Name: Transnuclear Muizen met vooraf gedefinieerde T-cel-receptor Bijzonderheden tegen Toxoplasma gondii Verkregen via SCNT (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: Leer SCNT-toepassing voor het genereren van muizen met specifieke T-celreceptoren tegen Toxoplasma gondii. Deze methode versnelt onderzoek naar auto-immuniteit, infectieziekten en kanker.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs zijn dankbaar voor H. Eisen, M. Gubbels, K. van Grinsven, E. Guillen, A. Drake, V. Mahajan, Q. Gao, en G. Yap voor vruchtbare discussies en reagentia. Wij zijn dankbaar voor J. Dausman, R. Flannery, en J. Jackson voor hulp bij het beheer van de muis kolonie. Wij zijn dankbaar voor P. Wisniewski voor FACSorting. EMF werd ondersteund door de Human Frontiers Science Program. RJ werd ondersteund door het National Institute of Health beurzen RO1-HD045022 en R37-CA084198. HLP werd ondersteund door subsidies van de National Institute of Health.

Deze methode werd gebruikt in het onderzoek gerapporteerd in <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/328/5975/243">Kirak et al.., Science 328 (5975), 243-248 (2010)</a> . 1. Isolatie van donorcellen Voor specifieke T-of B-cellen kan worden gebruikt als donor cellen om transnuclear muismodellen genereren muizen moeten worden besmet met een ziekteverwekker van belang of geïmmuniseerd met een antigeen van belang. Aangezien wij gebruik hebben gemaakt van CD8 + cellen die specifiek zijn voor Toxoplasma gondii, zal het volgende protocol beschrijft de generatie en het isolement van deze cellen en moet worden aangepast aan persoonlijke interesse. <ol><li> Cysten afgeleid van een muis hersenhomogenaat (ongeveer 40) worden geïnjecteerd intra-peritoneaal in BL / 6 x Balb / c F1 (B6CF1) muizen, die isolatie van zowel H-2 b en H-2 d beperkte CD8 + T-cellen mogelijk maakt. </li><li> Op het hoogtepunt van de immuunrespons, de geïnfecteerde muis is gedood, de milt geïsoleerd en geplaatst in een schotel met 6 ml rode bloedcellen (RBC) lysis buffer. </li><li> Met behulp van de matte zijkanten van twee dekken dia's, is de milt zorgvuldig grond en geïncubeerd in het RBC-lysis buffer voor 5 min bij RT. </li><li> Voeg 14 ml PBS, filter de celsuspensie door middel van een cel-zeef (40 of 70 micrometer) in een 50 ml Falcon buis en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300g. </li><li> Supernatant te verwijderen, resuspendeer de cel pellet in 1 ml PBS en breng in een 1,5 ml Eppendorf buis. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300g en daarna verwijder het supernatant. </li><li> Resuspendeer de cel pellet in 50 ul PBS, voeg fluorescent gelabelde antilichamen tegen het celtype van belang (bijvoorbeeld CD3, B220, CD8 en CD4) te identificeren, en fluorescent gelabelde MHC-I tetrameer (MHC-II tetrameer voor de CD4 T-cellen) geladen met het peptide van belang zijn voor de celsuspensie en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C. </li><li> Voeg 1 ml PBS, centrifugeer 5 minuten bij 300 g, hersuspenderen pellet in 3 ml PBS, en filter de celsuspensie door middel van een cel-zeef (40 of 70 micrometer) in een buis. </li><li> Voer FACSorting door het instellen van de poorten streng (Figuur 1B). </li></ol> 2. Somatic Cell Nuclear Transfer Er zijn een paar protocollen voor Somatic Cell Nuclear Transfer. De hier beschreven wordt gebruik gemaakt van eicellen gearresteerd op metafase-II en de remming van de tweede meiotische deling met behulp van cytochalasine B. Daarom donor cellen nodig zijn die in G0/G1 fase. <ol><li> Voorbereiding van de eicellen <ol><li> Vrouwelijke muizen van BDF1 achtergrond zijn geïnjecteerd intra-peritoneaal met 5IU PMS per muis zeventien-negentien. </li><li> Ongeveer 47 uur later, is elke muis geïnjecteerd intra-peritoneaal met 5IU HCG. </li><li> Bereid een cultuur schotel (KSOM-AA druppels onder olie) voor de eicellen op dezelfde dag als de HCG injectie en ze in een incubator 37 plek ° C, 5% CO 2. Ook de voorbereiding van de naalden die noodzakelijk zijn voor SCNT (7μm voor enucleatie en 4 of 5 urn voor nucleaire transfer van lymfocyten kernen) door ze met kwik. </li><li> Euthanaseren muizen en isoleren eileiders ongeveer 13u na de HCG (ongeveer 8u). Verzamel de eileiders in 1-2 druppels HCZB. </li><li> Een voor een gaan de eileiders in een daling met M2 w / Hyaluronidase. Nick de eileider voorzichtig met een pincet en zet de eicel-cumulus-complex in de drop. Nadat alle eicel-cumulus-complexen zijn geïsoleerd, de schotel wordt geïncubeerd bij 37 ° C. </li><li> Na 2-5 minuten (de exacte tijd hangt af van de partij Hyaluronidase) het verzamelen van de eicellen, wassen in HCZB en plaat ze in KSOM-AA druppels. </li></ol></li><li> Enucleatie van eicellen <ol><li> Gebruik het deksel van een petrischaaltje de SCNT plaat voor te bereiden. Stel de microscoop en de micromanipulator. </li><li> Was de naald enucleatie (7 micrometer) in PVP alvorens te beginnen met enucleatie. </li><li> Voor enucleatie, plaats een groep van eicellen (10-30) in een druppel HZCB met cytochalasine B (5 ug / ml). Terwijl de incubatie (min. 5 min) line-up van de eicellen horizontaal. </li><li> Neem een ​​eicel en plaats deze in de voorkant van de holding naald. Bevestig de eicel naar de holding naald door het toepassen van een vacuüm. Met behulp van de enucleatie naald, draai de eicel tot de chromosoom-spindel-complex (CSC, ook wel de "kern") is in de drie positie. </li><li> Met behulp van piëzo-puls zorgvuldig doordringen in de zona pellucida zonder beschadiging van de eicel. Plaats de opening van de naald naast de metafase-II-as en de toe te passen vacuüm. De "kern" moet langzaam bewegen in de naald, en het membraan moeten zegel zelf zodra deze is volledig verwijderd. </li><li> Zet het enucleated eicellen in de KSOM-AA drops, en was ze meerdere keren. Herhaal de enucleatie stappen met een nieuwe groep van eicellen. Ga door totdat alle eieren zijn enucleated of tot ongeveer 11 uur. </li></ol></li><li> Nuclear Transfer <ol><li> Voor de nucleaire transfer, wisselen de naald enucleatie (7 micrometer) met een nucleaire overloopnaald (4 of 5 micrometer) en was het met PVP. </li><li> Plaats uw cellen van belang (bijvoorbeeld CD8 + T-cellen) in een druppel met PVP, meng goed en incubeer een minimum van 10 minuten. </li><li> Plaats een groep van enucleated eicellen (10-30) in een druppel HCZB met cytochalasine B (2,5 ug / ml). Terwijl de incubatie (min. 5 min) line-up eicellen horizontaal met behulp van de nucleaire overloopnaald. </li><li> Pick-up een donor cel van de PVP-celsuspensie en zuig het in-en-uit tot het buitenste membraan onklaar is geraakt (fragmenten van het membraan en cytosol zichtbaar moeten zijn). Indien nodig een piëzo-puls kan worden toegepast. Zodra een kern is geïsoleerd, beweeg het een beetje in de naald, en verder op te halen kernen tot je 10-30. </li><li> Ga naar de druppel die de lijn enucleated eicellen. Fix een eicel van de holding naald door het toepassen van vacuüm. Plaats de nucleaire overdracht naald (de kernen uit de buurt van de opening), grenzend aan de zona pellucida en piëzo-puls totdat de naald is gegaan door de zona pellucida van toepassing zijn. Voorzichtig bewegen een kern naar het punt van de naald, steek de naald in de eicel tot aan de punt van de naald is 2 / 3 binnen. Breng een kleine onderdruk, zodat er een beetje van de eicel membraan wordt in de naald. </li><li> De volgende stap is zeer kritisch, want het is het enige moment waarop de eicel is eigenlijk "open". Breng een enkele puls met piezo, duw de kern uit van de naald door het toepassen van positieve druk, trek de naald terug, zodat de top is ongeveer 1 / 3 in de eicel, en vervolgens toe te passen negatieve druk en blijven terug te trekken van de naald verzegeling van de eicel. Herhaal deze stap bij elke eicel. </li><li> Nadat alle eicellen van een groep hebben een kern, worden ze gewassen en gekweekt in KSOM-AA media. Herhaal deze procedure met alle eicellen. </li><li> Nadat de laatste groep is culturen in KSOM-AA voor een minimum van 30 min, zijn de SCNT-embryo's