Name: Blauwe Inheemse polyacrylamidegelelektroforese (BN-PAGE) voor de Analyse van multiprotein complexen van Cellular Lysaten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-24T18:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Leer multiproteïnecomplexen karakteriseren uit cellysaten met blauwe native PAGE. Deze methode behoudt eiwitinteracties en analyseert complexen via tweedimensionale SDS-PAGE.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Michael Reth, Hermann Schägger, en Margarita Camacho-Carvajal voor de wetenschappelijke ondersteuning. Dit werk werd gefinancierd door FORSYS van het Bundesministerium für Bildung en Forschung (BMBF), door BIOSen van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), en mede ondersteund door de Excellence initiatief van de Duitse federale en deelstaatregeringen (SGR-4, Spemann Graduate School ).

<ol><li>Arnold, I., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+mitochondrial+F1F0-ATP+synthase+exists+as+a+dimer%3A+identification+of+three+dimer-specific+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Yeast mitochondrial F1F0-ATP synthase exists as a dimer: identification of three dimer-specific subunits.</a> EMBO J. 17 (24), 7170-7178 (1998).</li>
<li>Camacho-Carvajal, M. M., Wollscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+Blue+native%2FSDS+gel+electrophoresis+of+multi-protein+complexes+from+whole+cellular+lysates%3A+a+proteomics+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional Blue native/SDS gel electrophoresis of multi-protein complexes from whole cellular lysates: a proteomics approach.</a> Mol. Cell. Proteomics. 3 (2), 176-182 (2004).</li>
<li>Heiss, K., Junkes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subproteomic+analysis+of+metal-interacting+proteins+in+human+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Subproteomic analysis of metal-interacting proteins in human B cells.</a> Proteomics. 5 (14), 3614-3622 (2005).</li>
<li>Sali, A., Glaeser, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+words+to+literature+in+structural+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">From words to literature in structural proteomics.</a> Nature. 422, 216-225 (2003).</li>
<li>Schägger, H., Cramer, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal. Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li>
<li>Schägger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Anal. Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).</li>
<li>Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylation+of+protein+complexes+may+lead+to+aggregation+as+well+as+to+loss+of+subunits+as+revealed+by+Blue+Native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Biotinylation of protein complexes may lead to aggregation as well as to loss of subunits as revealed by Blue Native PAGE.</a> J Immunol Methods. 252 (1-2), 171-174 (2001).</li>
<li>Schamel, W. W., Arechaga, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexistence+of+multivalent+and+monovalent+TCRs+explains+high+sensitivity+and+wide+range+of+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Coexistence of multivalent and monovalent TCRs explains high sensitivity and wide range of response.</a> J. Exp. Med. 202, 493-503 (2005).</li>
<li>Schamel, W. W., Reth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monomeric+and+oligomeric+complexes+of+the+B+cell+antigen+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Monomeric and oligomeric complexes of the B cell antigen receptor.</a> Immunity. 13 (1), 5-14 (2000).</li>
<li>Swamy, M., Minguet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+native+antibody-based+mobility-shift+technique+%28NAMOS-assay%29+to+determine+the+stoichiometry+of+multiprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A native antibody-based mobility-shift technique (NAMOS-assay) to determine the stoichiometry of multiprotein complexes.</a> J Immunol Methods. 324 (1-2), 74-83 (2007).</li>
<li>Swamy, M., Siegers, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28BN-PAGE%29+for+the+identification+and+analysis+of+multiprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for the identification and analysis of multiprotein complexes.</a> Sci STKE. 2006 (345), 4-4 (2006).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+applications+of+blue-native+and+clear-native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Features and applications of blue-native and clear-native electrophoresis.</a> Proteomics. 8, 3974-3990 (2008).</li>
</ol>

