Transnuclear Muizen met vooraf gedefinieerde T-cel-receptor Bijzonderheden tegen Toxoplasma gondii Verkregen via SCNT

Muizen die transgeen zijn voor antigeenspecifieke T-celreceptoren zijn onmisbaar geweest bij de studie naar de ontwikkeling en functie van T-cellen om muismodellen met vooraf gedefinieerde T-celreceptor-specificiteiten te genereren met behulp van somatische celkernoverdracht of SCNT. Een muis wordt geïnfecteerd met een pathogeen van belang. T-cellen worden uit de muis geïsoleerd en vervolgens gezuiverd door middel van fluorescentie-geactiveerde cel sortering.

De gezuiverde T-cellen worden vervolgens gebruikt voor somatische celkernoverdracht. Nadat de embryo's het blastocyste-stadium hebben bereikt, worden embryonale stamcellen geïsoleerd. Deze cellen worden vervolgens geïnjecteerd in blastocysten, die daarna worden overgebracht naar pseudodrongere muizen.

De resulterende nakomelingen vertonen een uitgesproken toename van de T-celpopulatie van belang, wat gevalideerd kan worden via PAX-analyse. Hallo, mijn naam is Okta AK en ik ben postdoc hier bij het White Institute for Biomedical Research. Vandaag ga ik u laten zien hoe u somatische CLE-transfer blast assist-injecties uitvoert, evenals embryo-transfer.

Het belangrijkste voordeel van somatische transfer is dat muismodellen kunnen worden gegenereerd die hun T-celreceptor tot expressie brengen vanuit de endogene locus, en dus onder controle staan van de endogene promotor, en dat deze muismodellen zeer snel kunnen worden gegenereerd. Somatische vloeistofoverdracht kan worden gebruikt als instrument om muismodellen te genereren met vooraf gedefinieerde T-celreceptor- of B-celreceptor-specificiteiten. Dit is van bijzonder belang voor onderzoekers in vakgebieden zoals autoimmuniteit, infectieziekten en kanker.

Om T-cellen te isoleren die specifiek zijn voor een pathogeen zoals Toxoplasma Gandhi, waarbij muizen zijn geïnfecteerd via intraperitoneale injectie op het hoogtepunt van de immuunrespons, wordt de milt uit de geëuthanaseerde muis geïsoleerd; de gehomogeniseerde donorcellen worden vervolgens geïsoleerd en geïncubeerd met fluorescent gelabelde antilichamen en het juiste tetrameer. Ten slotte wordt FACS-sorting uitgevoerd om pathogeenspecifieke T-cellen te verkrijgen. De avond voor de procedure van oocyt-enucleatie.

Bereid pico-injectienaalden van vier, vijf en zeven micrometer voor door deze met een spuit retrograden te laden met kwik. Begin de volgende dag met het protocol voor somatische celkernoverdracht door oocyten te verzamelen en deze vervolgens met een mondpipet over te brengen naar druppels K-S-O-M-A-A-medium in een Petrischaal. In het deksel van de Petrischaal.

Bereid een plaat voor voor het uitvoeren van somatische celkernoverdracht of SCNT door ongeveer 10 druppels PVP, ongeveer 10 druppels HCZB bevatten vijf microgram per milliliter cyto B en ongeveer 10 druppels HCCB bevatten 2,5 microgram per milliliter cyto B aan te brengen. Deze plaat zal worden aangeduid als de S-C-N-T-A plaat. Plaats de S-C-N-T-A plaat op de tafel van een omgekeerde samengestelde microscoop.

Plaats vervolgens een enucleatienald van 7 µm in de micromanipulator en spoel deze door vijf tot 10 keer vloeistof op te zuigen uit een afvalbak met PVP-oplossing. Breng daarna 10 tot 30 in metafase II gearresteerde oocyten over van de Petrischaal naar een van de druppels HCCB met 5 µg/mL Cyto B op de SCNT-plaat. Incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur en lijn de oocyten tijdens de incubatie horizontaal uit.