overgebracht in druppels van Ca-gratis activering media met SrCl2. </li><li> Na 6 uur van de activering, is de hoeveelheid pseudo-pronuclei (PPN)-positieve SCNT-embryo's bepaald. De embryo's worden vervolgens gewassen en gekweekt in KSOM-AA druppels voor extra 3,5 dagen tot het bereiken van de blastocyst stadium. </li><li> Drugs of chemische producten naar keuze (zoals trichostatine A) kan worden toegevoegd aan de activering en cultuur media. </li></ol></li></ol> 3.Derivation van embryonale stamcellen De SCNT-blastocysten kan worden gebruikt om te zetten in pseudo-zwangere vrouwen (ook bekend als direct of in een stap klonen) of af te leiden embryonale stamcellen (ook bekend als indirecte of in twee stappen klonen). Want het is veel efficiënter om ES cellen te genereren, kiezen we de twee-staps procedure. In het geval dat de wetenschapper geïnteresseerd is in de directe klonen, kan de blastocysten direct worden omgezet in pseudo-drachtige vrouwtjes zoals beschreven in paragraaf 5. Er zijn veel protocollen beschrijven de winning van embryonale stamcellen. De hier beschreven is een standaard techniek, die feeder cellen en foetaal kalf serum gebruikt. <ol><li> De tweede dag na de nucleaire transfer, bereiden een 96-U-wells plaat voor ES-cel afleiding. </li><li> Voeg 100 ul Gelatine in elke well van een 96-U-well plaat, incubeer voor een minimum van 10 minuten, en daarna te verwijderen. </li><li> Dooi feeder-cellen en resuspendeer in een volgens volume van ESD medium, bijvoorbeeld feeder cellen gelijk aan een oppervlakte van 25 cm 2 worden opnieuw gesuspendeerd in 10 ml ESD medium en 200 pi van de celsuspensie wordt toegevoegd aan elk van de gelatine-behandelde goed. </li><li> Zet de plaat in een couveuse en de cultuur bij 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Na 3,5 dag, moet de embryo's in het blastocyst stadium. </li><li> Bereid een steriele bacteriële gerecht door uitplating een paar druppels ES-cel-medium en zure thyrode. </li><li> De blastocysten worden eerst overgedragen van de KSOM-AA druppels in druppels met normale ES-cel-medium en tweemaal gewassen. </li><li> Breng voorzichtig een groep van blastocysten (5-10 blastocysten) in een druppel zuur thyrode en blijf daar totdat de zona pellucida is opgelost. </li><li> De blastocysten worden dan overgebracht naar een druppel met ES medium, twee keer gewassen en vervolgens geplaatst in de feeder-gecoate 96-U-well plaat (een blastocyst tot een goed). </li><li> De embryo's worden vervolgens gekweekt gedurende 5-7 dagen in een incubator bij 37 ° C, 5% CO 2 zonder ze te storen. Dit geeft het embryo de tijd om eenttach aan de feeder-laag, en een uitgroei te vormen. </li><li> Bereid 24-well platen, door uitplating feeders in ESD medium in elk putje, bijvoorbeeld Resuspendeer een equivalent van 50 cm 2 feeder in 12 ml ESD medium, en voeg 500 pi van de celsuspensie in elk putje. </li><li> Voorzichtig de ESD medium uit de 96-U-wells plaat met de embryo's, twee keer wassen elk putje met 250 pi Hepes (of PBS), voeg 50 ul trypsine en incubeer gedurende ongeveer 5 min op 37 ° C. </li><li> Pipet op en neer meerdere malen, totdat uitgroei is gedaald uiteen in een single-celsuspensie, over in een 24-well plaat en incubeer bij 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Als ESC afleiding is gelukt, moet ESC kolonies zichtbaar zijn na 7-10 dagen. </li></ol> 4.Blastocyst injectie De injectie van blastocysten is een routine techniek om elke vorm van transgene muismodel te genereren. Het is belangrijk te vermelden dat de injectie van blastocysten en de daaropvolgende overdracht naar pseudo-zwangere vrouwen moet goed worden getimed. <ol><li> Prime vrouwelijke muizen met PMS en HCG zoals beschreven in paragraaf 2.1. Na de HCG injectie gezet vrouwelijke muizen, samen met mannelijke muizen (een vrouwelijke en een mannelijke muizen per kooi). </li><li> De volgende dag, controleer dan vrouwtjes voor stekkers. Dit wordt geteld als 0.5dpc (dag na de coïtus). </li><li> Bevruchte embryo's worden dan gescheiden van de eileider, zoals beschreven in paragraaf 2.1, en gekweekt in KSOM-AA voor extra 3 dagen. </li><li> Bereid ES-cellen op de dag van blastocyst injectie (3.5dpc). </li><li> Verwijderen medium van ES-cellen, tweemaal wassen met Hepes (of PBS), voeg trypsine en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C. </li><li> Resuspendeer getrypsiniseerd cellen met ES medium, plaat in een schotel, en incubeer 45-60 min. bij 37 ° C, 5% CO 2 tot het bedrag van de feeder-cellen (feeder-cellen hechten sneller dan de ES-cellen) te verminderen. </li><li> Breng de celsuspensie door middel van een cel-zeef (40 of 70 micrometer) in een buis, en centrifugeer gedurende 5 min bij 1000 tpm. </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof, hersuspenderen cel pellet in 500 ui ES medium en op te slaan op ijs totdat het nodig is. </li><li> Bereid het deksel van een steriele bacteriële gerecht door uitplating druppels met PVP en HCZB. </li><li> Bereid een 15 um naald door het laden van met kwik, waardoor het op zijn plaats en wassen met PVP. </li><li> Plaats een groep van blastocysten (10-30 blastocysten) in een druppel met HCZB, en voeg 50-50 uL ES celsuspensie (afhankelijk van de concentratie) in een andere druppel HCZB. </li><li> Pick-up ES-cellen (50-100 cellen) met de injectienaald. </li><li> Ga naar de druppel met de blastocysten. Horizontaal uitlijnen van de blastocysten, en bevestig een naald met het bedrijf door het toepassen van vacuüm. </li><li> Met behulp van de injectienaald draai de blastocyst totdat de binnenste celmassa (ICM) is op de 9 uur positie. </li><li> Plaats uw injectienaald om 3 uur, zorg ervoor dat er geen ES-cellen aan het uiteinde van de naald, en toe te passen piëzo-puls tot de injectienaald dringt door de zona pellucida en de trophectoderm in de blastocoel. </li><li> Laat een paar ES-cellen (5-15 cellen), zodat de ES-cellen vasthouden aan de ICM. Ga door totdat alle blastocysten van een groep zijn geïnjecteerd met ES-cellen. </li><li> Na een groep van blastocysten klaar is, twee keer was ze in KSOM-AA en bewaar ze op een daling met KSOM-AA tot alle blastocysten worden geïnjecteerd. </li></ol> 5. Embryo Transfer De overdracht van embryo's in pseudo-zwangere vrouwen is een chirurgische ingreep, die moet worden uitgevoerd zeer zorgvuldig en volgens de richtlijnen van instituut van de onderzoeker. <ol><li> Verdoof vrouwelijke ontvangende muizen, scheren rechtsonder kwadrant, en ontsmet. </li><li> Met een schaar open de huid en scheiden het buikvlies van de huid. </li><li> Zoek de eierstok via het buikvlies (rode vlek), en open het buikvlies in de nabijheid van de eierstok. </li><li> Met behulp van een tang voorzichtig pak de eileider en trek de baarmoeder. </li><li> Pick-up een groep van ongeveer 10 blastocysten met een capillair verbonden met een mond pipet. </li><li> Bevestig de baarmoeder met een tang, stoot een klein geheel in het met een kleine naald, en steek de capillair met de blastocysten in het lumen van de baarmoeder. </li><li> Voorzichtig laat de embryo in de baarmoeder, en verwijder uw capillair. </li><li> Terug te duwen de baarmoeder in de buikholte. </li><li> Zoek de randen van het buikvlies en sluit deze met een paar steken. </li><li> Sluit de huid van de muis met een paar nietjes. </li><li> Voor post-operatieve pijn, beheren 5 pg Carprofen per mg van het lichaamsgewicht. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2168/2168fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Somatische celkerntransplantatiede overdracht van vooraf gedefinieerde T-cellen in B6CF1 achtergrond. Absolute en relatieve aantallen van embryo's gegenereerd op basis van CD8 + T-cellen en embryonale stamcellen afgeleid van SCNT blastocysten. <img src="/files/ftp_upload/2168/2168fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Vertegenwoordiger flowcytometrische analyse van chimère muizen geïnjecteerd met SCNT embryonale stamcellen. Gate en nummer (procent per totaal CD8 + T-cellen) duidt op de aanwezigheid van specifieke CD8 + T-cellen in chimère muizen.