In deze studie beschrijven we de analyse van de mediterrane partnerlanden door BN-PAGE. Een 2D-aanpak wordt gebruikt om eerst aparte mediterrane partnerlanden onder natieve omstandigheden, en vervolgens om verder te verdelen in hun afzonderlijke componenten door een tweede dimensie SDS-PAGE. Monsters worden bereid uit cellysaten. Voor de oplosbaarheid van een groot aantal mediterrane partnerlanden, is een geschikt reinigingsmiddel nodig, die behoudt de structuur van het eiwit complexen. Hier maken we gebruik van 0,1% Triton X-100. Echter, de optimale wasmiddel en de geschikte concentratie moeten empirisch worden bepaald voor elke MPC. In het geval van Triton X-100, bijvoorbeeld, heeft gemeld dat lage concentraties detergent de identificatie van een dimeer vorm van de F 1 staat F 0-ATPase complex (Arnold, Pfeiffer et al.. 1998). Hogere Triton X-100-concentraties, echter leiden tot de dissociatie van het dimeer en een corresponderende toename van de monomere F 1 F 0-ATPase complex. Dit is in lijn met een van onze vroegere studies werden we zien dat de multivalente T-cel-receptor complex (TCR) is behouden wanneer geëxtraheerd met lage concentraties van Brij 96, terwijl het gebruik van hogere concentratie of van een ander schoonmaakmiddel digitonine resultaten genoemd in de winning van monomere TCR (Schamel, Arechaga et al.. 2005). Veelgebruikte detergenten die getest kunnen worden zijn onder digitonine (0,5 tot 1%), Triton X-100 (0,1 tot 0,5%), Brij 96 (0,1 tot 0,5%), of dodecylmaltoside (0,1 tot 0,5%). Deze reagentia zijn niet-ionische detergenten, die meestal het beste voor MPC stabiliteit. Wees ervan bewust dat contact met de SDS en andere sterke reinigingsmiddelen moet worden vermeden (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al.. 2004). Dialyse van de lysaten nodig is om MPC scheiding in een BN-gel (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al. 2004). Bereiken; (Heiss, Junkes et al. 2005.). Het lijkt erop dat de aanpassing van de zoutconcentratie of de verwijdering van een laag moleculair gewicht onzuiverheden is van cruciaal belang voor een hoge resolutie. Het is opmerkelijk dat ook de membraan de voorbereidingen en de mediterrane partnerlanden, die zijn immunopurified en later geëlueerd van het antilichaam, zijn geschikt voor BN-PAGE (Swamy, Siegers et al.. 2006). In beide gevallen hebben de monsters niet te worden gedialyseerd voor BN-pagina scheiding, als membraan lysis of elutie wordt uitgevoerd in BN-lysis buffer. Voor eiwit scheiding door BN-PAGE, is de kleurstof Coomassie blauwe nodig, die unspecifically bindt aan eiwitten en dekt ze met negatieve ladingen. Daarbij Coomassie blauw maakt de elektroforetische mobiliteit van eiwitten naar de kathode bij een neutrale pH (Schägger en von Jagow 1991); (Schägger, Cramer et al. 1994.). Bovendien, Coomassie blauw voorkomt eiwitaggregatie in het stapelen gel tijdens de elektroforese. Voor de BN-PAGE, Coomassie G250 moet worden gebruikt in plaats van Coomassie blauw R250 of colloïdale Coomassie blues. Voordat u een BN-gel, is het noodzakelijk om ervoor te zorgen dat het percentage van de gel past op de verwachte grootte van de MPC van belang. Prefab BN-gels met verschillende hellingen en geschikte buffers zijn verkrijgbaar bij Invitrogen (NativePAGE Novex Bis-Tris Gel System). Maar BN-gels kunnen ook worden bereid met behulp van een gradiënt mixer, samen met een persistaltic pomp. Het garanderen van een intact gradiënt, moet de vloeistof continu stroom tijdens het storten en bellen moet worden vermeden. Wij raden het laden van de verschillende verdunningen monster op de gel, omdat overbelasting kan leiden tot eiwit neerslag tijdens het elektroforese proces. Daarnaast moet BN-gels worden uitgevoerd bij 4 ° C om eiwitafbraak te voorkomen en te houden van de mediterrane partnerlanden intact. Na de BN-PAGE, visualisatie van de mediterrane partnerlanden kan worden bereikt door Coomassie brilliant blue kleuring, zilverkleuring of