Injectie van An. stephensi Embryo's aan Malaria-resistente muggen Generate
4 juli 2007
Anopheles stephensi muggen zijn vectoren voor malaria wonen India en de rest van Azië. Deze video toont de techniek voor het uitvoeren van micro-injecties van deze soorten met transgenen die weerstand zal verlenen aan de malaria aan de mug. Een groot deel van de methodologie kunnen zien in deze video is van toepassing op micro-injectie technieken van andere muggensoorten.
Elke 15 seconden sterft er wereldwijd een kind aan malaria; hier in het James-lab proberen we Franse muggen te creëren die de malaria-parasieten niet kunnen overbrengen. Mijn naam is TIUs. Ik ben hier aan de University of California Irvine bij de afdeling Moleculaire Biologie en Biochemie in het lab van Anthony James.
Vandaag zal ik u laten zien hoe u transgene en niet-transgene eitjes maakt. We doen dit om malariamuggen refractair te maken, zodat ze de malariaparasiet niet kunnen overdragen. Ik heb nu een flacon met isotonische buffer klaargezet waarin de muggen hun eitjes zullen leggen.
Ik ga deze aspirator gebruiken om de muggen op te zuigen en in een flacon te plaatsen. Deze flacon gaat vervolgens in een incubator van 30 °C, waar we hem ongeveer een uur in een bekertje laten staan. Nu gaan we de micro-injectienaalden pakken.
Dit zijn naalden gemaakt van kwarts en we moeten een zeer fijne punt gebruiken. Daarom hebben we deze naaldtrekker nodig. We gebruiken een naaldtrekker van Suter Instruments en ook de naalden van Suter Instruments.
Ik haal nu de muggen weg en ik leg deze eieren in de Petri-schaal met filterpapier dat is gedrenkt in isotone buffer; dit is enkel om de embryo's nat te houden tijdens de injectieperiode. De hoeveelheid water op het filterpapier is cruciaal. De eieren mogen niet gaan drijven, maar het papier mag ook niet uitdrogen.
Nu ga ik het embryo van het eipapier verplaatsen naar een ander stukje watmanpapier van 3 mm dat is geweekt in isotone buffer. Doe dit om het chorion te verwijderen voordat ze worden uitgelijnd voor de micro-injectie. Nu ga ik het chorion verwijderen, wat dit zilverkleurige oppervlak op de eitjes is.
En dat doe ik door ze met mijn penseel weg te borstelen. Hierboven hebben we dus een embryo waarbij het Corian nog aanwezig is en ze dit zilverkleurige, glanzende deel hebben. Waar is degene daaronder?
Het is me gelukt om het Corian te verwijderen; de bovenste laag zal waarschijnlijk over een tape glijden, terwijl de onderste laag zal hechten. Dat is essentieel wanneer u een niet-even zijde bewerkt. Nu ben ik de embryo's aan het uitlijnen.
De embryo's zijn dikker aan het anterieure uiteinde, en dat deel plaats ik naar rechts. Aan de linkerkant bevindt zich het posterieure uiteinde, dat slanker is en waar ik de embryo's zal injecteren. Ik probeer ze zo samen te voegen dat ze elkaar helpen om in positie te blijven.
En meestal doe ik er ongeveer 10 tegelijk in een rij. Nu heb ik een rij embryo's, en ik zal deze overbrengen naar een dekglas. Op het dekglas.
Ik breng pruikenlint aan om ze te laten kleven. Wanneer dat klaar is, droog ik het filterpapier waarop de embryo's liggen af met een ander stuk filterpapier, plaats ik de embryo's op het dekglas en laat ik dit 30 seconden drogen voordat ik olie aanbreng. Nu hebben we de embryo's uitgelijnd en bevinden ze zich onder de olie.
Op de objecttafel van de microscoop injecteren we DNA vermengd met kleurstof met behulp van deze speciale tip van het micro-patroon en injecteren we dit in de naalden van de poort. Nu hebben we de naald gevuld en teruggeplaatst op een micro-injector. We zijn nu klaar om de micro-injecties uit te voeren.
Nu beweeg ik de naald om deze scherp te stellen, zodat ik deze in focus kan zien. Zodra dat is gedaan, beweeg ik een gewichtnaald, breng ik de embryo's in beeld en stel deze ook scherp. Wanneer dat is voltooid, beweeg ik de naald opnieuw tot deze in positie is en beweeg ik naar mijn embryo's.
Zodra de naald door de olie gaat, wordt het beeld wazig en moet u deze opnieuw afstellen. Dat is precies de scherpe tik. Precies, de scherpte-tik.
En nu ben ik klaar om de injecties uit te voeren. U ziet dat ik het embryo met de naald heb aangeraakt; hiermee heb ik de tip doorbroken en u kunt een kleine druppel zien verschijnen die in het embryo geïnjecteerd zal worden. Hier injecteren we en trekken we de naald vervolgens weer terug.
En ik controleer telkens tussen elk embryo of er een kleine druppel aan de punt van de naald verschijnt. En zoals u kunt zien, moet ik voor elk embryo opnieuw afstellen om de perfecte positie te bereiken. Deze lekte nu.
Zoals u kunt zien, wordt de bel erg groot wanneer ik mijn tweede injectie in de olie uitvoer, waardoor ik de druk van de micro-injector opnieuw moet afstellen. De micro-injecties zijn nu voltooid en we gaan de embryo's van de microscoop overbrengen naar de Petrischaal, die we hebben gevuld met isotone buffer. Ik veeg de olie van het dekglas en snijd het in een klein stukje, dat ik in de Petrischaal plaats.