<ol><li>Schatz, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V%28D%29J+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">V(D)J recombination.</a> Immunol. Rev. 200, 5-5 (2004).</li>
<li>Barnden, M. J., Allison, J., Heath, W. R., Carbone, F. R., R, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+TCR+expression+in+transgenic+mice+constructed+using+cDNA-based+alpha-+and+beta-chain+genes+under+the+control+of+heterologous+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Defective TCR expression in transgenic mice constructed using cDNA-based alpha- and beta-chain genes under the control of heterologous regulatory elements.</a> Immunol. Cell Biol. 76, 34-34 (1998).</li>
<li>Eggan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+vigor%2C+fetal+overgrowth%2C+and+viability+of+mice+derived+by+nuclear+cloning+and+tetraploid+embryo+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 6209-6209 (2001).</li>
<li>Kishigami, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significant+improvement+of+mouse+cloning+technique+by+treatment+with+trichostatin+A+after+somatic+nuclear+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Significant improvement of mouse cloning technique by treatment with trichostatin A after somatic nuclear transfer.</a> Biochem Biophys Res Commun. 340, 183-183 (2006).</li>
<li>Wakayama, T., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+cloning+with+nucleus+donor+cells+of+different+age+and+type%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Mouse cloning with nucleus donor cells of different age and type.</a> Mol Reprod Dev. 58, 376-376 (2001).</li>
</ol>

