Name: In vivo visualisatie van synaptische blaasjes Binnen Drosophila larven Segmentale Axonen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-15T16:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Leer hoe je synaptische blaasjes in levende Drosophila-larven visualiseert met GFP-markering en fluorescentiemicroscopie. Deze techniek onthult axonaal transport in segmentale zenuwen voor neurowetenschappelijk onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SG wordt ondersteund door middelen van de State University van New York in Buffalo en van John R. Oishei Foundation. MK werd ondersteund door een Student Research Award van CURCA bij UB.

1. Voorbereiding van de reagentia <ol><li> Bereid de dissectie buffer voorbereiding door het toevoegen van de volgende verbindingen: 128 mM NaCl, 1 mM EGTA, 4 mM MgCl 2, 2 mM KCl, 5mM HEPES, en 36 mM sucrose in 1000 mL, PH op 7,2 en het filter te steriliseren. </li></ol> 2. Voorbereiding van de Dissection <ol><li> Siligard cube: De gel is teruggebracht tot ongeveer een cm breed, 1 cm lang en ongeveer 1 cm hoog. De gel kubus wordt geplaatst op een glasplaatje tijdens dissectie. Blokjes kan meer dan een keer worden gebruikt. </li><li> Pins: Pins gebruikt worden voor dissectie moeten extra kort. De scherpe onderste gedeelte van minutien pinnen werkt het beste in dissectie. </li><li> Nodig een scherpe microdissectie voorjaar schaar. </li><li> Moeten twee mooie getipt tang. </li></ol> 3. Het verzamelen van Larven <ol><li> Wandering 3 e instar larven dat uiten van een GFP-gelabelde blaasje eiwit worden verzameld op een petrischaal. </li><li> Larven worden gewassen in gedeïoniseerd water om zich te ontdoen van al het voedsel. </li></ol> 4. Live-dissectie van de larven <ol><li> Een larve is overgebracht naar de dissectie gel kubus op een glasplaatje. Larve is ondergedompeld in dissectie buffer. </li><li> Larve is kwijnde op de voorste en achterste met twee fijne pinnen met de dorsale zijde naar boven. </li><li> Met behulp van microdissection schaar, is een kleine snede gemaakt op de middenlijn de buurt van de achterste einde. Vanuit deze incisie een snede wordt gemaakt door tot de voorste. Met behulp van twee pinnen, pin de snede cuticula op de laterale randen. </li><li> Voeg een druppel ontleden buffer. Verwijder voorzichtig de ingewanden, de darmen en vet lichamen met een pincet. De meeste van deze weefsels normaal gesproken buiten sijpelen in de dorsale snijden. </li><li> Vervang de buffer met verse ontleden buffer. De larve mag nooit droog zijn en moet voortdurend in ontleden buffer. </li><li> Incubaties met behulp van in vivo markers MitoTracker of LysoTracker worden gedaan op dit moment, door verdunning van de in vivo marker in dissectie buffer. Na de incubatie van de in vivo marker was de ontleed larve meerdere malen (5 quick wast) met behulp van verse ontleden buffer. </li><li> Na het vervangen van de laatste wasbeurt duw de pinnen in de syligard en onmiddellijk dekglaasje aan. De larven is nu klaar voor observatie. </li></ol> 5. Live-beeldvorming van ontleed larven <ol><li> Plaats het dekglaasje en gel op de microscoop podium en beeld met behulp van een omgekeerde microscoop. </li><li> We maken gebruik van een 100x objectief om de afbeelding getagd blaasjes binnen de larvale segmentale zenuwen. GFP expressie in de cel organen van de ventrale ganglion wordt eerst geëvalueerd voordat segmentale zenuwen zijn afgebeeld. Als robuuste GFP kleuring wordt waargenomen in de cellichamen in de ventrale ganglion, worden de zenuwen vervolgens belicht en gebruikt voor de evaluatie. </li><li> Met behulp van een dual view systeem met filters voor CFP / YFP of RFP / YFP en split view software kunnen wij tegelijkertijd afbeelding twee gecodeerde eiwit in vivo. </li></ol> 6. Representatieve resultaten <img src="/files/ftp_upload/2151/2151fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1:. Een representatief beeld toont veel axonale blaasjes op vele axonale tracks binnen een larvale segmentale zenuw Let op de klodders van GFP, wat neerkomt op axonale ophopingen. <img src="/files/ftp_upload/2151/2151fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2: Een representatief beeld toont een axonale track met veel axonale blaasjes binnen een larvale segmentale zenuw.

