardement. De platen zijn klaar voor gebruik zodra de wormen zijn begonnen met het eten uit de platen. Deze platen zijn echt moeilijk te verhongeren en groeiende voor langere looptijden zullen worm rendement te verhogen. </li></ol> Bombardement Wij bereiden de goudvoorraad van tevoren en bewaar deze opgeslagen bij 4 ° C voor gebruik. Ook nodig zijn, zijn onbevlekt en gevlekte 10 cm NGA platen. De onbevlekt platen moeten goed worden gegoten van te voren en liet goed laten drogen om de absorptie van de vloeistof toegevoegd met de wormen te vergemakkelijken. Op de dag van het bombardement, we wassen de wormen dan eerst beginnen met het voorbereiden van de DNA-gecoate gouddeeltjes. Dan voegen we de wormen aan het onbevlekt NGA platen en afwerking wassen van de gouddeeltjes en over te dragen naar de macrocarriers. Goud deeltje voorbereiding: <ol><li> Weeg 60 mg van goud deeltjes in een 1.7mL buis en genieten in 70% ethanol voor 15min. Spin kort voor het neerslaan van de gouddeeltjes. </li><li> Was drie maal in steriel water en de spin kort elke keer om het goud te verzamelen. </li><li> Resuspendeer de goud in 1 ml van 50% steriele glycerol. Dit is de voorraad goud deeltje oplossing en kan worden opgeslagen voor maanden bij 4 ° C. </li></ol> Worms: <ol><li> Drijven de DP38 wormen uit het ei platen met S-basale of M9 buffer en overbrengen naar een 50 ml conische buis. </li><li> Houd de buizen op de bank totdat de wormen in de bodem. Dan aspireren de buffer en voeg verse S-basale of M9. Was 2 of 3 keer, tot de buffer is relatief vrij van puin. Houd de wormen in deze stap totdat het DNA-coating is voltooid. </li><li> Aspireren en laat ca. 2-3 ml van wormen in buffer per bombardement. Transfer naar een 10 cm onbevlekt NGA plaat op ijs. Het is belangrijk dat het minimaliseren van de overgedragen volume als de NGA plaat moet volledig drogen voordat bombardement. Zorg ervoor dat u het gehele oppervlak van de plaat uit met de wormen. </li><li> Laat plaat te drogen op het ijs. Het ijs wordt voorkomen dat de wormen uit klonteren tijdens het drogen. </li></ol> Deze stap is belangrijk: de plaat moet droog zijn en de wormen gelijkmatig verspreid op de NGA plaat. Houd de wormen op ijs verhindert hen te bewegen op het bord en aggregeren in stapels. DNA voorbereiding (voor een bombardement): <ol><li> Meng in een 1.7mL buis: <ul><li> 50μl gouddeeltjes. Resuspendeer goed voor het toevoegen. </li><li> 50μl DNA (10-15 ug). We zien weinig verschil tussen circulair of lineair DNA. Meestal gebruiken we Qiagen midiprep cartridges voor DNA-zuivering (Qiagen Inc, Valencia, CA). </li><li> 50μl 2.5M CaCl 2. Deze oplossing is stabiel gedurende enkele weken bij kamertemperatuur. </li><li> 20μl 0,1 M spermidine. De spermidine is instabiel in waterige oplossing. Wij maken 70μl spermidine aliquots en bewaar bij -20 ° C. We dan 1 ml water toe te voegen recht voor gebruik om een ​​0,1 M oplossing te verkrijgen. Deze oplossing moet vers worden bereid voor elke bombardement. We meestal vortex het goud deeltjes in een 1.7mL buis bij een lage snelheid en voeg dan de CaCl 2, DNA en spermidine / protamine druppelsgewijs tijdens vortexen. Voor de mensen die zijn getransfecteerd met calciumfosfaat deze techniek vertrouwd is. We hebben tevens gebruikt protamine in plaats van spermidine met zeer goede resultaten 15. We bereiden een verse oplossing (1mg/ml) in water en onse 50μl in plaats van de 20μl van spermidine. Als we gebruik van protamine, we meestal uitbroeden van het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten in plaats van het op ijs. Protamine hoeft niet te