We hebben hier laten zien dat SCNT gebruikt kan worden om transnuclear muizen van T-cellen met vooraf gedefinieerde specificiteit te genereren. Hoewel het hier niet getoond, moet de techniek ook gebruikt kunnen worden om transnuclear muizen genereren uit B-cellen met vooraf gedefinieerde specificiteit. Een belangrijk ding om te overwegen is de stam en het geslacht van de muis, die besmet is of geïmmuniseerd en wordt gebruikt om T-of B-cellen van belang te isoleren. Omdat T-en B-cellen hebben een zeer lage herprogrammering efficiëntie in het algemeen, raden we met behulp van F1-hybriden van de gewenste haplotype. Omdat de donor cel bepaalt ook het geslacht, raden wij het gebruik T-of B-cellen van mannelijke muizen. Dit houdt in dat alleen mannelijke chimere muizen zou de TCR of BCR verstuurt via de kiembaan, met mannelijke muizen worden eenvoudiger en sneller om te broeden. Bij elkaar genomen, denken we dat epigenetische herprogrammering via SCNT is een krachtig hulpmiddel om een ​​nieuw type muis modellen, die zal van groot voordeel voor de immunologische veld te genereren.

<table><tbody><tr><td>Lysebuffer voor rode bloedcellen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>Celzeef</td><td>BD Biosciences</td><td>REF 352340</td><td></td></tr><tr><td>Serum van drachtige merrie (PMS)</td><td>Calbiochem</td><td>367222</td><td></td></tr><tr><td>Humaan choriongonadotropine (HCG)</td><td>Calbiochem</td><td>230734</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4272</td><td>Type IV-S</td></tr><tr><td>KSOM-AA</td><td>EMD Millipore</td><td>MR-106-D</td><td></td></tr><tr><td>HCZB</td><td>EMD Millipore</td><td>MR-173-D</td><td>Op maat gemaakt medium</td></tr><tr><td>Ca-vrij medium voor activatie</td><td>EMD Millipore</td><td>MR-174-D</td><td>Op maat gemaakt medium</td></tr><tr><td>SrCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>255521</td><td>100mM = 10x</td></tr><tr><td>AlbuMAX I</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11020-021</td><td></td></tr><tr><td>PVP</td><td>MP Biomedicals</td><td>102787</td><td>Maak 10% oplossing met HCZB en voeg 0,1% AlbuMAX I toe</td></tr><tr><td>Cytochalasin B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6762</td><td>500&amp;#x03BC;g/ml = 100x</td></tr><tr><td>Trichostatine A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8552</td><td>5mM = 1000x</td></tr><tr><td>Minerale olie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5310</td><td></td></tr><tr><td>Vasthoudnaald</td><td>Humagen</td><td>MPH-SM-30</td><td></td></tr><tr><td>Injectie- en transfernaalden</td><td>Humagen</td><td>4-15, 7-15, 15-15</td><td></td></tr><tr><td>Mondpipet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>Schaar</td><td>Fine Science Tools</td><td>14088-10</td><td>of iets soortgelijks</td></tr><tr><td>Pincet</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>of iets soortgelijks</td></tr><tr><td>Applicator voor wondclips</td><td>BD Biosciences</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>Wondclips</td><td>BD Biosciences</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>Hechtmateriaal</td><td>Ethicon Inc.</td><td>K871H</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td>15%</td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine</td><td>Lonza Inc.</td><td>17-602E</td><td>100x</td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>MP Biomedicals</td><td>101806</td><td>200mM = 100x</td></tr><tr><td>Niet-essentiële aminozuren</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140050</td><td>100x</td></tr><tr><td>&amp;#946;-Mercapto&amp;#8211;ethanol</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>21985-023</td><td>5&amp;#x03BC;l in 500ml</td></tr><tr><td>LIF</td><td>EMD Millipore</td><td>ESG1106</td><td>1000x</td></tr><tr><td>MEK-remmer</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9900L</td><td>Alleen voor ES-derivatie, toevoegen aan ES-medium (finale concentratie 50&amp;#x03BC;M)</td></tr></tbody></table>