<ol><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Hurd, D. D., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin+mutations+cause+motor+neuron+disease+phenotypes+by+disrupting+fast+axonal+transport+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila.</a> Genetics. 144, 1075-1085 (1996).</li>
<li>Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+axonal+transport+by+loss+of+huntingtin+or+expression+of+pathogenic+polyQ+proteins+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila.</a> Neuron. 40, 25-40 (2003).</li>
</ol>

In vivo beeldvorming van synaptische vesicles vervoer in Drosophila larven segmentale zenuwen is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van de mechanismen in het axonaal transport. We hebben eerder gebruikt dit protocol om het transport te evalueren dynamiek binnen de larvale zenuwen drukken uitgebreid polyQ herhalingen licht te werpen op hoe de uitbreiding van herhaalt de dynamiek van blaasje vervoer 3 beïnvloeden. Met behulp van dit protocol is de snelheid van het blaasje beweging kan...

<table><tbody><tr><td>1 paar microdissectiescharen</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>Veerscharen &amp;#8211; 6mm blad. 0,125 mm tipdiameter</td></tr><tr><td>2 paar pincetten</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Fisherbrand dissectie Micro-Adson pincetten met gekartelde tip</td></tr><tr><td>Doos dissectiepennen</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>Minutien pennen 0,1mm diameter</td></tr></tbody></table>

in vivo visualisatie van synaptische blaasjes binnen drosophila larven segmentale axonen

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Het ophelderen van de mechanismen van axonaal transport heeft aangetoond dat het van groot belang zijn bij het bepalen hoe defecten in vervoer over lange afstand verschillende neurologische aandoeningen beïnvloeden. Defecten in deze essentiële proces kan nadelige gevolgen hebben op de neuronale werking en ontwikkeling. Hebben we een dissectie protocol dat is ontworpen om de bloot<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale segmentale zenuwen naar axonaal transport te bekijken in real time. We hebben dit protocol aangepast voor live beeldvorming van de ene gepubliceerd door Hurd en Saxton (1996) gebruikt voor immunolocalizatin van larvale segmentale zenuwen. Zorgvuldige dissectie en een goede buffer voorwaarden zijn van cruciaal belang voor het maximaliseren van de levensduur van de ontleed larven. Wanneer goed uitgevoerd, hebben ontleed larven zien robuuste blaasje vervoer voor 2-3 uur onder fysiologische omstandigheden. We gebruiken de UAS-GAL4 methode<sup&gt; 1</sup&gt; Uit te drukken GFP-gelabelde APP of synaptotagmin blaasjes binnen een axon of meerdere axonen in larvale segmentale zenuwen met behulp van verschillende neuronale GAL4 chauffeurs. Andere fluorescent gelabelde markers, bijvoorbeeld mitochrondriën (MitoTracker) of lysosomen (LysoTracker), ook kan worden toegepast op de larven voordat u deze bekijkt. GFP-blaasje beweging en deeltje beweging tegelijkertijd kunnen worden bekeken met behulp van aparte golflengten.

Dit protocol gaat in op de live-dissectie van de<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven in het kader van beeldvorming van de beweging van GFP gelabelde axonale blaasjes op microtubuli tracks.

In vivo visualisatie van synaptische blaasjes Binnen Drosophila larven Segmentale Axonen

Het ontrafelen van de mechanismen van axonaal transport is van groot belang gebleken voor het bepalen van de wijze waarop defecten in transport over lange afstanden verschillende ...