worden bewaard bevroren en is een poeder in plaats van een vloeistof. </li></ul></li><li> Incubeer dit mengsel op ijs gedurende 30 minuten, en periodiek te mixen om de goud deeltjes in suspensie te houden. Vervolgens kort draaien en zuig het supernatant. </li><li> Was met 300μl 70% ethanol. Spin kort. </li><li> Wassen met 1 ml 100% ethanol. Spin kort. </li><li> Resuspendeer in 170μl 100% ethanol. </li></ol> Voorbereiding van de macrocarriers: <ol><li> Spoel 7 macrocarriers (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) in 2-propanol. Leg ze op zijdepapier en laat ze drogen op kamertemperatuur. </li><li> Voeg 20μl van DNA / goud mengsel op het midden van elke macrocarrier. Zorg ervoor dat u vortex net voor pipetteren om het goud in suspensie te houden. </li><li> Laat de ethanol verdampen. </li></ol> 3. Bombardement Zorg ervoor dat u een blanco bombardement uit te voeren voordat het experiment om helium spoelen door het systeem. <ol><li> Zet vacuümpomp en sluit vacuümpomp val. We maken gebruik van een olie-vrije vacuümpomp. </li><li> Zet helium tank. Controleer of de druk ≥ 2200psi. </li><li> Natte breekplaat (1350 psi) in 2-propanol, het plaatsen in het behoud cap voor hepta adapter. </li><li> Schroef adapter in PDS-1000-systeem en draai met de bijgeleverde momentsleutel. </li><li> Plaats de 7 macrocarriers in de houder en plaats ze met de bijgeleverde tool. Zet dan een hepta stop scherm en de bodem op aan de houder. Flip de houder over en leg ze op de tweede plank van boven. Het goud gevlekte zijde van de macrocarriers moet naar beneden op dit punt. </li><li> Lijn de gaten in de bovenkant van de macrocarrier houder met de uitlaten van de hepta adapter. </li><li> Plaats de NGA plaat gecoat met wormen (deksel) op de onderste plank in bombardement kamer. </li><li> Volledig open het vacuüm debiet knop van de PDS-1000. Druk op vac knop totdat kamer bereikt 26 Hg. Vervolgens overschakelen naar positie om het vacuüm te behouden vast te houden. </li><li> Houd het vuur ingedrukt totdat schijf breuken. Dit zal gebeuren wanneer de druk bereikt 1350psi. Soms is dit duurt 50 tot 20 seconden voor te komen. Laat de knop los. </li><li> Laat vacuüm van kamer (vent positie), en verwijder plaat. </li><li> Draai vacuüm en helium uit. </li><li> Brand meerdere keren totdat de lijn bevat geen helium (helium meter moet 0 psi mark). </li><li> Zet de PDS-1000-systeem. </li></ol> Worm herstel na bombardement: <ol><li> Laat de gebombardeerd plaat bij 20 ° C gedurende 20 minuten. </li><li> Drijven de wormen van de plaat met 10 ml S-basale of M9 buffer. </li><li> Zet 0,5 ml wormen op 20 - 10 cm gespot NGA platen. </li><li> Laat bij 20 ° C of kamertemperatuur (22-24 ° C) voor ongeveer 2 weken voor het controleren op wormen gered. </li><li> Scherm voor de wormen met de unc-119 (+) fenotype met een dissectie microscoop. De optimale tijd voor screening is na de platen hebben honger, omdat de geredde wormen hebben te overleven voordeel ten opzichte van niet-gered wormen. </li><li> Het genereren van een individuele lijn van elk 10 cm bord dat de geredde wormen bevatten. </li></ol> 4. Representatieve resultaten Het succes van het protocol met betrekking tot het verkrijgen van transgene dieren is afhankelijk van de specifieke transgen. Voor de promotor: GFP reporter transgenen we hebben verkregen tot 20 lijnen. Een typisch resultaat is 30 tot 10 lijnen. Tot 30% van de transgene lijnen zijn geïntegreerd lijnen, maar dit is willekeurig en wij zullen meerdere bombardementen uitvoeren op een enkele dag als een geïntegreerde lijn is in het bijzonder gewenst is.