immunoblotting. Eiwitbanden gevisualiseerd door Coomassie of zilverkleuring zijn geschikt voor verdere analyse met behulp van massaspectrometrie (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al.. 2004). In het geval van immunoblotting, de optimale overdracht van voorwaarden voor de mediterrane partnerlanden van belang te hebben empirisch worden bepaald. Wees ervan bewust dat Coomassie blauw ook wordt overgedragen tijdens blotting van een BN-gel. Daarom zal de gel kleurloos zijn na de succesvolle overdracht, terwijl het membraan zal een blauwe kleur uit te oefenen. Verder is het belangrijk om te vermelden dat niet elke primaire antilichaam, die werkt voor de detectie na SDS-PAGE, is van toepassing op immunoblotting bij de BN-PAGE. Het kan gebeuren dat niet antilichamen doen MPC van belang te herkennen omdat hun epitoop is verborgen in de natieve conformatie van de eiwitten. Om dit probleem te verhelpen, is het mogelijk om de eiwitten te denatureren binnen de BN-gel voorafgaand aan de overdracht door koken van de gel binnenkort in 1x SDS sample buffer. In ons voorbeeld hebben we niet direct onder de BN-gel om detectie van eiwit bands. In plaats daarvan hebben we verder onderverdeeld de BN-PAGE gescheiden lysaat door een tweede dimensiop SDS-PAGE. In de tweede dimensie SDS-gel, monomere proteïnen migreren binnen een hyperbolische diagonaal als gevolg van de gradiënt gel in de eerste en de lineaire gel in de tweede dimensie (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al.. 2004). Hierdoor kan de eenvoudige identificatie van de mediterrane partnerlanden, omdat ze zijn gelokaliseerd onder deze hyperbolische diagonaal. Subcomponenten van een welomschreven MPC worden gescheiden in een verticale lijn in de tweede dimensie SDS-PAGE. Componenten die bestanddelen van meerdere dinstinct mediterrane partnerlanden kunnen worden geïdentificeerd op een horizontale lijn op basis van de grootte van het MPC. Echter, het dient te worden beschouwd dat verschillende eiwitten plekken verschijnen in een verticale lijn ook kan deel uitmaken van afzonderlijke complexen die migreren op dezelfde positie in de BN-PAGE. Het definitieve bewijs dat ze aanwezig zijn in dezelfde MPC kan worden verkregen door een antilichaam-gebaseerde gel shift assay. In deze test, is cellulaire lysaat geïncubeerd met een antilichaam tegen een eiwit vertegenwoordigd door een van de geïdentificeerde plekken voorafgaand aan de BN-PAGE. Dit resulteert in een verschuiving van alle mediterrane partnerlanden die dit eiwit bevatten naar een hogere moleculaire massa in de eerste dimensie. Andere eiwitten die ook een deel van deze mediterrane partnerlanden zal ondergaan deze complexe specifieke shift en zijn dus gemakkelijk te herkennen in de tweede dimensie SDS-gel. Niet alleen de samenstelling van de mediterrane partnerlanden kunnen worden geanalyseerd door BN-PAGE, maar ook de bepaling van hun stoichiometrie is mogelijk (Schamel en Reth 2000), (Schamel 2001), (Swamy, Minguet et al. 2007.). Voor dit doel kan een NAMOS assay (native antilichaam-gebaseerde mobiliteit-shift assay) worden uitgevoerd. Net als in de antilichaam-gebaseerde gel shift assay, zijn de cellulaire lysaten geïncubeerd met monoklonaal subunit-specifieke antilichamen. Dit leidt tot de inductie van elektroforetische immunoshifts in de BN-gels, die de gevolgtrekking toestaan ​​van de omvang van de verschuiving op de stoichiometrie van de mediterrane partnerlanden In conlusion, BN-PAGE is geschikt voor de identificatie van mediterrane partnerlanden en de bepaling van hun omvang, samenstelling, evenals de relatieve overvloed. Uitgevoerd als een NAMOS test, maar biedt ook de mogelijkheid om de stoichiometrie van een bepaalde MPC te bepalen. Gezien de algemene toepasbaarheid, deze techniek is een zeer nuttig hulpmiddel voor de karakterisering van de mediterrane partnerlanden (Dekker, Müller et al. 1996.), (Wittig en Schagger 2008), (Wagner, Rehling et al. 2009.), (Wittig en Schägger 2009) .