transnuclear muizen met vooraf gedefinieerde t-cel-receptor bijzonderheden tegen toxoplasma gondii verkregen via scnt

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Lymfocyten, zoals T-cellen, ondergaan genetische V (D) J recombinatie, aan een receptor met een bepaalde specificiteit 1 te genereren. Muizen transgene voor een herschikte antigeen-specifieke T-cel receptor (TCR) is een onontbeerlijk instrument om de T-cel ontwikkeling en functie te bestuderen. Maar deze TCRs meestal geïsoleerd van de relevante T-cellen na een lange-termijn cultuur vaak na herhaalde antigen stimulatie, die onvermijdelijk selecteert voor T-cellen met hoge affiniteit. Willekeurige genomische integratie van de TCR α-en β-keten en de expressie van niet-endogene promotors kunnen leiden tot verschillen in expressie niveau en de kinetiek. Epigenetische herprogrammering via somatische celkerntransplantatie is een hulpmiddel om embryonale stamcellen en muizen uit een cel van belang te genereren. Bijgevolg, wanneer SCNT wordt toegepast op T-cellen van bekende specificiteit, zijn deze genetische V (D) J herschikkingen overgebracht naar het SCNT-embryonale stamcellen (SER) en de muizen zijn afgeleid van hen, terwijl de epigenetische markeringen worden gereset. We hebben aangetoond dat T-cellen met vooraf gedefinieerde specificiteit tegen Toxoplasma gondii kan worden gebruikt om muismodellen dat de specifieke TCR uiten van hun endogene loci, zonder experimenteel geïntroduceerde genetische modificatie te genereren. Het relatieve gemak en de snelheid waarmee dergelijke transnuclear modellen kunnen worden verkregen houdt belofte voor de bouw van andere ziekte-modellen.

We zien hier dat epigenetische herprogrammering via Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) kan worden gebruikt als een instrument om muismodellen te genereren met een vooraf bepaalde T-cel receptor (TCR) specifieke kenmerken. Deze transnuclear muizen drukken de overeenkomstige TCR uit hun endogene locus onder de controle van de endogene promotor.

Transnuclear Muizen met vooraf gedefinieerde T-cel-receptor Bijzonderheden tegen Toxoplasma gondii Verkregen via SCNT

Lymfocyten, zoals T-cellen, ondergaan genetische V(D)J-recombinatie om een receptor met een bepaalde specificiteit te genereren1. Muizen die transgeen zijn voor een gerearrangeerde ...

