Name: Multicolor Time-lapse imaging van transgene zebravis: Visualizing netvlies Stem Cells geactiveerd door middel van gerichte neuronale cellen Ablation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-20T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Leer multicolor time-lapse imaging en gerichte celablatie in zebravis om netvliesstamcellen te visualiseren. Deze methode onthult regeneratiemechanismen in neurale circuits.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen Drs bedanken. Meera Saxena en Jonathan Mathias voor nuttige commentaar op het manuscript. Wij danken Drs. Michael Parsons, Pamela Raymond, en Rachel Wong voor het leveren van transgene lijnen. Experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door de MCG IACUC set goedgekeurde protocol 07-12-003 * B. Dit werk werd ondersteund door NIH R21 MH083614 en een March of Dimes Basil O Conner Starter Scholar Award uit aan JSM

<ol><li>Köster, R. W., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+microscopy+of+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Time-lapse microscopy of brain development.</a> Methods Cell Biol. 76, 207-235 (2004).</li>
<li>Mumm, J. S., Williams, P. R., Godinho, L., Koerber, A., Pittman, A. J., Roeser, T., Chien, C. B., Baier, H., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+reveals+dendritic+targeting+of+laminated+afferents+by+zebrafish+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging reveals dendritic targeting of laminated afferents by zebrafish retinal ganglion cells.</a> Neuron. 52, 609-621 (2006).</li>
<li>Curado, S., Anderson, R. M., Jungblut, B., Mumm, J., Schroeter, E., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+targeted+cell+ablation+in+zebrafish%3A+a+new+tool+for+regeneration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies.</a> Dev Dyn. 236, 1025-1035 (2007).</li>
<li>Ren, J. Q., McCarthy, W. R., Zhang, H., Adolph, A. R., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+visual+responses+of+wild-type+and+hypopigmented+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Behavioral visual responses of wild-type and hypopigmented zebrafish.</a> Vision Res. 42, 293-299 (2002).</li>
<li>Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+ablation+of+beta+cells+in+the+embryonic+zebrafish+pancreas+using+E.+Coli+nitroreductase%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. Coli nitroreductase.</a> Mech Dev. 124, 218-229 (2007).</li>
<li>Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+cell+motility+and+actin+cytoskeleton+of+individual+neurons+and+neural+crest+cells+in%0A++zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live imaging of cell motility and actin cytoskeleton of individual neurons and neural crest cells in
 zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+the+zebrafish+embryonic+brain+by%0A++confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live imaging of the zebrafish embryonic brain by
 confocal microscopy.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
</ol>

JSM is bekroond met een patent op het gebruik van de nitroreductase-gebaseerde systeem van de cel ablatie in zebravis (Mumm JS, en Schroeter, EH Gerichte en regionale Ablation Cellular Ablation in de zebravis &quot;US Patent 7,514,595. 07 april 2009). Deze techniek is gebruikt als algemeen platform voor een tools en services biotechnologisch bedrijf, Luminomics, Inc, dat JSM opgericht en blijft een stakeholder inch

In deze video, is een overzicht van de technieken die we gebruiken voor multicolor confocale time-lapse imaging en gerichte cel ablatie verstrekt. Wij gebruiken time-lapse imaging om het gedrag van meerdere celtypen van interesse in vivo monitor, terwijl de gerichte cel ablatie wordt gebruikt om de neurale circuit functie en cel-specifieke neuronale regeneratie paradigma&#39;s te bestuderen. De getoonde voorbeelden benadrukken diverse voordelen die kunnen worden afgeleid uit deze benaderingen. Misschien wel het meest belangrijke, time-lapse imaging biedt een intern gecontroleerde paradigma, waargenomen alle verschijnselen kunnen worden gerelateerd aan de vorige staten. Dit maakt directe in plaats van afgeleid vergelijkingen te maken tussen experimenteel tijdstippen, waardoor de relatieve veranderingen makkelijker te kwantificeren en het verminderen van experimentele &#39;ruis&#39; geassocieerd met variaties binnen een populatie. Een voordeel van multicolor beeldvorming is de mogelijkheid om veranderingen in de interactie en / of de naburige celtypen te visualiseren. Bijvoorbeeld, het gebruik van een transgene lijn die Müller glia labels, zijn we nu het karakteriseren van de respons van deze potentiële verwonding veroorzaakte stamcellen om het verlies van discrete netvlies cel subpopulaties. We hebben ook gebruik gemaakt van deze aanpak om nieuwe mechanismen van neurale circuit de vorming 2 te definiëren. Tot slot, in aanvulling op studies van cellulaire regeneratie, hebben we onlangs begonnen met het gebruik van de NTR-based ablatie systeem om de functionele rol van neuronale subtypes dus discrete neurale circuits met behulp van verschillende paradigma&#39;s gedragsmatige en elektrofysiologische testen te onderzoeken. Het unieke voordeel van de tewerkstelling van de zebravis voor dergelijke studies is dat te wijten aan hun regeneratievermogen, veroorzaakte tekorten tijdelijk zijn. Dus, door correleren met time-lapse imaging assays kunnen we typeren reïnnervatie mechanismen die leiden tot, evenals de mate van reïnnervatie nodig is voor, functioneel herstel. Op voorwaarde dat de methoden kunnen worden aangepast aan de vele verschillende vragen. Bijvoorbeeld, kunnen vergelijkbare analyses van ablatie en regeneratie worden toegepast op elke transgenically definieerbare cellulaire subtype. Gezamenlijk worden deze studies hebben het potentieel om ons begrip van de regeneratie uit te breiden op het niveau van de individuele celtypen en binnen de discrete stamcellen niches.