Nu laten we ze hier tot het einde van de dag bij kamertemperatuur staan. Daarna plaatsen we ze in het insectarium. Vandaag heb ik u laten zien hoe u een micro-injectie uitvoert om transiënte muggen te maken.
En nu moeten we alleen nog maar wachten tot alle larven uitkomen. We kweken ze op tot volwassenen, waarna ze zullen paren. Daarna verstrijken er drie weken voordat we kunnen beginnen met een screen om te bepalen of ze Refactor zijn of niet.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze video demonstreert de techniek voor het uitvoeren van micro-injecties in Anopheles stephensi-muggen, die vectoren zijn voor malaria in Azië. De getoonde methodologie is ook toepasbaar op andere muggensoorten.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Genetica
- Vectorbiologie
Achtergrond
- Anopheles stephensi-muggen zijn belangrijke malariavectoren.
- Malaria vormt een ernstige bedreiging voor de gezondheid, in het bijzonder voor kinderen.
- Transgene benaderingen zijn erop gericht muggen te creëren die geen malaria kunnen overbrengen.
- Micro-injectietechnieken zijn essentieel voor genetische modificaties.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van transgene Anopheles stephensi-muggen.
- Het verlenen van malariaresistentie aan deze muggen.
- Het demonstreren van microinjectietechnieken die toepasbaar zijn op diverse muggensoorten.
Gebruikte methoden
- Bereiding van isotone buffer voor het leggen van muggeneitjes.
- Micro-injectie van transgenen in embryo's van muggen.
- Observatie van transgene eigenschappen in ontwikkelde muggen.
- Toepassing van technieken om de genetische resistentie tegen malaria te verhogen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle microinjectie van transgenen in Anopheles stephensi.
- Ontwikkeling van muggen die resistentie tegen malaria vertonen.
- Demonstratie van de toepasbaarheid van technieken op andere soorten.
- Potentiële implicaties voor strategieën ter bestrijding van malaria.
Conclusies
- Microinjectie is een levensvatbare methode voor het creëren van transgene muggen.
- Transgene Anopheles stephensi kunnen worden ontwikkeld voor resistentie tegen malaria.
- Deze technieken kunnen bijdragen aan het verminderen van de overdracht van malaria.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Managers
Genetische modificatie van ziektevectoren biedt een preventieve strategie voor de bestrijding van infectieziekten door transmissie bij de bron aan te pakken. Micro-injectietechnieken maken nauwkeurige kiemlijn-transformatie in muggen mogelijk, wat de validatie van targets voor antiparasitaire interventies ondersteunt. Deze aanpak draagt bij aan mechanische risicoreductie in vroege fasen van vectorbestrijdingsprogramma's door een schaalbare methode te bieden om gene drive- en resistentiemechanismen te evalueren.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt functionele analyse van antiparasitair genen in vivo mogelijk om targets voor transmissie-blokkerende strategieën te valideren.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbare methode voor het genereren van transgene lijnen voor fenotypische screening van malaria-resistentiekenmerken.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gestandaardiseerde muggenembryo's voor kwantitatieve beoordeling van transgene expressie en parasietremming.
- Operationele waarde: Vestigt een platform voor high-throughput screening van genetische constructen die de vectorcompetentie beïnvloeden.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt de evaluatie van ziekterelevante systemen door genetische modificaties te koppelen aan een verminderde ontwikkeling van Plasmodium falciparum in muggen.
- Operationele waarde: Maakt continuïteit mogelijk van genontdekking naar preklinische validatie via stabiele transgene muggenlijnen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De micro-injectieworkflow past binnen het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek door doelwitvalidatie, de generatie van assay-klare modellen en fenotypische read-outs voor transmissie-blokkerende kandidaten mogelijk te maken.
- Discovery Biology: Faciliteert hypothesetoetsing van antiparasitaire mechanismen via embryo-microinjectie en kenmerkanalyse.
- Screening: Produceert gestandaardiseerde embryo's die geschikt zijn voor assay-ontwikkeling en evaluatie van verbindingen of genetische constructen.
- Analytics: Maakt kwantitatieve meting van de parasitaire belasting en overlevingspercentages mogelijk als afhankelijke variabelen bij resistentiescreening.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt genetische modificaties met preklinische resultaten via beoordeling van het fenotype van adulte muggen en paringsstudies.
- Herbruikbaarheid binnen de organisatie: Vestigt een herbruikbaar platform voor iteratieve tests van genetische interventies over verschillende vectorensoorten heen.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid bij targetvalidatie door directe fenotypische observatie van malariaresistentie in transgene muggen.
- Operationele waarde: Gestandaardiseerde protocollen voor embryo-preparatie en injectie verbeteren de reproduceerbaarheid tussen laboratoria.
- Strategische waarde: Ondersteunt go/no-go-beslissingen door biologische onzekerheid in transmissie-blokkerende benaderingen te verminderen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van genetische constructen mogelijk op basis van aangetoonde resistentiefenotypes.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in muggenembryologie en micro-injectie-instrumentarium.
- Afhankelijkheid van de bereiding van kwartsnaalden en precieze drukcontrole tijdens de injectie.
- Vereist het behoud van isotone buffers en omgevingscontroles voor de levensvatbaarheid van de embryo's.
- Omvat coördinatie tussen teams uit de entomologie, moleculaire biologie en beeldvormingsgroepen.
- Beperkt door de beschikbaarheid van embryo's en de injectie-efficiëntie, wat de doorvoersnelheid en schaalbaarheid beïnvloedt.