Muizen die transgeen zijn voor antigeenspecifieke T-celreceptoren zijn onmisbaar geweest bij de studie van de ontwikkeling en functie van T-cellen om muismodellen te genereren met vooraf gedefinieerde T-celreceptor-specificiteiten met behulp van somatische celkernoverdracht of SCNT. Een muis wordt geïnfecteerd met een pathogeen van belang. T-cellen worden uit de muis geïsoleerd en vervolgens gezuiverd via fluorescentie-geactiveerde cel sortering.De gezuiverde T-cellen worden vervolgens gebruikt voor somatische celkernoverdracht. Nadat de embryo's het blastocyste-stadium hebben bereikt, worden embryonale stamcellen geïsoleerd. Deze cellen worden vervolgens geïnjecteerd in blastocysten, die daarna worden overgebracht naar pseudodrachtige muizen.De resulterende pups vertonen een uitgesproken toename van de T-celpopulatie van belang, wat gevalideerd kan worden via PAX-analyse. Hallo, mijn naam is Okta AK en ik ben postdoc hier bij het White Institute for Biomedical Research. Vandaag ga ik u laten zien hoe u somatische CLE-transfer blast-assist injecties uitvoert, evenals embryo-transfers.Het belangrijkste voordeel van somatische transfer is dat er muismodellen kunnen worden gegenereerd die hun T-celreceptor tot expressie brengen vanuit de endogene locus, en dus onder controle staan van de endogene promotor, en dat deze muismodellen zeer snel kunnen worden gegenereerd. Somatische vloeistofoverdracht kan worden gebruikt als instrument om muismodellen te genereren met vooraf gedefinieerde T-celreceptor- of B-celreceptorspecificiteiten. Dit is van bijzonder belang voor onderzoekers in vakgebieden zoals autoimmuniteit, infectieziekten en kanker.Om T-cellen te isoleren die specifiek zijn voor een pathogeen zoals Toxoplasma Gandhi, bij muizen die zijn geïnfecteerd via intraperitoneale injectie op het hoogtepunt van de immuunrespons, wordt de milt geïsoleerd uit de geëuthanaseerde muis; de gehomogeniseerde donorcellen worden vervolgens geïsoleerd en geïncubeerd met fluorescentie-gelabelde antilichamen en het juiste tetrameer. Ten slotte wordt FACS-sortering uitgevoerd om pathogeen-specifieke T-cellen te verkrijgen. De avond vóór de procedure voor oocyten-enucleatie.Bereid piso-injectienaalden van vier, vijf en zeven micrometer voor door ze met een injectiespuit retrograad te vullen met kwik. Begin de volgende dag met het protocol voor somatische celkernoverdracht door oocyten te verzamelen en breng deze vervolgens met een mondpipet over naar druppels K-S-O-M-A-A-medium in een Petrischaal. In het deksel van de Petrischaal.Bereid een plaat voor voor het uitvoeren van somatische celkernoverdracht of SCNT door ongeveer 10 druppels PVP, ongeveer 10 druppels HCZB met vijf microgram per milliliter cyto B en ongeveer 10 druppels HCCB met 2,5 microgram per milliliter cyto B aan te brengen. Deze plaat wordt aangeduid als de S-C-N-T-A plaat. Plaats de S-C-N-T-A plaat op de tafel van een omgekeerde samengestelde microscoop.Plaats vervolgens een enucleatienald van 7 µm in de micromanipulator en spoel deze door vijf tot 10 keer PVP-oplossing op te zuigen en weer uit te stoten in de afvalbak. Breng daarna 10 tot 30 in metafase II gearresteerde oocyten over van de Petrischaal naar een van de druppels HCCB met 5 µg/mL Cyto B op de SCNT-plaat. Incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur; richt de oocyten tijdens de incubatie horizontaal uit.Wacht vijf minuten. Gebruik de enucleatienald om een oöcyt voor de holdingnaald te plaatsen. Gebruik een micro-injector om een vacuüm aan te leggen, zodat de oöcyt aan de micropipet-holdingnaald wordt vastgezet.Draai vervolgens de oocyten met de enucleatienald tot het chromosoomspindelcomplex, dat hypertransparant is in vergelijking met het cytoplasma, zich in de drie-uurpositie bevindt; start een piezo-puls door op het pedaal te drukken om de zona pellucida te penetreren. Een piezo-puls is een mechanische puls die longitudinaal reist en de punt van de enucleatienald doet vibreren. De vibraties van de punt helpen bij het boren door de zona pellucida.Zodra de zona pellucida is gepenetreerd, wordt de opening van de nucleatie-naald naast de spoelfiguren van metafase II geplaatst en wordt het vacuüm aangelegd. Het chromosoom-spoelcomplex zal langzaam de naald in bewegen. Zodra de naald wordt verwijderd, moet het membraan zichzelf sluiten.Breng ten slotte de geënucleerde cyten met een mondpipet terug in de K-S-O-M-A-A druppels. Was ze vervolgens met dezelfde pipet door ze van druppel naar druppel in KSOM AA over te brengen. Om de kernoverdracht uit te voeren, vervangt u de enucleatienald van zeven micrometer op de micromanipulator door een kernoverdrachtnaald van vier tot vijf micrometer. Was de naald zoals voorheen met PVP.Plaats de eerder geïsoleerde CD eight positieve T-cellen in een druppel PVP op de S-C-N-D-A plaat. Meng goed en incubeer gedurende ten minste 10 minuten bij kamertemperatuur. Draag vervolgens 10 tot 30 ENUCLEATED cytes over naar een druppel HCZB met 2.5 µg/mL.Incubeer Cyto B op de S ct. A-plaat gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Gebruik tijdens de incubatie de naald voor kernoverdracht om de cytes horizontaal uit te lijnen met behulp van de injectienaald.Neem een donor CD8-positieve cel op uit het PVP-medium en aspireer deze herhaaldelijk totdat het buitenmembraan is afgebroken. Pas indien nodig een piezo-puls toe; fragmenten van het membraan en cytosol moeten zichtbaar worden. Zuig de nucleus op in de naald.Ga vervolgens door met het opnemen van kernen totdat er 10 tot 30 zijn. Beweeg daarna naar de druppel met de uitgelijnde enucleerde oocyten. Pas het vacuüm toe om één oocyt aan de houdnald te fixeren.Plaats vervolgens de NU-kernoverdrachtnaald naast de zop lucita, waarbij de kernen van de opening af zijn gericht. Pas pizo-pulsen toe totdat de naald door de zop lucita is gegaan. Bedien de micromanipulator om voorzichtig één kern naar de punt van de naald te bewegen.Duw de naald in de oocyt totdat de punt van de naald voor twee derde is binnengedrongen. Oefen een kleine negatieve druk uit zodat een klein deel van het oocytmembraan zich in de naald bevindt. De volgende stap is zeer kritisch.Aangezien dit het enige