In vivo visualisatie van synaptische blaasjes Binnen Drosophila larven Segmentale Axonen
15 oktober 2010
Dit protocol gaat in op de live-dissectie van de Drosophila Larven in het kader van beeldvorming van de beweging van GFP gelabelde axonale blaasjes op microtubuli tracks.
Om te bestuderen of defecten in het axonale transport over lange afstand aanwezig zijn bij neurologische aandoeningen zoals de ziekte van Alzheimer of de ziekte van Huntington. Het axonale transport van transportvesikels wordt in beeld gebracht in levende slokdarm-lava. Hier wonderend.
Ten derde worden larven waarin een GFP-getagd synaptisch eiwit wordt tot expressie gebracht, gedisseceerd op een gelblokje en vervolgens overgeplaatst naar de microscoop voor in vivo beeldvorming. Vervolgens wordt fluorescentiemicroscopie gebruikt om het synaptische transport binnen het axon te volgen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is de visualisatie van de ongestoorde beweging van synaptische blaasjes en axonale larven in levende toestand.
Bereid de dissectie voor door ervoor te zorgen dat de volgende benodigdheden en reagentia aanwezig zijn. Dissectiebuffer. Een Sill guard-blokje, gesneden op één inch breed, één inch lang en één centimeter hoog, geplaatst op een objectglas.
Extra korte dissectienaalden. Het scherpe onderste gedeelte van manum-naalden werkt het best bij dissecties. De juiste lengte kan worden bereikt door langere naalden in de gel te steken en het uitstekende gedeelte van de naald af te knippen.
U heeft daarnaast één paar scherpe microdissectieschaartjes en twee sets fijne pincetten nodig. Gebruik een kleine metalen spatel om dwalende derde-stadium sterlarven die een GFP-gelabeld SLE-eiwit tot expressie brengen over te brengen naar een Petrischaal.
Breng vervolgens gedeïoniseerd water aan bij de larven in de Petrischaal om al het voedsel te verwijderen. Draag ze vervolgens met een pincet over naar een dissectiegelblokje om de dissectie in vivo uit te voeren. Gebruik een pincet om een larve naar het dissectiegelblokje over te brengen.
Voeg dissectiebuffer toe aan een glazen objectglas om het monster onder te dompelen. Zet vervolgens de larve vast bij het voorste en achterste uiteinde met de rugzijde naar boven. Maak met microdissectieschaartjes een kleine snede in de middenlijn nabij het achterste uiteinde.
Maak vanaf deze incisie een tweede snede door naar de anterior. De darmdarmen en vetlichamen zullen naar buiten komen; fixeer deze met twee spelden. Fixeer de gesneden cuticula langs de laterale randen aan de sil guard-kubus.
Gebruik een pipette om een druppel dissectiebuffer toe te voegen. Verwijder vervolgens met een pincet voorzichtig de darmen en vetlichamen. Gebruik een Kimwipe aan één zijde van de larve om de buffer te verwijderen, terwijl u gelijktijdig met een pipette verse dissectiebuffer toevoegt.
De lava mag nooit uitdrogen. Om mitochondriële of lysosomale structuren in de lava te labelen, vervangt u de dissectiebuffer door dissectiebuffer die mito tracker of lyo tracker bevat. Plaats de dissectiekubus in een vierkante bevochtigingskamer en dek deze af met aluminiumfolie.
Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Nadat de in vivo marker is geïncubeerd, wordt de dissectiebuffer rondom de larven herhaaldelijk weggezogen en met een pipet vervangen door verse dissectiebuffer. Herhaal dit vijf keer om alle resterende marker weg te wassen.
Nadat de laatste wasbeurt is voltooid, worden de pinnen volledig in de S-bescherming geduwd en wordt er onmiddellijk een dekglas geplaatst om beweging van de larve te voorkomen. De larve is nu klaar voor observatie. Om live imaging van de gedisseceerde larve uit te voeren, wordt het monster op de tafel van een omgekeerde microscoop geplaatst om de gemarkeerde blaasjes in beeld te brengen.
Binnen de segmentale zenuwen van de larve. Voer de beeldvorming uit met een 100-voudige objectieflens. Indien er een sterke GFP-kleuring waarneembaar is in de cellichamen in de afbeelding van het ventrale ganglion en de segmentale zenuwen, kunnen twee in vivo gelabelde eiwitten gelijktijdig worden bekeken met behulp van een dual-view systeem met filters voor C-F-P-Y-F-P of R-F-P-Y-F-P en split-view software.
In deze timelapse-serie zijn veel axonale blaasjes te zien op talloze axonale banen binnen een segmentale zenuw van een larve. Let op dat GFP de axonale ophopingen representeert en merk de bidirectionele beweging van de blaasjes op. Hier is de beweging van axonale blaasjes op een enkele baan binnen een segmentale zenuw van een larve te zien.
Let op: de bidirectionele beweging van deze sles is gemiddeld één micron per seconde. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u een schone dissectie uitvoert voor in vivo observatie van GFP-getagde blaasjes en gsof-larvale axonen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft de dissectie van levende Drosophila-larven voor het in beeld brengen van de beweging van GFP-gelabelde axonale blaasjes op microtubuli-sporen. Deze techniek maakt de visualisatie van de levende, ongestoorde beweging van synaptische blaasjes binnen axonale larven mogelijk.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Beeldvormingstechnieken
Achtergrond
- Axonaal transport is cruciaal voor de neuronale functie.
- Defecten in het axonaal transport zijn gekoppeld aan neurologische aandoeningen.
