Multicolor Time-lapse imaging van transgene zebravis: Visualizing netvlies Stem Cells geactiveerd door middel van gerichte neuronale cellen Ablation
September 20th, 2010
In deze video worden de technieken voor multicolor confocale time-lapse imaging en gerichte cel ablatie verstrekt. Time-lapse imaging wordt gebruikt om het gedrag van meerdere celtypen van belang te volgen In vivo. Gerichte cel ablatie vergemakkelijkt de studie neurale circuit functie en cel-specifieke neuronale regeneratie paradigma's.
Expressie van fluorescente reporteren in transgene dieren maakt het mogelijk om cellulaire reacties op experimentele manipulaties te volgen in levende ziektemodellen. Hier wordt selectieve celverlies farmacologisch geïnduceerd bij zebravis, hoge resolutie meerkleurig confocale. Afbeeldingen van de doelcellen en directe buren worden verworven vóór onmiddellijk na, en op gespreide intervallen na de behandeling met het medicijn. Beeldanalyse toont de activering van endogene stamcelpopulaties en daaropvolgende vervanging van doelcellen tijdens de herstelfase.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van regeneratieve biologie, zoals: Wat zijn de cellulaire en moleculaire mechanismen die worden gebruikt om discrete celtypen te regenereren? Begin door transgene eieren over te brengen die zijn verzameld uit paringen naar een petrischaal met 0,3 x danio-oplossing 16 uur na bevruchting. VOEG PTU toe om tyrosine ACE-activiteit te remmen vóór enig bewijs van pigmentatie in het weefsel van belang. Indien de embryo niet albinistisch is, incubeer de embryo's op 28,5 graden Celsius.
Zodra reporteren duidelijk zijn, plaats de petrischaal onder een fluorescente stereo zoommicroscoop en sorteer op gewenste transgene expressie. Voorafgaand aan beeldvorming. Bereid een 0,5% lage smelt aeros montageoplossing in embryomedium voor en bewaar deze op 40 graden Celsius.
Voeg trica en PTU toe indien nodig. Meng voorzichtig en breng terug naar 40 graden Celsius. Verdoof de vissen door ze in embryomedium met trica te plaatsen.
Gedurende ongeveer drie minuten worden de vissen niet meer responsief. Om aan te raken met een micropipet, trek individuele vissen in een bijgesneden pipetpunt in een volume van ongeveer 30 microliter anesthesieoplossing. Draai vervolgens de pipet om en laat de vissen naar de bodem zinken.
Raak de punt aan met de montageoplossing en laat ze door zwaartekracht overbrengen. Zorg ervoor dat de vissen in de gewenste oriëntatie blijven totdat de aeros gestold is.
Meerdere vissen kunnen indien gewenst in een enkele petrischaal worden gemonteerd. Nadat de aeros gestold is, verplaats de vissen naar de confocale microscoopfase en voeg voorzichtig embryomedium met trica plus of min PTU toe aan de schaal totdat de vissen volledig ondergedompeld zijn. Open de beeldvormingssoftware en focus op het gebied van belang voor optimale beeldvorming van cellulaire en/of moleculaire details.
Gebruik objectieven met lange werkafstand en hoge numerieke apertuur in de software. Kies de juiste flora viers uit de kieslijst. Klik op spectraal instellingen en pas de emissiebereiken aan.
Om een schone scheiding van reportersignalen te verkrijgen en om signaal-ruisverhoudingen te maximaliseren. Selecteer het juiste objectief in het vervolgkeuzemenu om ervoor te zorgen dat alle door software gedefinieerde voorinstellingen correct zijn aangepast. Om de lasers te focussen en vermogensniveaus in te stellen, selecteer een uitvoer van de lookup-tabel die pixelsaturatie voor elk kanaal onthult.
Stel vervolgens de detectorgevoeligheid in om de gewenste beeldkwaliteit te verkrijgen, verhoog geleidelijk de laseruitvoer tot de beeldintensiteit acceptabel is. Vermijd pixelsaturatie in het gebied van belang en houd de laserniveaus zo laag mogelijk. Om fotobleken en fototoxiciteit problemen te verminderen.