moment is waarop de oocyt daadwerkelijk open is, wordt er een enkele ZO-puls toegediend. Breng vervolgens een positieve druk aan om de nucleus uit de naald te duwen.Trek de naald voorzichtig terug zodat de punt zich ongeveer op een derde van de afstand in de oocyten bevindt, breng vervolgens negatieve druk aan en blijf de naald terugtrekken om de oocyt af te sluiten. Herhaal deze stap bij elke oocyt.Nadat alle oocyten een kern hebben ontvangen, brengt u deze over naar de Petrischaal en wast u ze door ze van druppel naar druppel over te brengen in KS OM AA-medium, geïncubeerd bij 37 °C gedurende ten minste 30 minuten. Na de incubatie brengt u de SCN T-embryo's over naar druppels calciumvrij activatiemedium dat strontiumchloride bevat. Strontiumchloride activeert de oocyt door de calciumoscillaties te induceren die op soortgelijke wijze tijdens de bevruchting zouden optreden.Incubeer gedurende zes uur. Indien gewenst, voeg TSA toe, een aspecifieke remmer van histon-deacetylasen, aan het activatiemedium. Om de efficiëntie na activatie te verbeteren, worden de embryo's onder de omgekeerde microscoop onderzocht om het aantal pseudo-pronuclei of PPN-positieve SCNT-embryo's te bepalen. De PPN kunnen worden geïdentificeerd op basis van hun uiterlijk.Ze zien eruit als eitjes. Wassen en kweken op de 'sunny side up'-methode. De embryo's worden drie en een halve dag in K-S-O-M-A-A druppels bewaard bij 37 °C totdat ze het blastocyststadium hebben bereikt.In het begin moet u zich concentreren op het correct uitvoeren van de procedures die we zojuist hebben gedemonstreerd voor nucleatie en NU-kernoverdracht. Zodra u deze technieken beheerst, zijn de volgende procedures eenvoudiger uit te voeren. De gebruikte embryonale stamcellen (ES-cellen) zijn verkregen met behulp van standaardtechnieken.Deze moeten worden voorbereid op de dag van de blast assisted injection, drie en een halve dag na de copulatie. Bereid het deksel van een steriele bacteriële schaal voor door druppels met PVP en HCZP aan te brengen. Bereid vervolgens, zoals voorheen, een injectienaald van 15 micrometer voor de piso-puls.Plaats vervolgens de injectienaald in de micromanipulator en was deze met PVP-transfer. Voer 10 tot 30 blast-assists uit in een druppel HCZB. Plaats daarna 5 tot 50 µL van de ESL-suspensie in een andere druppel HCZB.Er moeten voldoende ES-cellen aanwezig zijn zodat ze gemakkelijk kunnen worden opgenomen, maar ze mogen niet te dicht op elkaar zitten. Neem vervolgens 30 tot 100 ES-cellen op met de injectienaald. Verplaats deze naar de druppel met de blast assist.Lijn de blast assist horizontaal uit en fixeer deze met de houdaald door vacuüm aan te leggen. Gebruik de injectienaald om de blast assist te draaien totdat de inner cell mass zich op negen uur bevindt. Plaats de injectienaald op drie uur.Zorg ervoor dat er geen ES-cellen aan de punt van de naald zitten en breng een piezo-puls toe totdat de injectienaald door de zona pellucida en de trifecta in de blastoceel dringt. Laat vijf tot 15 ES-cellen vrij, zodat deze aan de binnenste celmassa hechten. Ga door tot alle blastoceleten zijn geïnjecteerd nadat de injecties zijn voltooid.Was twee keer met K-S-O-M-A-A en ga over tot chirurgische embryo-transfer naar pseudodrachtige vrouwtjes; plaats een geanestheseerde pseudodrachtige ontvanger-muis in het operatiegebied. Verwijder met een elektrisch scheerapparaat het haar van het rechteronderkwadrant. Desinfecteer het gebied onder een dissectiemicroscoop met een op jodium gebaseerde oplossing en 70% ethanol.Gebruik een schaar om de huid te openen, plaats vervolgens een gesloten schaar tussen de huid en het peritoneum en open deze om het peritoneum van de huid te scheiden. Lokaliseer de eierstok door het peritoneum heen, welke zichtbaar zou moeten zijn als een rode vlek. Gebruik vervolgens een schaar om het peritoneum in dat gebied te openen.Gebruik een pincet om de UCT of het omringende vet voorzichtig vast te pakken en trek de uterus eruit met behulp van een capillair dat is verbonden met een mondpipet. Neem een groep van ongeveer 10 blastocyste-assistenten op terwijl u de eileider en de uterus met een pincet vasthoudt. Gebruik een naald om een klein gaatje in de uterus te prikken.Voer vervolgens de capillair met de blast-assist in het lumen van de uterus in en laat deze los. Duw de uterus terug in de buikholte. Lokaliseer de randen van het peritoneum en sluit dit met enkele hechtingen.Sluit de huid van de muis met enkele nietjes. Dien subcutaan pijnstillende medicatie toe. Plaats de muis vervolgens terug in de kooi onder een warmtelamp.Blijf de ademhaling van de muis bewaken tot deze wakker wordt. Na de enucleatie en somatische celkernoverdracht waren ongeveer 70% van de embryo's positief voor pseudo-pronuclei.Zoals weergegeven in deze figuur. Behandeling met TSA gedurende respectievelijk zes of 10 uur had geen effect. Na drie en een halve dag in cultuur ontwikkelden vijf tot 10% van de embryo's zich tot blastocysten.Opnieuw had de toevoeging van TSA geen effect op de snelheid van de blastocyst-ontwikkeling. De SCNT-blastocysten werden vervolgens gebruikt voor het afleiden van embryonale stamcellen. TSA verbeterde de snelheid waarmee ESL werden afgeleid uit blastocysten aanzienlijk.De S-C-N-T-E-S-cellen worden gebruikt om chimere muizen te genereren. Er wordt bloed afgenomen van deze muizen en geanalyseerd op de aanwezigheid van specifieke T-cellen met behulp van FACS-analyse, zoals hier wordt getoond. Wanneer bloed wordt gekleurd met anti-CD4-antilichaam en een specifiek tetrameer, kan een dubbelpositieve populatie worden geïdentificeerd.Dit geeft aan dat de donorcel die voor SCNT werd gebruikt, de juiste specificiteit had. Ik heb u zojuist laten zien hoe u somatische cel LU-transfer, blast-assist injecties en embryotransfer uitvoert. Het belangrijkste aandachtspunt is de zuiverheid van uw T-cellen of B-cellen.Zodra u heeft geleerd hoe u somatische transfer uitvoert en uw embryo's het blastocyststadium hebben bereikt, kunt u kiezen tussen het direct terugplaatsen ervan in pseudodrachtige vrouwtjes of het gebruiken ervan voor het afleiden van embryonale stamcellen en het genereren van chimere muizen.