- Drosophila-larven dienen als modelorganisme voor het bestuderen van deze processen.
- Fluorescentiemicroscopie maakt real-time observatie van vesikelverplaatsing mogelijk.
Doel van de studie
- Om defecten in axonaal transport over lange afstand te onderzoeken.
- Om de implicaties van deze defecten bij neurologische ziekten te begrijpen.
- Om live-imagingtechnieken te gebruiken voor verbeterde observatie.
Gebruikte methoden
- Dissectie van Drosophila-larven die GFP-gelabelde eiwitten tot expressie brengen.
- Overdracht van gedissecteerde larven naar een gelkubus voor stabiliteit.
- In vivo imaging met fluorescentiemicroscopie.
- Tracking van vesikeltransport binnen axonen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van axonaal transport in levende larven.
- Demonstratie van de beweging van GFP-gelabelde blaasjes.
- Inzichten in de dynamiek van het transport van synaptische blaasjes.
- Vergelijking met bestaande methoden benadrukt de voordelen van deze aanpak.
Conclusies
- Het protocol biedt een waardevol instrument voor het bestuderen van axonaal transport.
- Live-imaging onthult cruciale inzichten in de neuronale functie.
- Deze methode kan worden toegepast om diverse neurologische aandoeningen te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Het begrijpen van de dynamiek van het axonaal transport is cruciaal voor het verminderen van risico's bij doelwitten voor neurodegeneratieve ziekten, aangezien defecten in het transport van blaasjes mechanistisch gekoppeld zijn aan de ziekte van Alzheimer, Huntington en ALS. Dit model van het axoon van Drosophila-larven maakt real-time visualisatie van de beweging van synaptische blaasjes mogelijk, wat een voorspellend, ziekte-relevant systeem biedt voor vroege targetvalidatie en mechanisch inzicht. Door de bidirectionele flux en transportsnelheden van blaasjes te kwantificeren, ondersteunt deze methode go/no-go-beslissingen in preklinische programma's die gericht zijn op axonale integriteit.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking en targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door het visualiseren van het transport van GFP-gelabelde APP of synaptotagmine-vesikels in levende axonen.
- Operationele waarde: Maakt functionele validatie van targets mogelijk door directe observatie van vesikel-dynamiek in een genetisch hanteerbaar systeem.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt mechanisch de-risking door transportdefecten te koppelen aan neuronale dysfunctie in ziektemodellen.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde axonale systemen voor op compoundscreening door de basislijn van de vesikelmotiliteit onder fysiologische omstandigheden vast te stellen.
- Operationele waarde: Levert kwantitatieve, reproduceerbare resultaten van vesikelbeweging (bijv. 1 µm/s bidirectionele flux) voor de standaardisatie van assays.
- Strategische waarde: Maakt schaalbare, platformcompatibele imaging-workflows mogelijk voor het evalueren van compound-effecten op axonaal transport.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Sluit aan bij ziekterelevante systemen door transportdefecten te modelleren die worden waargenomen bij menselijke neurodegeneratieve aandoeningen.
- Operationele waarde: Biedt continuïteit van ontdekking naar preklinische validatie via live-imaging van vesikeltransport in intacte larvale zenuwen.
- Risicobeperking: Informeert beslissingen over verdere ontwikkeling door het kwantificeren van transportherstel of verergering door kandidaat-modulatoren.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het continuüm van discovery tot preklinische fase en ondersteunt hypothesetoetsing in de vroege discovery-fase, assay-gereedheid bij screening en mechanistische validatie in preklinische stadia.
- Discovery Biology: Ondersteunt de verduidelijking van signaalpaden en biologische risicoreductie door vesicle-transport te visualiseren in reactie op genetische of farmacologische perturbaties.
- Screening: Maakt assay-gereedheid mogelijk via gestandaardiseerde dissectie-, kleurings- en beeldgevingsprotocollen die consistente metrieken voor de vesicle-motiliteit opleveren.
- Analytics: Genereert kwantitatieve metingen van afhankelijke variabelen (snelheid, directionaliteit, flux) die vergelijking tussen experimentele condities mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan bij preklinische continuïteit door axonale transportdefecten te modelleren die relevant zijn voor menselijke neurologische aandoeningen.
- Bedrijfsmatige herbruikbaarheid: Vestigt een herbruikbaar beeldgevingsplatform voor longitudinale studies naar axonale integriteit over meerdere doelwitklassen.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen in doeltargetvalidatie door middel van directe visualisatie van de dynamiek van synaptische blaasjes.
- Operationele waarde: Standaardisatie en reproduceerbaarheid via gedefinieerde condities van de dissectiebuffer en beeldvormingsparameters.
- Strategische waarde: Verbeterde go/no-go-beslissingen door het verminderen van mechanistische ambiguïteit in hypothesen over axonaal transport.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering van targets op basis van de effectiviteit van transportherstel in ziekterelevante modellen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in het hanteren van Drosophila, microdissectie en fluorescentiemicroscopie.
- Afhankelijk van een omgekeerde microscoop met 100x objectief, dual-view systeem en geschikte filtersets voor GFP en andere fluoroforen.
- Vereist standaardisatie van dissectiebuffer, larvale stadiumbepaling en omgevingscontroles (bevochtigingskamer, temperatuur).
- Overwegingen voor adaptatie omvatten de expressie van verschillende GFP-gelabelde ladingen (bijv. mitochondriën, lysosomen) via neuronale GAL4-drivers.
- Praktische beperkingen omvatten de tijd voor larvale preparatie en het venster van 2–3 uur voor robuust vesikeltransport na dissectie.