<ol><li>Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEvans%2C+TC+%22Wormbook%22">Wormbook</a>. , 1-15 (2006).</li>
<li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA transformation.</a> Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).</li>
<li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+in+C.elegans%3A+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).</li>
<li>Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+low-copy+integrated+transgenic+lines+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 157, 1217-1226 (2001).</li>
<li>Wilm, T., Demel, P., Koop, H. U., Schnabel, H., Schnabel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ballistic+transformation+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Ballistic transformation of Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 229, 31-35 (1999).</li>
<li>Berezikov, E., Bargmann, C. I., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+gene+targeting+in+Caenorhabditis+elegans+by+biolistic+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Homologous gene targeting in Caenorhabditis elegans by biolistic transformation.</a> Nucleic Acids Res. 32, e40-e40 (2004).</li>
<li>Maduro, M., Pilgrim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+cloning+of+unc-119%2C+a+gene+expressed+in+the+Caenorhabditis+elegans+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system.</a> Genetics. 141, 977-988 (1995).</li>
<li>Riddle, D. L., Swanson, M. M., Albert, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interacting+genes+in+nematode+dauer+larva+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interacting genes in nematode dauer larva formation.</a> Nature. 290, 668-671 (1981).</li>
<li>Maduro, M., Pilgrim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+function+and+expression+of+unc-119+from+two+Caenorhabditis+species+despite+divergence+of+non-coding+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Conservation of function and expression of unc-119 from two Caenorhabditis species despite divergence of non-coding DNA.</a> Gene. 183, 77-85 (1996).</li>
<li>Ferguson, A. A., Fisher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrofitting+ampicillin+resistant+vectors+by+recombination+for+use+in+generating+C.+elegans+transgenic+animals+by+bombardment%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">Retrofitting ampicillin resistant vectors by recombination for use in generating C. elegans transgenic animals by bombardment.</a> Plasmid. 62, 140-145 (2009).</li>
<li>Zhang, Y., Nash, L., Fisher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified%2C+robust%2C+and+streamlined+procedure+for+the+production+of+C.+elegans+transgenes+via+recombineering%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A simplified, robust, and streamlined procedure for the production of C. elegans transgenes via recombineering.</a> BMC Dev Biol. 8, 119-119 (2008).</li>
<li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+culture+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Basic culture methods.</a> Methods Cell Biol. 48, 3-30 (1995).</li>
<li>Sulston, J. E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSulston%2C+JE+%22The+nematode%2C+Caenorhabditis+elegans%22">The nematode, Caenorhabditis elegans</a>. Wood, W. B. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 587-606 (1988).</li>
<li>Sivamani, E., DeLong, R. K., Qu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protamine-mediated+DNA+coating+remarkably+improves+bombardment+transformation+efficiency+in+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Protamine-mediated DNA coating remarkably improves bombardment transformation efficiency in plant cells.</a> Plant Cell Rep. 28, 213-221 (2009).</li>
<li>Johnston, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biolistic+transformation%3A+microbes+to+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Biolistic transformation: microbes to mice.</a> Nature. 346, 776-777 (1990).</li>
</ol>