transnuclear-mice-with-pre-defined-t-cell-receptor-specificities

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

We presenteren een protocol om antigeen-specifieke muis T-cellen te produceren met behulp van retrovirale...

Retrovirale Transductie van T-cel-receptoren in Mouse T-cellen

Genereren van T-lymfocyten van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen geeft een alternatieve aanpak van het gebruik van embryonale stamcellen voor T-cel-gebaseerde immunotherapie. De werkwijze blijkt dat door een...

Geregisseerd Differentiatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen naar T lymfocyten

Het genereren en karakteriseren van tumorspecifieke T-cellen met gehumaniseerde muizen wordt hier beschreven. Human thymusweefsel en genetisch gemodificeerde humane hematopoietische stamcellen worden getransplanteerd in immunodeficiënte muizen. Dit resulteert in de bereiding van een op menselijke immuunsysteem waardoor in vivo onderzoek van anti-tumor immuunrespons.

Met behulp van de BLT Gehumaniseerd Muis als een Stem Cell gebaseerde Gene Therapy tumormodel

Hier ontwikkelen we de instrumenten die nodig zijn voor...

Ex vivo Live-Imaging van Single Cell Divisies in Muis neuroepithelium

Met dit protocol, konden we beeld 160 pm dikke hersencoupes van muizen geïnfecteerd met de parasiet Toxoplasma gondii, die visualisatie en analyse van de ruimtelijke relatie tussen de encysting parasiet besmette neuron maakt.

3-D Imaging en Analyse van Neuronen Infected In Vivo Met Toxoplasma gondii

Door gebruik te maken van een binaire genetische strategie bieden we een gedetailleerd protocol voor het traceren van neurale circuits bij muizen die complementaire transsynaptische tracers tot expressie brengen na Cre-gemedieerde recombinatie. Omdat celspecifieke tracerproductie genetisch is gecodeerd, is onze experimentele aanpak geschikt om de vorming en rijping van neurale circuitreeksen te bestuderen tijdens de muis-embryonale hersenontwikkeling met een resolutie van één enkele cel.

Voorwaardelijke Genetische transsynaptische Tracing in de embryonale hersenen van muizen

Forward genetics is een krachtige aanpak om genen in intracellulaire pathogenen te identificeren die belangrijk zijn voor resistentie tegen celautonome immuniteit. De huidige aanpak maakt gebruik van aangeboren immuuncellen, specifiek macrofagen, om nieuwe Toxoplasma gondii genen te identificeren die belangrijk zijn voor immuunontwijking.

Forward Genetica Schermen Met behulp van macrofagen te identificeren<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Genen Belangrijk voor Weerstand tegen IFN-γ-Dependent Cell Autonome Immuniteit

Het enterische zenuwstelsel wordt gevormd door neurale crestcellen die zich vermenigvuldigen, migreren en het darmkanaal koloniseren. Neurale crestcellen differentiëren zich in neuronen met markers die specifiek zijn voor hun neurotransmitterfenotype. Dit protocol beschrijft een techniek voor het dissekeren, fixeren en immunokleuring van het muis embryonale gastro-intestinale kanaal om de expressie van enterische zenuwstelsel neurotransmitters te visualiseren.

Immunokleuring om Murine Enteric Nervous System Development Visualiseer

We presenteren een snel en flexibel protocol voor een enkelvoudig T-celreceptor (TCR) retroviraal-gebaseerd in vivo expressiesysteem.  Retrovirale vectoren worden gebruikt om beenmerg-progenitorchellen te transduceren om T-celontwikkeling en functie van een enkele TCR in vivo te bestuderen als een alternatief voor TCR-transgene muizen.

Retrovirale Transductie van beenmerg stamcellen voor het genereren van T-cel Receptor Retrogenic Muizen

Hier gepresenteerd is een multiphoton microscopisch platform voor live muis oculaire oppervlakte beeldvorming. Fluorescerende transgene muis maakt de visualisatie van celkernen, celmembranen, zenuwvezels en haarvaten binnen het oculaire oppervlak mogelijk. Niet-lineaire tweede harmonische generatie signalen afgeleid van collageen structuren bieden label-vrije beeldvorming voor stromal architecturen.

Een custom multiphoton microscopie platform voor live beeldvorming van muis hoornvlies en conjunctiva

Dit artikel beschrijft de methodologie voor het radioactief labelen van een mensspecifiek anti-CD19 monoklonaal antilichaam en hoe het kan worden gebruikt om B-cellen in het centrale zenuwstelsel en perifere weefsels van een muismodel van multiple sclerose te kwantificeren met behulp van in vivo PET-beeldvorming, ex vivo gammatelling en autoradiografiebenaderingen.

Beeldvorming van CD19+ B-cellen in een experimenteel muismodel met auto-immuun encefalomyelitis met behulp van positronemissietomografie

Leer SCNT-toepassing voor het genereren van muizen met specifieke T-celreceptoren tegen Toxoplasma gondii. Deze methode versnelt onderzoek naar auto-immuniteit, infectieziekten en kanker.

Transnuclear Muizen met vooraf gedefinieerde T-cel-receptor Bijzonderheden tegen Toxoplasma gondii Verkregen via SCNT

Meer video's verkennen