blauwe inheemse polyacrylamidegelelektroforese (bn-page) voor de analyse van multiprotein complexen van cellular lysaten

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Multiprotein complexen (MPL) spelen een cruciale rol in cell signaling, omdat de meeste eiwitten zijn te vinden in functionele of regelgeving complexen met andere eiwitten (Sali, Glaeser et al.. 2003). Zo is de studie van eiwit-eiwit interacties netwerken vereist de gedetailleerde karakterisering van de mediterrane partnerlanden te krijgen een integratieve begrip van eiwit-functie en regulatie. Voor identificatie en analyse, moet mediterrane partnerlanden worden gescheiden onder natieve omstandigheden. In deze video, beschrijven we de analyse van de mediterrane partnerlanden door de blauwe inheemse polyacrylamide gel elektroforese (BN-PAGE). BN-PAGE is een techniek dat de scheiding van de Mediterrane partnerlanden staat in een natieve conformatie met een hogere resolutie dan die door gel-filtratie of sucrose dichtheid ultracentrifugatie, en is daarom nuttig om te bepalen MPC omvang, samenstelling, en relatieve rijkdom (Schägger en von Jagow 1991) ; (Schägger, Cramer et al. 1994.). Door deze methode worden de eiwitten gescheiden op basis van hun hydrodynamische grootte en de vorm in een polyacrylamide matrix. Hier tonen we de analyse van de mediterrane partnerlanden van het totale cellulaire lysaten, erop te wijzen dat lysaat dialyse is de cruciale stap om BN-PAGE te maken van toepassing zijn op deze biologische monsters. Met behulp van een combinatie van de eerste dimensie BN-en de tweede dimensie SDS-PAGE, laten we zien dat mediterrane partnerlanden gescheiden door BN-PAGE kan verder onderverdeeld worden in hun afzonderlijke bestanddelen door middel van SDS-PAGE. Visualisatie van de MPC componenten op gel scheiding wordt uitgevoerd door standaard immunoblotting. Als een voorbeeld voor MPC analyse door BN-PAGE, hebben we gekozen voor de goed gekarakteriseerde eukaryotische 19S, 20S en 26S proteasomen.

In deze video, beschrijven we de karakterisering van multiprotein complexen (MPL), door blauwe inheemse polyacrylamide gel elektroforese (BN-PAGE). In een eerste dimensie, worden gedialyseerd cellulaire lysaten gescheiden door BN-PAGE om individuele Mediterrane partnerlanden te identificeren. In een tweede dimensie SDS-PAGE, zijn mediterrane partnerlanden van belang verder onderverdeeld naar hun kiezers te analyseren door immunoblotting.