1. Reagentia: Danieau&#39;s oplossing: <ul><li> natriumchloride (Fisher, S271 1) </li><li> kaliumchloride (Fisher, P217 500) </li><li> HEPES (Fisher, BP310500) </li><li> magnesiumsulfaat (Fisher, M65 500) </li><li> calciumnitraat (Fisher, C109500) </li><li> Penicilline-streptomycine (Fisher, ICN1670049) </li></ul> Andere reagentia: <ul><li> Lage smelt agarose (Fisher, BP165-25) </li><li> Tricane methaansulfonaat (Fisher, NC9435281) </li><li> N-phenylthiourea (Fisher, NC9968868) </li><li> Metronidazol (Fisher, AC21034-1000) </li></ul> 2. Benodigdheden: <ul><li> Diep petri-schalen (Fisher Scientific / Corning, 08-772-32) </li><li> Dumont # 5 fijn pincet (Fisher, NC9404145) </li></ul> 3. Uitrusting: <ul><li> Zoom Stereoscope (Olympus, SZ51) </li><li> Fluorescentie Zoom Stereoscope (Olympus, SZX16) </li><li> Confocale microscoop (Olympus FV1000) </li><li> Digitale blokverwarming - Isotemp (Fisher, 11-715-125DQ) </li><li> Barnstead / Thermolyne Benchtop Incubator (Fisher, 11-702-4). </li></ul>

multicolor time-lapse imaging van transgene zebravis: visualizing netvlies stem cells geactiveerd door middel van gerichte neuronale cellen ablation

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

Hoge-resolutie time-lapse imaging van levende zebravis larven kan worden gebruikt om te visualiseren hoe biologische processen ontvouwen (voor review zie 1). Samengestelde transgene vis die verschillende fluorescerende verslaggevers te uiten in de ons omringende celtypen een middel van het volgen van cellulaire interacties 2 en / of weefsel-level reacties op experimentele manipulaties in de tijd. In deze video, tonen we aan methoden die gebruikt kunnen worden serieel voor beeldvorming meerdere transgenically gelabeld celtypes in de individuele vissen na verloop van tijd cursussen die kunnen variëren van minuten tot enkele dagen. De beschreven technieken zijn van toepassing op een studie die aan het &quot;gedrag&quot; van de naburige cellen types correleren loop van de tijd, zoals: &#39;catch and release&#39; 1) seriële methode voor het afbeelden van een groot aantal vissen over opeenvolgende dagen, 2) in vereenvoudigde methoden voor het scheiden van fluoroforen met overlappende excitatie / emissie profielen (bijvoorbeeld GFP en YFP), 3) het gebruik van hypopigmented mutant lijnen uit te breiden het tijdvenster beschikbaar is voor hoge-resolutie beeldvorming in de late larvale stadia van ontwikkeling, 4) het gebruik van membraan gerichte fluorescente reporters om te onthullen fijne morfologische detail van individuele cellen als cellulaire details in grotere populaties van cellen, en 5) een eerder beschreven methode voor chemisch-geïnduceerde ablatie van transgenically gerichte celtypen, dat wil zeggen, nitroreductase (NTR) gemedieerde omzetting van prodrug substraten, zoals metronidazol (MTZ), voor cytotoxische derivaten 3,5. Als voorbeeld van deze benaderingen, zullen we visualiseren de ablatie en de regeneratie van een subtype van het netvlies bipolaire neuron in de individuele vissen over meerdere dagen. Tegelijkertijd zullen we monitoren een aantal andere retinale celtypen, waaronder naburige niet-gerichte bipolaire cellen en mogelijke degeneratie-gestimuleerde het netvlies stamcellen (dat wil zeggen, Mϋller glia). Deze strategie wordt toegepast in ons lab tot cel-en weefsel-niveau (bijvoorbeeld stamcel niche) reacties karakteriseren aan de selectieve verlies en regeneratie van gerichte neuronale celtypen.