Om te bestuderen of defecten in het axonale transport over lange afstand aanwezig zijn bij neurologische aandoeningen zoals de ziekte van Alzheimer of de ziekte van Huntington. Het axonale transport van transportvesikels wordt in beeld gebracht in levende slokdarm-lava. Hier wonderend.Ten derde worden larven waarin een GFP-getagd synaptisch eiwit wordt tot expressie gebracht, gedisseceerd op een gelblokje en vervolgens overgeplaatst naar de microscoop voor in vivo beeldvorming. Vervolgens wordt fluorescentiemicroscopie gebruikt om het synaptische transport binnen het axon te volgen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is de visualisatie van de ongestoorde beweging van synaptische blaasjes en axonale larven in levende toestand.Bereid de dissectie voor door ervoor te zorgen dat de volgende benodigdheden en reagentia aanwezig zijn. Dissectiebuffer. Een Sill guard-blokje, gesneden op één inch breed, één inch lang en één centimeter hoog, geplaatst op een objectglas.Extra korte dissectienaalden. Het scherpe onderste gedeelte van manum-naalden werkt het best bij dissecties. De juiste lengte kan worden bereikt door langere naalden in de gel te steken en het uitstekende gedeelte van de naald af te knippen.U heeft daarnaast één paar scherpe microdissectieschaartjes en twee sets fijne pincetten nodig. Gebruik een kleine metalen spatel om dwalende derde-stadium sterlarven die een GFP-gelabeld SLE-eiwit tot expressie brengen over te brengen naar een Petrischaal.Breng vervolgens gedeïoniseerd water aan bij de larven in de Petrischaal om al het voedsel te verwijderen. Draag ze vervolgens met een pincet over naar een dissectiegelblokje om de dissectie in vivo uit te voeren. Gebruik een pincet om een larve naar het dissectiegelblokje over te brengen.Voeg dissectiebuffer toe aan een glazen objectglas om het monster onder te dompelen. Zet vervolgens de larve vast bij het voorste en achterste uiteinde met de rugzijde naar boven. Maak met microdissectieschaartjes een kleine snede in de middenlijn nabij het achterste uiteinde.Maak vanaf deze incisie een tweede snede door naar de anterior. De darmdarmen en vetlichamen zullen naar buiten komen; fixeer deze met twee spelden. Fixeer de gesneden cuticula langs de laterale randen aan de sil guard-kubus.Gebruik een pipette om een druppel dissectiebuffer toe te voegen. Verwijder vervolgens met een pincet voorzichtig de darmen en vetlichamen. Gebruik een Kimwipe aan één zijde van de larve om de buffer te verwijderen, terwijl u gelijktijdig met een pipette verse dissectiebuffer toevoegt.De lava mag nooit uitdrogen. Om mitochondriële of lysosomale structuren in de lava te labelen, vervangt u de dissectiebuffer door dissectiebuffer die mito tracker of lyo tracker bevat. Plaats de dissectiekubus in een vierkante bevochtigingskamer en dek deze af met aluminiumfolie.Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Nadat de in vivo marker is geïncubeerd, wordt de dissectiebuffer rondom de larven herhaaldelijk weggezogen en met een pipet vervangen door verse dissectiebuffer. Herhaal dit vijf keer om alle resterende marker weg te wassen.Nadat de laatste wasbeurt is voltooid, worden de pinnen volledig in de S-bescherming geduwd en wordt er onmiddellijk een dekglas geplaatst om beweging van de larve te voorkomen. De larve is nu klaar voor observatie. Om live imaging van de gedisseceerde larve uit te voeren, wordt het monster op de tafel van een omgekeerde microscoop geplaatst om de gemarkeerde blaasjes in beeld te brengen.Binnen de segmentale zenuwen van de larve. Voer de beeldvorming uit met een 100-voudige objectieflens. Indien er een sterke GFP-kleuring waarneembaar is in de cellichamen in de afbeelding van het ventrale ganglion en de segmentale zenuwen, kunnen twee in vivo gelabelde eiwitten gelijktijdig worden bekeken met behulp van een dual-view systeem met filters voor C-F-P-Y-F-P of R-F-P-Y-F-P en split-view software.In deze timelapse-serie zijn veel axonale blaasjes te zien op talloze axonale banen binnen een segmentale zenuw van een larve. Let op dat GFP de axonale ophopingen representeert en merk de bidirectionele beweging van de blaasjes op. Hier is de beweging van axonale blaasjes op een enkele baan binnen een segmentale zenuw van een larve te zien.Let op: de bidirectionele beweging van deze sles is gemiddeld één micron per seconde. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u een schone dissectie uitvoert voor in vivo observatie van GFP-getagde blaasjes en gsof-larvale axonen.

in-vivo-visualization-synaptic-vesicles-within-drosophila-larval

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

We structurele kenmerken van de Glia-neuromusculaire synapsen beschreven in een roman Inside-out het prepareren van weefsels van levende larven gebruik van fluorescerende kleurstoffen met confocale microscopie. We leven zenuwuiteinden gelabeld met fluorescente primaire antilichamen tegen HRP, en ook gevisualiseerd het perisynaptic ruimte met fluorescerende dextranen.