Blauwe Inheemse polyacrylamidegelelektroforese (BN-PAGE) voor de Analyse van multiprotein complexen van Cellular Lysaten

Multiproteïnecomplexen (MPC's) spelen een cruciale rol bij celsturing, aangezien de meeste eiwitten voorkomen in functionele of regulatoire complexen met andere ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het karakteriseren van een MultiPro-complex uit cellulaire lysaten middels blue native polyacrylamidegelelektroforese, wat in tegenstelling tot SDS-PAGE eiwitscheiding onder natieve omstandigheden mogelijk maakt en eiwit-eiwitinteracties behoudt. Dit wordt bereikt door het cellulaire lysaat te dialyseren om overtollige zouten te verwijderen, waardoor het monster in een tweede stap geschikt is voor scheiding via blue native PAGE. Het lysaat wordt aangebracht op een eerste dimensie blue native PAGE, die eiwitcomplexen onder natieve omstandigheden scheidt op basis van hun grootte en vorm.Vervolgens volgt een tweede dimensie. Denaturerende SDS-PAGE wordt uitgevoerd om de complexen onder te verdelen in hun individuele bestanddelen. Eiwitten kunnen worden gevisualiseerd door middel van zilver- of Coomassie-kleuring of western blotting.In de volgende demonstratie werden gescheiden eiwitten aangetoond met zilverkleuring, maar er zal gebruik worden gemaakt van western blotting. Hallo, ik ben Brita Bloom van het laboratorium van Wolfgang Sharmel van de afdeling Moleculaire Immunologie aan het Max Planck Instituut voor Immunobiologie in Freiburg, Duitsland. Hallo, ik ben Dina Fiala.Ik ben ook van het Sham Lab. Vandaag laten we u een procedure zien voor de analyse van MultiPro-complexen uit cellulaire lysaten. Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de samenstelling van multisubunit membraanreceptoren te bestuderen.In deze video gebruiken we echter het tic-proteasoom als voorbeeld. Laten we beginnen. Bereid vóór aanvang van deze procedure alle buffers voor zoals beschreven in het schriftelijke protocol en bewaar deze bij 4 °C.Oogst 10 miljoen HEC 2 9 3 cellen en pellet deze door centrifugatie bij 350 ×g gedurende vijf minuten bij 4 °C. Was de celpellets vervolgens met 1 mL ijskoud PBS en pellet de gewassen cellen opnieuw door centrifugatie. Herhaal deze wasstap tweemaal en resuspendeer de gewassen celpellet vervolgens in 250 µL ijskoud PBS.Voeg koud blauwe, native lysisbuffer toe en incubeer de suspensie 15 minuten op ijs. Centrifugeer na incubatie de levende cellen 15 minuten bij 13.000 ×g bij 4 °C om onoplosbaar materiaal te verwijderen. Maak ondertussen met de verhitte, grote diameter zijde van een pastapipet een gaatje in de dop van een 1,5 ml microcentrifugebuisje.Plaats de buis vervolgens op ijs om af te koelen tot vier graden Celsius. Zodra de centrifugatie is voltooid, brengt u het lysaat over naar de buis voor zoutverwijdering door dialyse. Plaats een dialysemembraan met een cutoff van 10 kilodalton bovenop de open buis.Sluit de dop en knip het overtollige dialysemembraan dat uitsteekt af. Seal vervolgens voorzichtig de zijkant van de dop met parafilm. Zodra dit is verzegeld, draait u de buis om en plaatst u deze ondersteboven in een conische buis van 50 milliliter. Centrifugeer het monster gedurende 10 seconden op de laagst mogelijke snelheid.Bereid in een celcultuurecentrifuge een bekerglas van 100 milliliter voor met koude blue native dialysebuffer