Biolistische bombardement is een eenvoudige methode om vreemd DNA te introduceren in vele organismen, met inbegrip C. elegans 1,5,6,7,16. Het vertrouwt op gouddeeltjes het vormen van een complex met DNA in de aanwezigheid van CaCl 2. Kationische polyaminen, zoals spermidine, beschermen DNA van nuclease degradatie in vivo. Omdat spermidine is een labiel molecule, is het belangrijk om het op te slaan in kleine porties bij -20 ° C, en de oplossing te maken vlak voor het uitvoeren van het bomb...

The volume for a solution in, <a href="http://www.jove.com/video/2090">Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation</a>, was incorrect.

Erratum: Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

<table><tbody><tr><td>Gouddeeltjes</td><td>Inbio gold</td><td>BD021</td><td>1micron</td></tr><tr><td>Midiprep-kit</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td></td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4139</td><td></td></tr><tr><td>Protamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4505</td><td></td></tr><tr><td>Macrocarriers</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2335</td><td></td></tr><tr><td>PDS-1000/He Hepta System</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2257</td><td></td></tr><tr><td>Scheurdisk</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2330</td><td></td></tr><tr><td>Nystatine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1638</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycine</td><td>MP Biomedicals</td><td>100556</td><td></td></tr></tbody></table>

generatie van transgene c. elegans door biolistische transformatie

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Het aantal laboratoria met behulp van de vrij levende nematode C. elegans groeit snel. De populariteit van deze biologische model wordt toegeschreven aan een snelle generatietijd en korte levensduur, makkelijk en goedkoop onderhoud, volledig gesequenced genoom, en het aanbod van RNAi middelen en mutant dieren. Bovendien, de analyse van de C. elegans genoom onthulde een grote overeenkomst tussen wormen en hogere gewervelde dieren, wat suggereert dat het onderzoek in wormen kunnen een belangrijke aanvulling op studies uitgevoerd geheel muizen of gekweekte cellen. Een krachtig en belangrijk onderdeel van worm onderzoek is de mogelijkheid om transgene dieren te gebruiken om gen-lokalisatie en functie te bestuderen. Transgene dieren kunnen worden gemaakt ofwel via micro-injectie van de worm kiembaan of door het gebruik van biolistische bombardement. Bombardement is een nieuwere techniek en is minder bekend een aantal laboratoria. Hier beschrijven we een eenvoudig protocol om transgene wormen genereren door biolistische bombardement met gouddeeltjes met behulp van de Bio-Rad PDS-1000-systeem. In vergelijking met DNA micro-injectie in de hermafrodiet kiembaan, dit protocol is het voordeel dat er geen speciale vaardigheden van de operator met betrekking tot het identificeren van worm anatomie of het uitvoeren van micro-injectie. Verdere meerdere transgene lijnen worden meestal verkregen uit een bombardement. Ook in tegenstelling tot micro-injectie, biolistische bombardement produceert transgene dieren met zowel extrachromosomaal arrays en geïntegreerde transgenen. De mogelijkheid om geïntegreerde transgene lijnen te krijgen kan voorkomen dat het gebruik van mutagene protocollen aan buitenlandse DNA integreren. Concluderend kan biolistische bombardement een aantrekkelijke methode voor het genereren van transgene dieren, met name voor de onderzoekers niet geïnteresseerd in het investeren van de tijd en inspanning die nodig is om te worden bedreven in het micro-injectie.

Transgene wormen worden vaak gebruikt in<em&gt; C. elegans</em&gt; Onderzoek. Beschreven is een eenvoudige, maar effectieve, protocol om transgenen te introduceren in wormen met behulp van biolistische bombardement met DNA-gecoate gouddeeltjes. De inspanning betrokken en de resultaten van bombardement gunstig in vergelijking met micro-injectie voor het genereren van transgene dieren.

Generatie van transgene C. elegans Door biolistische Transformatie

Het aantal laboratoria dat de vrijlevende nematode C. elegans gebruikt, groeit snel. De populariteit van dit biologische model wordt toegeschreven aan een snelle ...