Het visualiseren van de Live- Drosophila Gliale-neuromusculaire Junction met fluorescente kleurstoffen

Drosophila melanogaster larven zorgen voor een ideaal modelsysteem om de mechanismen van het axonaal transport te onderzoeken binnen de larvale segmentale zenuwen. Met behulp van deze procedure, kan 3 e instar larven dragen verschillende mutaties worden vergeleken met wild-type larven.

Visualisatie van larvale Segmentale zenuwen in 3 Rd Instar Drosophila Larvale Voorbereidingen

Beschrijven we de procedure voor te bereiden...

Visualisatie van de embryonale zenuwstelsel in zijn geheel-mount Drosophila Embryo&#39;s

Dit protocol beschrijft een betrouwbare methode voor verdoving en beeldvorming van...

In vivo beeldvorming van Intact Drosophila larven aan Subcellulaire resolutie

Dissectie en Imaging van Active Zones in de Drosophila Neuromusculaire Junction

This video demonstrates a protocol to study synaptic vesicle recycling at neuromuscular junctions in channelrhodopsin-expressing Drosophila larvae using a fluorescent dye. Blue light activates the channelrhodopsins, causing calcium influx and synaptic vesicle exocytosis. The dye integrates into the neuronal membranes and is internalized during endocytosis, resulting in enhanced fluorescence. Further blue light stimulation induces exocytosis and dye release, which is shown by reduced...

Analyzing Synaptic Vesicle Recycling and Fluorescent Dye Uptake in Drosophila Larvae

Source: Jeong, S. Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the visualization of axonal projections in Drosophila embryos. Immunolabeling of motor neurons, precise dissection to expose neuronal structures, and differential interference contrast microscopy collectively reveal detailed neuronal architecture, emphasizing the axonal projection patterns.

Visualization of Axonal Projection Patterns of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Immuunkleuring is een effectieve techniek voor het visualiseren van specifieke celtypen en eiwitten in weefsels. Door het gebruik van sonicatie vermindert het hier beschreven protocol de noodzaak om Drosophila melanogaster weefsels van laat-stadium embryo's en larven te dissekeren voordat immunokleuring wordt uitgevoerd. We bieden een efficiënte methodologie voor de immunokleuring van formaldehyde-gefixeerde hele larven.

-Sonicatie vergemakkelijkt immunofluorescentiekleuring van Late-fase embryonale en larvale<em&gt; Drosophila</em&gt; Weefsels<em&gt; In Situ</em

Dit werk bevat een standaard immunohistochemie methode om motorische neuron projecties van late-16 Drosophila melanogaster embryo's te visualiseren . De gefiltreerde bereiding van vaste embryo's die gekleurd zijn met FasII antilichaam, biedt een krachtig instrument om de genen die nodig zijn voor motor axon pathfinding en target recognition tijdens neurale ontwikkeling te karakteriseren.

Visualisatie van het Axonal Projectiepatroon van Embryonische Motor Neuronen in<em&gt; Drosophila</em

Hier we illustreren hoe enkel molecuul foto-geactiveerde lokalisatie microscopie kan worden uitgevoerd op de motorische zenuw-terminal van een levende Drosophila melanogaster derde instar larve.

In Vivo Single-molecuul volgen bij de Terminal van de presynaptische motorische zenuw Drosophila

Leer hoe je synaptische blaasjes in levende Drosophila-larven visualiseert met GFP-markering en fluorescentiemicroscopie. Deze techniek onthult axonaal transport in segmentale zenuwen voor neurowetenschappelijk onderzoek.

In vivo visualisatie van synaptische blaasjes Binnen Drosophila larven Segmentale Axonen

Meer video's verkennen