Multicolor Time-lapse imaging van transgene zebravis: Visualizing netvlies Stem Cells geactiveerd door middel van gerichte neuronale cellen Ablation

De expressie van fluorescerende reporters in transgene dieren maakt het mogelijk om cellulaire reacties op experimentele manipulaties in levende ziektemodellen te volgen. Hier wordt selectief celverlies farmacologisch geïnduceerd in zebravis, waarbij multicolor confocale beelden met een hoge resolutie worden gemaakt. Beelden van de doelcellen en direct aangrenzende cellen worden vastgelegd voorafgaand aan, direct na en met tussenpozen na de behandeling met het medicijn; beeldanalyse demonstreert de activatie van endogene stamcelpopulaties en de daaropvolgende vervanging van de doelcellen tijdens de herstelfase.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de regeneratieve biologie, zoals wat de cellulaire en moleculaire mechanismen zijn die worden gebruikt om specifieke celtypen te regenereren. Begin met het overbrengen van transgene eitjes, verzameld na paringen, naar een Petrischaal met 0,3 x danio-oplossing op 16 uur na bevruchting. Voeg PTU toe om de tyrosinase-activiteit te remmen voordat er bewijs is van pigmentatie in het betreffende weefsel. Als het embryo niet albino is, worden de embryo's geïncubeerd bij 28,5 °C.

Zodra de reporters zichtbaar zijn, plaatst u de Petrischaal onder een fluorescente stereozoommicroscoop en sorteert u op de gewenste transgene expressie. Bereid vóór de beeldvorming een 0,5% low melt aeros montageoplossing in embryo-medium voor en bewaar deze bij 40 °C.

Voeg indien nodig trica en PTU toe. Meng voorzichtig en breng terug naar 40 °C. Anestheseer de vissen door ze te plaatsen in embryo-medium dat trica bevat.

Gedurende ongeveer drie minuten zullen de vissen niet meer reageren. Om de vissen met een micropipet te verplaatsen, zuigt u individuele vissen op in een afgeknotte pipetpunt in een volume van ongeveer 30 µL anesthetische oplossing. Keer vervolgens de pipet om en laat de vissen naar de bodem zakken.

Raak met de tip de monteeroplossing aan en laat deze door zwaartekracht overgaan. Zorg ervoor dat het agro niet wordt verdund, zodat het hergebruikt kan worden. Verwijder de resterende anesthesie-oplossing uit de micropipet.

Breng vervolgens met dezelfde tip de vis over naar een Petrischaal. Orienteer de vis voorzichtig in ongeveer 30 µL monteersolution, zodanig dat het interessegebied in het midden van de aeros-druppel ligt. Zorg ervoor dat de vis in de gewenste oriëntatie blijft totdat de aeros is gestold.

Indien gewenst kunnen meerdere vissen in één enkele Petrischaal worden gemonteerd. Nadat het aeros is gestold, worden de vissen naar de tafel van de confocale microscoop getransporteerd en wordt er voorzichtig embryo-medium met trica plus of minus PTU aan de schaal toegevoegd totdat de vissen volledig zijn ondergedompeld. Open de imaging-software en focus op het gebied van interesse voor een optimale beeldvorming van cellulaire en/of moleculaire details.

Gebruik in de software objectieven met een grote werkafstand en een hoge numerieke apertuur. Kies de juiste fluorescentie-instellingen uit de keuzelijst. Klik op de spectrale instelling en pas de emissiebereiken aan.

Om een schone scheiding van reportersignalen te verkrijgen en de signaal-ruisverhoudingen te maximaliseren. Selecteer het juiste objectief in het vervolgkeuzemenu om ervoor te zorgen dat eventuele door software gedefinieerde presets correct worden aangepast. Om de lasers te focussen en de vermogensniveaus in te stellen, selecteert u een output uit de opzoektabel die pixelsaturatie voor elk kanaal onthult.

Stel vervolgens de gevoeligheid van de detector in om de gewenste beeldkwaliteit te verkrijgen en verhoog geleidelijk het laservermogen totdat de beeldintensiteit acceptabel is. Vermijd pixelsaturatie in het interessegebied en houd de laserwaarden zo laag mogelijk om fotobleken en fototoxiciteit te beperken.

Controleer of elke laserlijn alleen een detecteerbaar signaal produceert in het juiste kanaal door de lasers handmatig aan en uit te schakelen terwijl alle beeldvormingskanalen worden gemonitord. Als er geen crosstalk zichtbaar is, kunnen alle kanalen gelijktijdig worden opgenomen. Kader vervolgens het gebied van interesse af met behulp van de zoom- en rotatiefuncties.

Stel vervolgens de scansnelheid en de beeldgrootte in; snellere scansnelheden minimaliseren de verblijftijd van de laser en verhogen de temporele resolutie. Stel de stapgrootte van de Z-dimensie in op basis van de experimentele behoeften. Hier wordt een stapgrootte van 10 microns gebruikt om zeven optische coupes van retinaweefsel te beelden.

Zodra de juiste instellingen zijn bepaald, worden de Zack-beelden opgenomen en opgeslagen. Ga vervolgens over naar de volgende vis. Seriële catch-and-release-beeldvorming kan worden uitgevoerd om cellulaire veranderingen over opeenvolgende dagen te volgen, volgens de instructies in het bijbehorende schriftelijke document.