In deze video worden de technieken voor multicolor confocale time-lapse imaging en gerichte cel ablatie verstrekt. Time-lapse imaging wordt gebruikt om het gedrag van meerdere celtypen van belang te volgen<em&gt; In vivo</em&gt;. Gerichte cel ablatie vergemakkelijkt de studie neurale circuit functie en cel-specifieke neuronale regeneratie paradigma&#39;s.

Multicolor Time-lapse imaging van transgene zebravis: Visualizing netvlies Stem Cells geactiveerd door middel van gerichte neuronale cellen Ablation

Hoge-resolutie time-lapse-beeldvorming van levende zebravislarven kan worden gebruikt om te visualiseren hoe biologische processen zich ontvouwen (zie review 1). Verbinding ...

De expressie van fluorescerende reporters in transgene dieren maakt het mogelijk om cellulaire responsen op experimentele manipulaties in levende ziektegebonden modellen te volgen. Hier wordt selectief celverlies farmacologisch geïnduceerd in zebravis, waarbij resolutie multicolor confocale beelden van de doelcellen en directe buren worden verkregen vóór, direct na en met tussenpozen na de behandeling met het medicijn. Beeldanalyse demonstreert de activering van endogene stamcelpopulaties en de daaropvolgende vervanging van de doelcellen tijdens de herstelfase.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de regeneratieve biologie, zoals: wat zijn de cellulaire en moleculaire mechanismen die worden gebruikt om specifieke celtypen te regenereren? Begin met het overbrengen van transgene eieren, verzameld na paringen, naar een Petrischaal met 0,3 x danio-oplossing op 16 uur na bevruchting. Voeg PTU toe om de tyrosinase-activiteit te remmen voordat er bewijs is van pigmentatie in het betreffende weefsel. Als het embryo niet albino is, incubeer de embryo's dan bij 28,5 °C.Zodra de reporters zichtbaar zijn, wordt de Petrischaal onder een fluorescente stereozoommicroscoop geplaatst en gesorteerd op de gewenste transgene expressie. Bereid vóór het maken van de beelden een 0,5% low melt aeros monteersuspensie in embryo-medium voor en bewaar deze bij 40 °C.Voeg indien nodig trica en PTU toe. Meng voorzichtig en breng terug naar 40 °C. Anestheseer de vissen door ze in embryo-medium met trica te plaatsen.Gedurende ongeveer drie minuten zullen de vissen niet meer reageren. Om de vissen met een micropipet te verplaatsen, zuigt u individuele vissen op in een afgeknotte pipetpunt in een volume van ongeveer 30 µL anesthesie-oplossing. Keer vervolgens de pipet om en laat de vissen naar de bodem zakken.Raak met de tip de monteeroplossing aan en laat deze door zwaartekracht overgaan. Zorg ervoor dat de agarose niet wordt verdund, zodat deze hergebruikt kan worden. Gooi de resterende anesthesie-oplossing uit de micropipet weg.Breng vervolgens met dezelfde pipetpunt de vis over naar een Petrischaal. Positioneer de vis voorzichtig in ongeveer 30 µL monteersolution, zodanig dat het gebied van interesse in het midden van de aeros-druppel ligt. Zorg ervoor dat de vis in de gewenste oriëntatie blijft totdat de aeros is gestold.Indien gewenst kunnen meerdere vissen in één enkele Petrischaal worden gemonteerd. Nadat het aeros is gestold, transporteert u de vissen naar de tafel van de confocale microscoop en voegt u voorzichtig embryo-medium met trica plus of minus PTU toe aan de schaal tot de vissen volledig zijn ondergedompeld. Open de imaging-software en focus op het gebied van interesse voor een optimale beeldvorming van cellulaire en/of moleculaire details.Gebruik objectieven met een grote werkafstand en een hoge numerieke apertuur in de software. Kies de juiste