Zorg ervoor dat elke laserlijn alleen detecteerbaar signaal produceert in het juiste kanaal door handmatig lasers aan en uit te zetten terwijl alle beeldvormingskanalen worden gecontroleerd. Als er geen kruisspraak is, kunnen alle kanalen gelijktijdig worden verkregen. Bepaal vervolgens het gebied van belang met behulp van de zoom- en rotatiefuncties.
Stel vervolgens de scannelheid en beeldgrootte in met behulp van snellere scannelheden, minimaliseert de laserdoorlooptijd en verhoogt de temporele resolutie. Stel de Z-dimensie stapgrootte in volgens de experimentele behoeften. Hier wordt een stapgrootte van 10 micrometer gebruikt om zeven optische secties van retinaweefsel te beeldvormen.
Zodra de juiste instellingen zijn bepaald, verwerf Zack-beelden en sla ze op. Ga vervolgens naar de volgende vis. Seriële opvang en loslating beeldvorming kan worden uitgevoerd om cellulaire veranderingen gedurende opeenvolgende dagen te volgen volgens de instructies in het bijgevoegde schriftelijke document.
Bij het uitvoeren van een multi-reporter beeldvormingsexperiment is het het beste om vloer vloeren te gebruiken die goed gescheiden zijn, spectraal, maar dat is niet altijd praktisch. Hier laten we een eenvoudige beeldafwijkingsmethode zien met behulp van de open source software Image J om vloer vloeren te scheiden met overlappende excitatie- en emissieprofielen. In ons geval, GFP en YFP.
De timelijn beeldvormingstechnieken die in deze video worden beschreven, zijn gebruikt om GFP-gelabelde retinale stamcellen te volgen tijdens de ablatie en regeneratie van retinale bipolaire neuronen. Om spectrale scheiding uit te voeren, verzamel afbeeldingen met behulp van sequentiële beeldvormingsmodi en variabele barrièrefilterinstellingen, die het onafhankelijk en gedeeltelijk gescheiden verwerven van overlappende vloer vloeren toestaan. Zodra de afbeeldingen zijn verkregen, gebruikt u de ImageJ loci bio formas import om de afbeeldingsbestanden te openen om het importgereedschap te starten. Sleep het bestand van belang in het Image J-venster.
Splits de kanalen in individuele stacks met behulp van het selectievakje split kanalen in het importvenster om de align three TP plugin te starten. Klik op plug-ins, dan stacks uitlijnen. Vervolgens align three tp.
De stacks moeten worden uitgelijnd om een goede aftrekking te garanderen. Selecteer de referentiestack in de eerste vervolgkeuzelijst en de verkeerd uitgelijnde stack in de tweede. Vink de opties XY relatieve oorsprong gebruiken en Z relatieve oorsprong gebruiken aan en klik op OK.
Om het uitlijnproces te starten, klik op de knop volumeregistratie. Er verschijnt een nieuw venster met de uitlijnparameters. Klik op OK.
Deze sectie is geoptimaliseerd door de distributeur van de plug-in, dus er zijn geen wijzigingen nodig. Wanneer u klaar bent, verschijnt er een venster met uitgelijnde stacks. Selecteer uitvoer vanuit het uitgelijnde venster om het uitvoervenster te openen.
Dit venster is ook geoptimaliseerd en vereist geen
Overzicht
Deze video toont technieken voor multicolor confocale time-lapse beeldvorming en gerichte celablatie in levende modellen. Deze methoden zijn cruciaal voor het bestuderen van neurale circuitfunctie en celspecifieke neuronale regeneratie.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Regeneratieve biologie
Achtergrond
- Fluorescente reporters in transgene dieren maken het mogelijk om cellulaire reacties te monitoren.
- Farmacologische inductie van selectieve celverlies bij zebravissen wordt gebruikt.
- Beeldvorming met hoge resolutie legt cellulair gedrag vast voor en na behandeling.