Het algemene doel van deze procedure is het genereren van transgene wormen via biotische transfectie of een gene gun. Eerst worden grote hoeveelheden wormen gekweekt, vervolgens worden gouden deeltjes gecoat met DNA, waarna de wormen worden gebombardeerd; de transgene nakomelingen worden vervolgens geïsoleerd en gered, waarna nieuwe transgene lijnen worden opgezet. Hallo, ik ben Daniel Owa van het laboratorium van Dr. Alfred Fisher van de afdeling Geneeskunde aan de Universiteit van Pittsburgh.Vandaag laten we u een procedure zien voor het genereren van transgene wormen. We gebruiken deze procedure om genregulatie door transcriptiefactoren te bestuderen. Laten we beginnen.De bereiding van de eierplaten begint met het gieten van een mengsel van 2% agar in NGA-medium, aangevuld met nystatine en streptomycine. Laat de platen van 10 tot 50 centimeter drogen bij kamertemperatuur. Autoclaveer vervolgens 400 milliliters LB-medium in een fles van 500 milliliter en 40 milliliters LB-medium in een kolf van 250 milliliter.Autoclaveer daarnaast een lege fles van 500 milliliter gedurende 20 minuten. Voeg na het autoclaven streptomycine toe aan de 40 milliliters LB-medium tot een eindconcentratie van 200 micrograms per milliliter. Inoculeer vervolgens met de e coli-stam.OP 50 dash one. Laat de cultuur overnacht groeien bij 37 °C. Plaats de volgende dag de eidooiers van 10 kippeneieren in de steriele fles van 500 ml.Vul het volume aan tot 400 milliliters met LB-medium en schud tot een uniforme oplossing is gevormd. Incubeer de oplossing gedurende één uur bij 60 degrees Celsius. Zodra het LB-mengsel is afgekoeld tot kamertemperatuur, voegt u de 40 milliliters ELI-cultuur toe aan de fles en schudt u deze.Pipette vervolgens 5 tot 8 ml van de cultuur op de voorbereide NGA-platen. Laat deze de volgende dag een nacht drogen bij kamertemperatuur. Giet eventueel resterende vloeistof af en laat nog een nacht drogen bij kamertemperatuur.Op dit punt kunnen de platen één tot twee maanden bij vier graden Celsius worden bewaard of direct worden geënt met wormen. Om een populatie DP 38 CL opnieuw uit te breiden, wordt een geconcentreerde e coli OP 50 op zes centimeter NGA-platen geplaatst die recentelijk uitgehongerde DP 38-wormen bevatten, waarna deze worden geïncubeerd. De wormen worden behandeld met een alkalische hypochlorietoplossing om de eitjes van de DP 38-wormen te isoleren.De procedure wordt beschreven in het bijbehorende protocol. Zodra de eitjes zijn geïsoleerd, worden deze gesuspendeerd in S-basil- of M9-buffers. Voeg meer dan 10.000 eitjes toe aan elke geprepareerde 10 centimeter eitjesplaat en laat de wormen zeven tot 10 dagen groeien bij 20 °C.Zodra de wormen zijn begonnen met het opeten van het voedsel, zijn de plaatjes klaar om te worden beschoten. Om gouddeeltjes met DNA te coaten voor het beschieten, voegt u 60 milligrams gouddeeltjes toe aan een 1,7 milliliter buisje. Voeg vervolgens 70% ethanol toe en laat het goud 15 minuten weken.Centrifugeer de buis kort om de gouddeeltjes te pelletteren. Giet de ethanol af. Was de gouddeeltjes vervolgens drie keer met steriel water.Resuspendeer het goud in één milliliter 50% steriele glycerol. De voorraadoplossing van goudpartikels kan maandenlang worden bewaard bij vier graden Celsius. Verzamel vervolgens de wormen door ze van de eipplaten te laten drijven met behulp van s basil- of M line-buffers.Breng ze vervolgens over naar een conische buis van 50 milliliter. Laat de wormen naar de bodem van de buis zakken. Aspireer vervolgens alle buffer uit de buis, behalve twee tot drie milliliter, met behulp van de resterende buffer.Breng de wormen over naar een ongestreepte NGA-plaat van 10 centimeter die gelijkmatig op ijs is gekoeld. Verdeel de wormen over de gehele plaat. Laat de plaat vervolgens volledig op ijs drogen.Dit voorkomt dat de wormen gaan klonteren tijdens het droogproces. Het is belangrijk dat de wormen gelijkmatig verdeeld zijn en dat de plaat volledig droog is vóór de bombardementsprocedure. Om de met DNA gecoate goudpartikels voor te bereiden, voegt u 50 µL van de geresuspendeerde goudpartikels toe aan een 1,7 mL buisje.Centrifugeer