fluorescente filters uit de keuzelijst. Klik op de spectrale instellingen en pas de emissiebereiken aan.Om een schone scheiding van reportersignalen te verkrijgen en de signaal-ruisverhoudingen te maximaliseren. Selecteer het juiste objectief in het vervolgkeuzemenu om ervoor te zorgen dat eventuele softwarematig gedefinieerde presets correct worden aangepast. Om de lasers te focussen en de vermogensniveaus in te stellen, selecteert u een output uit de opzoektabel die pixelsaturatie voor elk kanaal vertoont.Stel vervolgens de gevoeligheid van de detector in om de gewenste beeldkwaliteit te verkrijgen en verhoog geleidelijk het laservermogen totdat de beeldintensiteit acceptabel is. Vermijd pixelsaturatie in het interessegebied en houd de laserinstellingen zo laag mogelijk om fotobleken en fototoxiciteit te beperken.Controleer of elke laserlijn alleen een detecteerbaar signaal produceert in het bijbehorende kanaal door de lasers handmatig aan en uit te schakelen terwijl alle beeldkanalen worden gemonitord. Als er geen crosstalk zichtbaar is, kunnen alle kanalen gelijktijdig worden vastgelegd. Kader vervolgens het interessegebied in met behulp van de zoom- en rotatiefuncties.Stel vervolgens de scansnelheid en beeldgrootte in; snellere scansnelheden minimaliseren de verblijftijd van de laser en verhogen de temporele resolutie. Stel de stapgrootte van de Z-dimensie in op basis van de experimentele behoeften. In dit geval wordt een stapgrootte van 10 microns gebruikt om zeven optische secties van retinaal weefsel te beelden.Zodra de juiste instellingen zijn bepaald, worden de Zack-beelden vastgelegd en opgeslagen. Ga vervolgens over naar de volgende vis. Seriële catch-and-release imaging kan worden uitgevoerd om cellulaire veranderingen over opeenvolgende dagen te volgen, volgens de instructies in het bijbehorende schriftelijke document.Bij het uitvoeren van een imaging-experiment met meerdere reporters is het bij voorkeur gebruik te maken van fluoroforen die spectraal goed gescheiden zijn; dit is echter niet altijd praktisch. Hier tonen we een eenvoudige methode voor beeldsubtractie met behulp van de opensource-software ImageJ om fluoroforen met overlappende excitatie- en emissieprofielen te scheiden. In ons geval gaat het om GFP en YFP.De in deze video beschreven time-lapse imaging-technieken zijn gebruikt om GFP-gelabelde retinale stamcellen te monitoren tijdens de ablatie en regeneratie van retinale bipolaire neuronen. Voer voor spectrale scheiding beeldacquisitie uit met sequentiële imaging-modi en variabele barrierfilter-instellingen, waardoor overlappende fluorescenties respectievelijk onafhankelijk kunnen worden vastgelegd en gedeeltelijk kunnen worden gescheiden. Zodra de beelden zijn verkregen, gebruikt u de ImageJ Bio-Formats import om de beeldbestanden te openen en start u de importtool. Sleep het gewenste bestand naar het ImageJ-venster.Splits de kanalen in individuele stacks door het selectievakje 'split channels' in het importvenster te gebruiken om de plugin 'align three TP' te starten. Klik op plugins, vervolgens op align stacks en daarna op align three tp.De stacks moeten worden uitgelijnd om een correcte subtractie te waarborgen. Selecteer de referentiestack in het eerste keuzemenu en de niet-uitgelijnde stack in het tweede. Vink de vakjes use XY relative origin en use Z relative origin aan en klik op oké.Om het uitlijningsproces te starten, klikt u op de knop voor volumeregistratie. Er verschijnt een nieuw venster met de uitlijningsparameters. Klik op oké.Dit gedeelte is geoptimaliseerd door de