Bij het uitvoeren van een multi-reporter imaging-experiment is het bij voorkeur gebruik te maken van fluorforen die spectraal goed gescheiden zijn, maar dat is niet altijd praktisch. Hier tonen we een eenvoudige methode voor beeldsubtractie met behulp van de open-source software ImageJ om fluorforen met overlappende excitatie- en emissieprofielen te scheiden. In ons geval betreft dit GFP en YFP.

De in deze video beschreven time-lapse imagingtechnieken zijn gebruikt om GFP-gelabelde retinale stamcellen te monitoren tijdens de ablatie en regeneratie van retinale bipolaire neuronen. Voor spectrale scheiding worden beelden verzameld met sequentiële imagingmodi en variabele instellingen van het barrièrefilter, waardoor overlappende fluoroforen respectievelijk onafhankelijk en gedeeltelijk gescheiden kunnen worden vastgelegd. Zodra de beelden zijn verkregen, wordt de ImageJ loci bio formas-import gebruikt om de beeldbestanden te openen en de importtool te starten. Sleep het betreffende bestand naar het ImageJ-venster.

Splits de kanalen in individuele stacks met behulp van het selectievakje 'split channels' in het importvenster om de plugin 'align three TP' te starten. Klik op plugins, vervolgens op align stacks en daarna op align three tp.

De stacks moeten worden uitgelijnd om een correcte aftrekking te garanderen. Selecteer de referentiestack in het eerste vervolgkeuzemenu en de niet-uitgelijnde stack in het tweede. Vink de vakjes use XY relative origin en use Z relative origin aan en klik op okay.

Klik op de knop voor volumeregistratie om het uitlijningsproces te starten. Er verschijnt een nieuw venster met de uitlijningsparameters. Klik op oké.

Deze sectie is geoptimaliseerd door de distributeur van de plug-in, waardoor geen wijzigingen noodzakelijk zijn. Wanneer het proces is voltooid, verschijnt er een venster met uitgelijnde stacks. Selecteer 'output' uit het uitgelijnde venster om het outputvenster te openen.

Dit venster is ook geoptimaliseerd en behoeft geen aanpassing. Klik op oké. Er verschijnt een nieuwe stack in de werkruimte met 'aligned' toegevoegd aan het einde van de bestandsnaam.

Om crosstalk te verwijderen met de image calculator, klikt u op process en vervolgens op image calculator. Selecteer de stack die moet worden afgetrokken in het dropdown-menu voor image one en de stack die voor de aftrekking wordt gebruikt. Selecteer in het dropdown-menu voor image two de optie subtract in het dropdown-menu voor de operatie en klik op okay.

Image J zal vragen om de stack te verwerken. Selecteer ja. Er verschijnt een nieuwe stack waarin de crosstalk tussen overlappende kanalen is verwijderd.

Voeg de stacks samen om dezelfde beeldstructuur te herstellen als vóór de uitlijning en subtractie. Door de samen te voegen kanalen te selecteren in het venster met kanaaltools, maakt de tool het mogelijk om maximaal vier stacks samen te voegen tot een hyperstack. Geef tot slot de kanalen kleur, pas de helderheid en het contrast aan en sla de bestanden op als tiffs om het doelgerichte verlies en de regeneratie van nitroreductase te bestuderen.

Retinale bipolaire cellen die M-cherry tot expressie brengen. Een tijdserie van confocale beelden werd gemaakt in individuele zebravis vóór de behandeling. Er is een mozaïekexpressie van een membraangebonden YFP-reporter in gecontroleerde bipolaire cellen, weergegeven in geel, en een nitroreductase-cherry-fusie-eiwit in getargete bipolaire cellen, weergegeven in rood.

Het membraangebonden CFP-transgen, weergegeven in cyaan, biedt contextuele informatie over de meeste andere retinalcellen voor extra duidelijkheid. Dezelfde afbeelding zonder het CFP-signaal wordt getoond na behandeling met metronidazol. De rode nitroreductase-expresserende bipolaire cellen gaan verloren, terwijl de gele gecontroleerde bipolaire cellen behouden blijven.

Dit demonstreert de zeer specifieke aard van deze ablatie-methodologie. Ter verduidelijking wordt opnieuw dezelfde afbeelding zonder CFP getoond. Wanneer metro NIAZ wordt verwijderd, keren de NTR-expresserende cellen hier terug.

Een voorbeeld van de G-F-P-Y-F-P-subtractiemethode wordt getoond in deze figuur met GFP-gelabelde Mueller-cellen. GL-cellen worden in het groen weergegeven en YFP-gelabelde bipolaire cellen in het paars. Overlap tussen deze twee resulteert in wit om de subtractie uit te voeren.

De GFP- en YFP-beelden moeten eerst worden uitgelijnd. Het aftrekkingsproces maakt het vervolgens mogelijk om YFP-gelabelde bipolaire cellen uit het GFP-beeld te verwijderen, zodat GFP-gelabelde Müller-cellen zuiver kunnen worden weergegeven en zwakkere Müller-cellen kunnen worden gedetecteerd. De overlap tussen zwakke Müller-cellen en met M-cherry gelabelde bipolaire cellen, weergegeven in het rood, kan nu worden geverifieerd.

De hier getoonde gegevens suggereren dat ablatie van bipolaire cellen muller glia aanzet om de verloren cellen te vervangen. Deze interpretatie is in overeenstemming met recente studies naar retina-regeneratie, waarin Mueller glia worden aangewezen als letsel-geïnduceerde progenitorcellen bij zowel zoogdieren als vissen. Deze techniek stelt onderzoekers in staat om mechanismen die de regeneratie van specifieke celtypen reguleren te onderzoeken door middel van visualisatie van stamcellen in zebravis.