- Deze aanpak helpt bij het begrijpen van regeneratiemechanismen.
Doel van het onderzoek
- Om het gedrag van meerdere celtypen in vivo te monitoren.
- Om het bestuderen van neurale circuitfunctie te vergemakkelijken.
- Om celspecifieke neuronale regeneratieparadigma's te verkennen.
Gebruikte methoden
- Transgene zebravissen worden voorbereid voor beeldvorming.
- Confocale microscopie wordt gebruikt voor beeldvorming met hoge resolutie.
- Beeldanalyse wordt uitgevoerd om stamcelactivatie te beoordelen.
- Sequentiële beeldvormingstechnieken worden gebruikt voor spectrale scheiding van signalen.
Belangrijkste resultaten
- Activering van endogene stamcelpopulaties werd waargenomen.
- Vervanging van doelwitten vond plaats tijdens de herstelfase.
- ImageJ-software werd gebruikt voor beeldanalyse en signaalscheiding.
- Succesvolle tracking van cellulaire veranderingen in de tijd werd aangetoond.
Conclusies
- De technieken geven inzicht in cellulaire en moleculaire mechanismen van regeneratie.
- Multicolor beeldvorming verbetert het begrip van complexe cellulaire interacties.
- Deze methodologie kan worden toegepast op verschillende studies in de regeneratieve biologie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables real-time visualization of stem cell activation and tissue regeneration following targeted neuronal ablation, providing a predictive model for de-risking therapeutic hypotheses in neurodegenerative disease programs. By correlating cellular loss with endogenous repair mechanisms in a vertebrate system, it supports early-stage target validation and pathway clarification. The approach enhances confidence in lead identification by linking phenotypic outcomes to stem cell-mediated recovery in a disease-relevant context.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by visualizing stem cell responses to targeted cell loss in retinal tissue.
- Operational Value: Enables functional validation of regeneration pathways through longitudinal imaging of cellular replacement.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by linking ablation outcomes to stem cell activation dynamics.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for compound screening by establishing baseline regeneration kinetics.
- Operational Value: Standardizes imaging protocols for reproducible, quantitative readouts of stem cell activation.
- Scalability: Facilitates serial imaging of multiple animals over days, enabling medium-throughput phenotypic assessment.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates disease relevance by modeling retinal degeneration and regeneration in a vertebrate system.
- Operational Value: Provides continuity from discovery to preclinical validation through consistent imaging of stem cell niche responses.
- Risk Mitigation: Enables risk-adjusted advancement decisions by quantifying regenerative capacity post-ablation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, supporting go/no-go decisions based on regenerative biomarker dynamics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by visualizing stem cell activation following targeted neuronal loss.
- Screening: Enables assay readiness through standardized, high-resolution time-lapse imaging of fluorescent reporters.
- Analytics: Generates quantitative measurements of stem cell proliferation and targeted cell recovery over time.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via conserved Müller glia-mediated regeneration mechanisms in vertebrates.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for studying regeneration across multiple neuronal subtypes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in regeneration pathways.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through validated mounting, imaging, and spectral separation protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of regeneration-focused therapeutic strategies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of stem cell-modulating compounds based on in vivo regenerative output.
Implementation Considerations
- Requires expertise in transgenic zebrafish handling, confocal microscopy, and fluorescent reporter validation.
- Dependent on high-numerical-aperture objectives, laser tuning, and spectral separation tools like ImageJ for multiplexed imaging.
- Necessitates cross-team standardization of ablation timing, imaging intervals, and stem cell quantification methods.
- Adaptation considerations include promoter specificity, reporter stability, and pigmentation models for chronic imaging.
- Practical limitations include phototoxicity risks during longitudinal imaging and ablation efficiency variability across fish.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
0:47
Introduction
1:01
Selecting and Preparing Embryos/Larvae for Live Imaging
3:02
"Multicolor" in vivo Confocal Imaging
5:05
Spectral Separation Image Processing Using ImageJ Freeware
8:09
Representative Images of Neural Loss and Regeneration
10:12
Conclusion