distributeur van de plug-in, dus er zijn geen wijzigingen nodig. Wanneer het proces is voltooid, verschijnt er een venster met de uitgelijnde stacks. Selecteer de output in het uitgelijnde venster om het outputvenster te openen.Dit venster is ook geoptimaliseerd en behoeft geen aanpassing. Klik op oké. Er verschijnt een nieuwe stack in de werkruimte waarbij 'aligned' aan het einde van de bestandsnaam is toegevoegd.Om crosstalk te verwijderen met de image calculator, klikt u op process en vervolgens op image calculator. Selecteer in het keuzemenu voor image one de stack die moet worden afgetrokken en de stack die voor de aftrekking moet worden gebruikt. Selecteer in het keuzemenu voor image two de optie subtract in het dropdownmenu voor de operatie en klik op okay.Image J zal vragen om de stack te verwerken. Selecteer ja. Er verschijnt een nieuwe stack waarin de crosstalk tussen overlappende kanalen is verwijderd.Voeg de stacks samen om dezelfde beeldstructuur van vóór de uitlijning en subtractie te herstellen. Door de samengevoegde kanalen in het venster met kanaaltools te selecteren, maakt de tool het mogelijk om maximaal vier stacks samen te voegen tot een hyper stack. Geef tot slot de kanalen een kleur, pas de helderheid en het contrast aan en sla de bestanden op als tiffs om het doelgerichte verlies en de regeneratie van nitro reductase te bestuderen.Retinale bipolaire cellen die M-cherry tot expressie brengen. Er is een tijdreeks van confocale beelden gemaakt van individuele zebravisjes voorafgaand aan de behandeling. Er is mozaïekexpressie van een membraangekoppelde YFP-reporter in controle-bipolaire cellen, weergegeven in geel, en een nitroreductase-cherry-fusieprotein in getargete bipolaire cellen, weergegeven in rood.Het met een membraan gemarkeerde CFP-transgeen, weergegeven in cyaan, biedt contextuele informatie over de meeste andere netvliescellen voor extra duidelijkheid. Dezelfde afbeelding zonder het CFP-signaal wordt getoond na behandeling met metronidazol. De rode nitroreductase-expresserende bipolaire cellen zijn verloren gegaan, terwijl de gele controle-bipolaire cellen gespaard zijn gebleven.Dit demonstreert de zeer specifieke aard van deze ablatie-methodologie. Opnieuw wordt ter verduidelijking hetzelfde beeld zonder CFP getoond. Wanneer metro NIAZ wordt verwijderd, keren de NTR-expresserende cellen hier terug.Een voorbeeld van de G-F-P-Y-F-P-subtractiemethode wordt getoond in deze figuur met GFP-gelabelde Mueller-cellen. GL-cellen zijn groen weergegeven en YFP-gelabelde bipolaire cellen zijn paars weergegeven. Overlap tussen de twee produceert wit om de subtractie uit te voeren.De GFP- en YFP-beelden moeten eerst worden uitgelijnd. Het subtractieproces maakt het vervolgens mogelijk om YFP-gelabelde bipolaire cellen uit het GFP-beeld te verwijderen, zodat GFP-gelabelde Müller-cellen helder kunnen worden weergegeven en zwakkere Müller-cellen kunnen worden gedetecteerd. De overlap tussen zwakke Müller-cellen en M-cherry-gelabelde bipolaire cellen, weergegeven in het rood, kan nu worden geverifieerd.De hier getoonde gegevens suggereren dat de ablatie van bipolaire cellen ertoe leidt dat mullar ggl de verloren cellen vervangt. Deze interpretatie is in overeenstemming met recente studies naar retinaal herstel, waarbij Mueller Ggl worden aangewezen als door letsel geïnduceerde progenitorcellen bij zowel zoogdieren als vissen. Deze techniek stelt onderzoekers in staat om mechanismen die de regeneratie van specifieke celtypen reguleren te onderzoeken door middel van visualisatie van stamcellen in zebravis.