de gouddeeltjes en verwijder het supernatant. Voeg vervolgens een mengsel toe van 10 tot 15 µg gezuiverd, circulair of gelineariseerd DNA van belang en 20 µL vers bereide 0,1 M spermidine. Voeg ten slotte, terwijl de buis voorzichtig wordt gevortext, 50 µL 2,5 M calciumchloride toe en incubeer het mengsel 30 minuten op ijs, waarbij periodiek wordt gemengd om de gouddeeltjes in suspensie te houden.Centrifugeer het mengsel van goudpartikels na 30 minuten. Aspireer kortstondig het supernatant en was met 300 µL 70% ethanol, gevolgd door 1 mL 100% ethanol; resuspendeer de met DNA gecoate goudpartikels tot slot in 170 µL 100% ethanol. Spoel voor elk bombardement zeven macrocarriers, die de goudpartikels zullen bevatten, in twee propanol en laat deze vervolgens drogen bij kamertemperatuur.Vortex het DNA-goudmengsel. Pipetteer vervolgens 20 µL op het midden van elke macro-carrier. Laat de ethanol verdampen.Plaats de scheurendisc in de Hector-adapter en bevestig de adapter in het bombardementsapparaat. Plaats vervolgens de zeven macro-carriers in de houder en gebruik het meegeleverde gereedschap om deze vast te zetten. Plaats daarna een Hector-stopscreen en de bodem op de houder.Draai de houder om, zodat de zijde met de gouden stippen van de macro-carriers naar beneden is gericht. Plaats deze vervolgens op de tweede plank van boven. Lijn de gaten aan de bovenzijde van de macro-carrierhouder uit met de uitlaten van de Hector-adapter.Verwijder het deksel van de met wormen beklede NGA-plaat en plaats deze op de onderste plank in de bombardementskamer. Draai de knop voor de vacuümstroomsnelheid volledig open en houd de vac-knop ingedrukt totdat de kamer een druk van 26 inches kwik bereikt. Zet vervolgens de schakelaar in de hold-positie. Om het vacuüm te behouden, houdt u de fire-knop ingedrukt totdat de schijf knapt.Dit zal gebeuren wanneer de druk 1.350 PSI bereikt en kan vijf tot 20 seconden duren. Laat de knop los, laat het vacuüm uit de kamer ontsnappen door over te schakelen naar de ontluchtingspositie en verwijder de plaat. Schakel het vacuüm in helium uit.Druk vervolgens enkele keren op de ontstekingsknop totdat de heliumleiding is schoongemaakt en de heliummeter 0 PSI aangeeft. Zet daarna het PDS 1000-systeem uit. Nu de wormen zijn getransformeerd, kunnen ze na het bombardement worden teruggewonnen en geïncubeerd.Plaats de plaat gedurende 20 minuten bij 20 °C. Laat de wormen vervolgens van de plaat drijven met 10 mL S basil of M nine buffer en inoculeer 20 10 cm gespotte NGA-platen met 0,5 mL van de wormen in buffer. Laat de platen daarna gedurende ongeveer twee weken op kamertemperatuur staan.Screen op herstel van het UNC-19-fenotype door het transgen en genereer één individuele lijn van elke plaat van 10 centimeter die geredde wormen bevat. Het succes van het protocol met betrekking tot het verkrijgen van transgene dieren hangt af van het specifieke transgen. Voor promoter GFP-reportertransgenen hebben we tot 20 lijnen verkregen.Een meer typisch resultaat is drie tot 10 lijnen. Tot 30% van de transgene lijnen zijn geïntegreerde lijnen, maar dit is willekeurig en we zullen meerdere bombardementen op één dag uitvoeren als een geïntegreerde lijn specifiek gewenst is. Er wordt een representatieve plaat van 10 centimeter getoond met 19 mutantwormen die zijn gered door transgene bombardement.De geredde wormen kunnen worden geïdentificeerd aan hun grotere omvang en aanzienlijk verbeterde mobiliteit ten opzichte van de niet-getransformeerden. Op één plaat bevonden zich 19 mutanten. Isolatie van geredde wormen die getransformeerd zijn met een far-one GFP-transgen resulteert in GFP-expressie.Dit transgen tot expressie van GFP sterk in de darm en hypodermis van transgene wormen. Dit specifieke transgen is geïntegreerd in het chromosoom van de worm en 100% van het nageslacht tot expressie brengt het transgen. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe biobalistisch bombardement van sea elegance wordt uitgevoerd bij deze procedure.Het is belangrijk om voldoende wormen te kweken en verse monsters te gebruiken. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