en een magnetische roerstaaf, waarbij ten minste 10 milliliter blue native dialysebuffer per 100 microliter monster wordt gebruikt. Verwijder vervolgens de omgekeerde buis uit de conische buis met een pincet, om te voorkomen dat de buis rechtop komt te staan.Zet de buis met tape ondersteboven in het bekerglas en verwijder eventuele luchtbellen uit het gat onder de dop. Schakel met een gebogen Pasteurpipet het magnetisch roeren in en laat het monster zes uur of een nacht in de koelruimte dialyseren. Controleer het monster af en toe om er zeker van te zijn dat het roeren geen luchtbellen bij het dialysemembraan veroorzaakt.Breng na incubatie het gedialyseerde cellysaat over in een nieuwe gekoelde microcentrifugebuis en laat dit op ijs staan tot het laden van de gelgradiënt. Het gieten van de gel gebeurt bij kamertemperatuur met een gradiëntmenger. Plaats de gradiëntmenger op een roerplaat en sluit deze aan op een stuk flexibele slang.Sluit het kanaal van de gradiëntmenger af met het ventiel en sluit de slang af met een klem. Plaats een magnetische roerstaaf in de cilinder die aan de slang is verbonden. Leid vervolgens de flexibele slang door een peristaltische pomp en bevestig een injectienaald aan het uiteinde.Plaats vervolgens de naald tussen de twee glasplaten bovenaan het gelelectroforese-apparaat. Bereid 4%- en 15% scheidingsgel-oplossingen voor, zodat de gecombineerde volumes gelijk zijn aan het volume van de scheidingsgel. Voeg onmiddellijk daarvoor een PS en TM toe.Gebruik de gelluoplösungen en giet deze in de overeenkomstige cilinders van de gradiëntmenger. Zet vervolgens het apparaat aan en open de klep. Druk op de linker cilinder om de luchtbel in het kanaal dat de twee gelreservoirs verbindt, naar buiten te drukken.Zet de pomp aan op vijf milliliter per minuut. Verwijder de klem en laat de gel langzaam tussen de glasplaten stromen. Til de naald langzaam op terwijl de gel pauzeert, waarbij u ervoor zorgt dat de naald zich altijd boven de vloeistof bevindt.Laat alle vloeistof in de gelapparatuur lopen. Bedek de vloeistof vervolgens voorzichtig met isopropanol en spoel de apparatuur af met gedestilleerd water. Laat de gel minstens 30 minuten polymeriseren bij kamertemperatuur.Bereid vervolgens een 3,2% stackinggel voor door vlak voor gebruik PS en TM toe te voegen. Giet de stackinggel bovenop de separatiegel en plaats de kam tussen de glasplaten, waarbij luchtbellen worden vermeden. Nadat de stackinggel is gepolymeriseerd, wordt de gel vlak voor het laden van de monsters afgekoeld tot vier graden Celsius.Verwijder de kam door deze langzaam onder een hoek ten opzichte van het vlak van de gel naar buiten te trekken. Hierdoor kan lucht snel in de holtes treden, wat de kwaliteit van de wells verbetert. Om het gedialyseerde cellysaat te scheiden via blue native page, breng dan 20 µL van de ferritine-marker en 40 µL van het gedialyseerde lysaat aan in de droge wells bij 4 °C. Vul lege banen met gelijke volumes dialysebuffer. Bedek de monsters in elke well vervolgens met koude kathodebuffer.Vul de binnenkamer met koude kathodebuffer en de alsa-kamer met koude anodebuffer. Werk bij vier graden Celsius en breng 100 volt aan totdat de monsters in de scheidingsgel zijn ingetreden. Verhoog vervolgens het voltage naar 180 volt en laat de gel lopen totdat het kleurfront het einde van