multicolor-time-lapse-imaging-transgenic-zebrafish-visualizing

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschrijven we een methode voor het monteren van zebravis embryo's voor de lange termijn imaging, twee-foton beeldvorming en weefsel-schade technieken en time-lapse confocale beeldvorming.

Twee-foton axotomy en time-lapse confocale imaging in levende zebravis embryo&#39;s

De huidige video toont een methode die gebruik maakt van de combinatie van elektroporatie en confocale microscopie te leven imaging op individuele neurale stamcellen uit te voeren in de zich ontwikkelende zebravis voorhersenen.

Time-lapse Live-Imaging van klonaal verwante neurale progenitorcellen in de ontwikkelingslanden zebravis voorhersenen

Source: Muto, A., et al. Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (2018) In this video, a two-photon laser ablation procedure is demonstrated, enabling the selective destruction of fluorescent neurons in agarose-immobilized zebrafish larvae. High-resolution imaging before and after the procedure confirms efficient neuronal damage, as observed by the absence of fluorescence.

Targeted Neuronal Ablation Using Two-Photon Microscopy in a Zebrafish Larava

Source: Lahne, M., et.al. Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates live-cell imaging of Muller glial nuclear migration in agarose-embedded zebrafish retinal explants following light-induced photoreceptor damage. Tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) released by damaged photoreceptors activates Muller glial cells, triggering nuclear migration through the inner and outer nuclear layers for...

Live Cell Imaging of Muller Glial Nuclear Migration During Zebrafish Retinal Regeneration

Source: Williams, A. L., et al. Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (2017)This video showcases a multi-photon time-lapse imaging protocol to visualize the migration of neural crest cells in a zebrafish embryo in real-time with high resolution.

Visualizing Neural Crest Cell Migration in a Zebrafish Embryo Using Multi-Photon Time Lapse Imaging

Hoewel het perifere zenuwstelsel (PNS) in staat is om significant herstel na een blessure, is weinig bekend over de cellulaire en moleculaire mechanismen die dit fenomeen regeren. Met behulp van levende, transgene zebravis en een reproduceerbare zenuw doorsnijding test, kunnen we dynamische gliacel gedrag te bestuderen tijdens zenuw degeneratie en regeneratie.

Motor Nerve doorsnijding en Time-lapse beeldvorming van gliacellen Gedrag Live zebravis

Zebravis netvlies regeneratie is meestal onderzocht met behulp van vaste netvliezen. Echter, dynamische processen zoals interkinetic nucleaire migratie optreden tijdens de regeneratieve respons en vereisen voor live-cell imaging om de onderliggende mechanismen te onderzoeken. We beschrijven hier de cultuur en beeldvorming voorwaarden te controleren Interkinetic Nuclear Migratie (INM) in real-time met behulp van multiphoton microscopie.

Cultuur van volwassen transgene zebravis Retina Explantaten voor Live-cell imaging van Multiphoton Microscopy

Live volgen van individuele WT retinale voorlopers in verschillende genetische achtergronden maakt voor de beoordeling van de bijdrage van de cel niet-zelfstandige signalering tijdens de neurogenese. Hier, een combinatie van gen knockdown, chimeer generatie via embryo transplantatie en in vivo time-lapse confocale beeldvorming werd gebruikt voor dit doel.

In vivo beeldvorming van transgene Gene Expression Individuele retinale voorouders in chimère zebravis embryo&#39;s to Cell Nonautonomous Invloeden Studie

Een combinatie van de geavanceerde optische technieken van laser scanning microscopie met lange golflengte fluorescentie multi foton excitatie werd uitgevoerd om vast te leggen van real-time, hoge resolutie, driedimensionale beeldvorming van neurale crest migratie in GS (sox10:EGFP) en GS (foxd3:GFP) zebrafish embryo's.

Multi foton Time Lapse Imaging te visualiseren van ontwikkeling in realtime: visualisatie van migreren neurale kamcellen in Zebrafish embryo's

In vivo imaging is een krachtig hulpmiddel dat kan worden gebruikt om de cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van het zenuwstelsel te onderzoeken. Hier beschrijven we een techniek voor het gebruik van time-lapse confocale microscopie om grote aantallen multicolor Brainbow-gelabelde cellen in real time te visualiseren binnen het zich ontwikkelende zebraviszenuwstelsel.

Visualiseren van de zich ontwikkelende hersenen in levende zebravissen met behulp van Brainbow en Time-lapse Confocalimaging

Hier presenteren we een methode om de zebravis embryonale hersenen in vivo tot larvale en juveniele stadia in beeld te brengen. Deze microinvasieve procedure, aangepast aan elektrofysiologische benaderingen, biedt toegang tot cellulaire en subcellulaire details van volwassen neuronen en kan worden gecombineerd met optogenetica en neurofarmacologische studies voor het karakteriseren van hersenfunctie en medicamenteuze interventie.

In vivo beeldvorming van volledig actief hersenweefsel in wakkere zebravislarven en juvenielen door schedel- en huidverwijdering

Leer multicolor time-lapse imaging en gerichte celablatie in zebravis om netvliesstamcellen te visualiseren. Deze methode onthult regeneratiemechanismen in neurale circuits.

Multicolor Time-lapse imaging van transgene zebravis: Visualizing netvlies Stem Cells geactiveerd door middel van gerichte neuronale cellen Ablation (Video) | JoVE Journal

Multicolor Time-lapse imaging van transgene zebravis: Visualizing netvlies Stem Cells geactiveerd door middel van gerichte neuronale cellen Ablation

Meer video's verkennen