generation-of-transgenic-c-elegans-by-biolistic-transformation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video demonstreert de techniek van micro-injectie in de gonaden van C. elegans om transgene dieren te creëren.

Generatie van Stable transgene C. elegans Met behulp van micro-injectie

De mogelijkheid om transgenen te produceren...

De productie van C. elegans Transgenen via Recombineering met de GalK Selecteerbare marker

Deze video beschrijft de principes achter de RNAi-behandeling bij C. elegans en demonstreert een protocol om lin-35 in een transgene wormstam neer te slaan.

RNAi Plating voor C. elegans Feeding: Een techniek om doel dsRNA expressie te induceren in E. coli

Dit protocol beschrijft een snelle en materiaalbesparende procedure voor de integratie van transgene extrachromosomale arrays in het Caenorhabditis elegans genoom met behulp van ultraviolette (UV) bestraling. Bovendien is dit protocol bijzonder geschikt voor transgene lijnen die extrachromosomale arrays met een hoge snelheid overdragen.

Een snelle protocol voor de integratie Extrachromosomaal Arrays Met High Transmission Rate in de<em&gt; C. elegans</em&gt; Genome

C. elegans is meestal gekweekt op vaste agar platen of in vloeibare culturen bezaaid met E. coli. Om te voorkomen dat bacteriële bijproducten van verstorende toxicologische en nutritionele studies, hebben we gebruik gemaakt van een axenische vloeibaar medium, CeHR, te groeien en te synchroniseren een groot aantal wormen voor een reeks afgeleide toepassingen.

Kweken Caenorhabditis elegans In Axenische Liquid Media en Creatie van transgene Worms door bombardement met microdeeltjes

Dit protocol wordt beschreven hoe cellulaire om processen te bestuderen tijdens de cel lot conversie in Caenorhabditis elegans in vivo. Met behulp van transgene dieren, waardoor warmte-schok promotor gestuurde overexpressie van het neuron lot-inducerende transcriptiefactor CHE-1 en RNAi-gemedieerde uitputting van de regulering van de chromatine factor LIN-53 kiem naar neuron herprogrammering waarneembaar in vivo.<br...

Toepassing van RNAi en warmte-schok-geïnduceerde transcriptie Factor expressie te herprogrammeren kiemcellen aan neuronen in C. elegans

Hier presenteren we een methode om het genoom van C. elegans ingenieur met behulp van CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins en homologie afhankelijke reparatie sjablonen.

Een snelle en Facile pijpleiding voor het genereren van Genomic punt mutanten in C. elegans met behulp van CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

De functionele genomische toolkit voor de parasitaire nematoden Strongyloides stercoralis en Strongyloides ratti omvat transgenese, CRISPR/Cas9-gemedieerde mutagenese en RNAi. Dit protocol zal demonstreren hoe intragonadale micro-injectie kan worden gebruikt om transgenen en CRISPR-componenten in S. stercoralis en S. ratti te introduceren.

Het genereren van transgenen en knock-outs in strongyloides soorten door micro-injectie

Dit werk beschrijft een protocol voor het modulaire Tol2-transgenesesysteem, een gateway-gebaseerde kloonmethode om transgene constructies in zebravisembryo's te creëren en te injecteren.

Het Zebrafish Tol2-systeem: een modulaire en flexibele gateway-gebaseerde transgenesebenadering

Dit protocol beschrijft een RNA-interferentie en ChIP-test om de epigenetische overerving van RNAi-geïnduceerde uitschakeling en geassocieerde chromatinemodificaties in C. elegans te bestuderen.

Analyse van transgenerationele epigenetische overerving in C. elegans met behulp van een fluorescerende reporter en chromatine-immunoprecipitatie (ChIP)

Een CRISPR/Cas9 microinjectieworkflow voor endogene fluorescerende tagging in de Caenorhabditis elegans kiemlijn om homozygote knock-in-lijnen te verkrijgen voor in vivo eiwitlokalisatieanalyse.

CRISPR/Cas9-gemedieerde endogene fluorescerende tagging van kiemlijnspecifieke genen in Caenorhabditis elegans

Leer biolistische transformatie om transgene C. elegans te genereren voor genregulatieonderzoek. Deze methode biedt een effectief alternatief voor micro-injectie bij het creëren van transgene wormlijnen.

Generatie van transgene C. elegans Door biolistische Transformatie

Meer video's verkennen