de gel bereikt.De run duurt drie tot vier uur. Bereid voor de tweede dimensie SDS-page een standaard 10% SDS-gel voor met één brede baan. Eén baan voor de moleculaire gewichtsmarker en één baan voor een aliquot van de gedialyseerde lysaatcontrole die is gemengd met SDS-monsterbuffer en vijf minuten is gekookt bij 95 °C; verwijder de blue native page-gel in de platen uit het elektroforeseapparaat en wip voorzichtig één plaat omhoog.Verwijder de stapelgel en snijd de baan uit de blue native page-gel die de eiwitten van belang bevat. Plaats het segment van de blue native page-gel in SDS-monsterbuffer en laat dit na incubatie 10 minuten bij kamertemperatuur op een schudmachine incuberen. Kook het gelsegment kort in een magnetron en laat het vervolgens nogmaals 15 minuten incuberen.Verwijder de kam van de SDS-gel terwijl deze op een schudplaat in de SDS-monsterbuffer staat en vul de putjes met SDS-buffer. Plaad de Blue Native PAGE-gelsnijde in het grote putje van de SDS-gel. Vermijd luchtbellen. Eventueel kan een pincet worden gebruikt, aangezien de gelsnijde exact op de stapelgel moet liggen.Bedek de slice met SDS-monsterbuffer en load vervolgens de marker en de lysaatcontrole. Voer elektroforese en proteïnetransfer uit volgens standaardprotocollen. Voor de interpretatie van de resultaten is het belangrijk om te weten dat de positie van een proteïne in de tweede dimensie van de blue native SDS-PAGE bewijs levert of de proteïne deel uitmaakt van een MultiPro-complex of niet.Monomere eiwitten zullen in een hyperbolische diagonaal migreren als gevolg van de gradiëntgel in de eerste dimensie, en als een lineaire gel in de tweede dimensie; subeenheden van MultiPro-complexen zullen zich onder de diagonaal bevinden en een verticale lijn vormen. Als een bepaald eiwit deel uitmaakt van verschillende complexen, worden meerdere spots in een horizontale lijn gedetecteerd. Samenvattend maakt de tweedimensionale blue native page SDS-page benadering de bepaling van de samenstelling, grootte en de relatieve abundantie van MultiPro-complexen mogelijk.In deze demonstratie werden verschillende proteasomen of subeenheden aangetoond via western blotting. De subeenheden bèta twee en MCP 21 konden worden gedetecteerd als individuele spots die verticaal zijn gerangschikt, wat aangeeft dat ze deel uitmaken van dezelfde complexen. PA 28 bevindt zich in één verticale lijn met bèta twee en CP 21 en maakt derhalve deel uit van hetzelfde complex.Kijkend naar de horizontale lijnen is te zien dat beta twee en MCP 21 deel uitmaken van drie verschillende complexen. PA 28 wordt slechts in één van die complexen aangetroffen. Daarom kunnen deze MultiPro-complexen worden geïdentificeerd als het 20s-proteasoom.Samen met P 28 en het 20 S proteasoom alleen, hebben we zojuist aangetoond hoe u native MultiPro-complexen uit een cellulair lysaat kunt scheiden en karakteriseren met behulp van blue native page. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om eraan te denken het monster zorgvuldig te dialyseren. Om contact met SDS te vermijden en altijd bij vier graden te werken, raden wij aan om verschillende detergentia voor cellulaire lyse te vergelijken om zowel de integriteit van de motor-proteïnecomplexen als de beste solubilisatie te bereiken.Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten. Ik ga nu afsluiten.

blue-native-polyacrylamide-gel-electrophoresis-bn-page-for-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze technische artikel beschrijft een standaard western-blot procedure met behulp van de commercieel verkrijgbare NuPAGE elektroforese Mini-Gel systeem van Invitrogen.

Western blotting Met behulp van de Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels

This video demonstrates a denaturing polyacrylamide-based separation technique for proteins. This technique helps in the preliminary identification of proteins based on their molecular weights.

Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis for Protein Analysis: A Technique to Separate and Visualize Proteins Based on Molecular Weight

In this video, we demonstrate an electrophoretic technique, called blue native PAGE, for the analysis of mitochondrial respiratory protein complexes in their natively folded and functionally active state. The anionic Coomassie blue dye causes the protein complexes to become negatively charged, allowing separation based on size and structure.

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis: A Non-Denaturing Separation Technique for Analysis of Intact Mitochondrial Respiratory Chain Complexes

This video describes multimeric PAGE for separating native protein complexes from tissue homogenates. The technique is a hybrid of blue native-PAGE and SDS-PAGE techniques. The separated complexes can be characterized and studied for their role in cell functioning.

Multimer-PAGE for Separating Native Protein Complexes: A Hybrid Separation Technique Consisting of Blue Native-PAGE and SDS-PAGE to Separate Intact Multimeric Proteins From Tissue Lysate

In this video, we demonstrate a two-dimensional gel electrophoresis method that separates individual proteins from a complex protein mixture obtained from tumor tissues of human nonfunctional pituitary adenoma (NFPA). The proteins are separated based on their electric charge in the first dimension and further separated based on molecular weights in the second dimension.

Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis: A Separation Technique for Analysis of Proteins in Complex Protein Mixture Based on Charge and Molecular Weight

Dit protocol beschrijft hoe je clear native gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis (CN-GELFrEE) kunt voorbereiden en uitvoeren, een native scheidingstechniek voor niet-covalente biomoleculaire assemblages en eiwitten uit heterogene monsters die compatibel is met verschillende downstream-eiwitanalysetechnieken.

CN-GELFrEE - Clear Inheems Gel-uitgewassen vloeibare fractie Entrapment elektroforese

Een werkwijze voor het stabiliseren en scheiden van natieve eiwitcomplexen van ongewijzigd weefsellysaat onder toepassing van een amino-reactieve eiwit-crosslinker gekoppeld aan een nieuw tweedimensionaal polyacrylamide gelelektroforese (PAGE) systeem wordt gepresenteerd.

Multimeer-PAGE: Een methode voor het vastleggen en oplossen eiwitcomplexen Biological Samples

Hier presenteren we protocollen voor affiniteitszuivering van eiwitcomplexen en hun scheiding door blauwe natieve PAGE, gevolgd door proteïne correlatie profilering middels label vrije kwantitatieve massaspectrometrie. Deze methode is nuttig voor interactomen in verschillende proteïnecomplexen lossen.

Het oplossen van Affiniteit gezuiverde eiwit complexen door Blue inheemse PAGE en Protein Correlatie Profiling

Hier presenteren we een protocol voor het analyseren van de samenstelling van de eiwitten van groot eiwit: eiwit en eiwit: nucleïnezuur complexen van koolzaad (B. napus) floëem afgescheiden met behulp van een 3D polyacrylamide-gel elektroforese (pagina) aanpak combineren blauw native (BN) met twee denatureren pagina's, gevolgd door massaspectrometrische identificatie.

Floëem Sap bemonstering van Brassica napus voor 3D-pagina van eiwit en Ribonucleoprotein complexen

Een protocol voor het ontrafelen van plant thylakoïde eiwit complexe organisatie en samenstelling met blauwe inheemse polyacrylamide gel elektroforese (BN-pagina) en 2D-SDS-pagina wordt beschreven. Het protocol is geoptimaliseerd voor Arabidopsis thaliana, maar kan worden gebruikt voor andere plantensoorten met kleine wijzigingen.

Analyse van eiwitcomplexen thylakoïde membraan door blauwe inheemse gelelektroforese

Dit protocol wordt de analyse van mitochondriale respiratoire ketencomplexen blauwe inheemse polyacrylamide-gel-elektroforese. De methode toegepast op gekweekte menselijke cellen wordt hier beschreven.

Analyse van mitochondriale respiratoire ketencomplexen in gekweekte menselijke cellen met blauwe Native Polyacrylamide-Gel-elektroforese en Immunoblotting

Leer multiproteïnecomplexen karakteriseren uit cellysaten met blauwe native PAGE. Deze methode behoudt eiwitinteracties en analyseert complexen via tweedimensionale SDS-PAGE.

Blauwe Inheemse polyacrylamidegelelektroforese (BN-PAGE) voor de Analyse van multiprotein complexen van Cellular Lysaten

Meer video's verkennen