Wacht vijf minuten. Gebruik de enucleatienald om een oöcyt voor de holdingnaald te plaatsen. Gebruik een micro-injector om vacuüm aan te leggen, zodat de oöcyt aan de holdingnaald van de micropipet wordt bevestigd.

Draai vervolgens de oocyten met de enucleatienald tot het chromosoomspindelcomplex, dat hypertransparant verschijnt in vergelijking met het cytoplasma, zich in de drie-uurpositie bevindt; start een piezo-puls door op het pedaal te drukken om de zona pellucida te penetreren. Een piezo-puls is een mechanische puls die longitudinaal reist en de punt van de enucleatienald doet vibreren. De vibraties van de punt helpen bij het doorboren van de zona pellucida.

Zodra de zona pellucida is gepenetreerd, plaatst u de opening van de nucleatie-naald naast de spoel van metafase twee en past u het vacuüm toe. Het chromosoom-spoelcomplex zal langzaam de naald in bewegen. Zodra de naald wordt verwijderd, zou het membraan zichzelf moeten sluiten.

Breng ten slotte de enucleerde cyten met een mondpipet terug in de K-S-O-M-A-A-druppels. Was ze vervolgens met dezelfde pipet door ze van druppel naar druppel in KSOM AA over te brengen. Vervang voor de kernoverdracht de enucleatienald van zeven micrometer op de micromanipulator door een kernoverdrachtnaald van vier tot vijf micrometer. Was de naald zoals voorheen met PVP.

Plaats de eerder geïsoleerde CD eight positieve T-cellen in een druppel PVP op de S-C-N-D-A plaat. Meng goed en incubeer gedurende ten minste 10 minuten bij kamertemperatuur. Draag vervolgens 10 tot 30 ENUCLEATED cytes over naar een druppel HCZB met 2,5 µg/mL.

Incubeer de Cyto B op de S ct. A-plaat gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Gebruik tijdens de incubatie de kernoverdrachtnaald om de cyten horizontaal uit te lijnen met behulp van de injectienaald.

Neem een donor CD8-positieve cel uit het PVP-medium en aspireer deze herhaaldelijk totdat het buitenmembraan is afgebroken. Indien nodig kan een piezo-puls worden toegepast; fragmenten van het membraan en het cytosol moeten zichtbaar zijn. Zuig de nucleus op in de naald.

Ga vervolgens door met het opnemen van kernen totdat er 10 tot 30 zijn verzameld. Ga daarna naar de druppel met de uitgelijnde enucleerde oocyten. Pas het vacuüm toe om één oocyt aan de houdnaald te fixeren.

Plaats vervolgens de NU-kernoverdrachtnaald naast de zop lucita, waarbij de kernen van de opening af zijn gericht. Pas pizo-pulsen toe totdat de naald door de zop lucita is gegaan. Bedien de micromanipulator om voorzichtig één kern naar de punt van de naald te bewegen.

Duw de naald in de oocyten tot de punt van de naald voor twee derde naar binnen is. Breng een kleine negatieve druk aan zodat een klein deel van het oocytenmembraan in de naald terechtkomt. De volgende stap is zeer kritisch.

Aangezien dit het enige moment is waarop de oocyten daadwerkelijk open zijn, wordt er een enkele ZO-puls toegediend. Breng vervolgens een positieve druk aan om de nucleus uit de naald te duwen.

Trek de naald voorzichtig terug zodat de punt zich voor ongeveer een derde in de oocyte bevindt, breng vervolgens negatieve druk aan en blijf de naald terugtrekken om de oocyte af te sluiten. Herhaal deze stap voor elke oocyte.

Nadat alle oocyten een kern hebben ontvangen, worden ze overgebracht naar de Petrischaal en gewassen door ze van druppel naar druppel over te brengen in KS OM AA-medium, geïncubeerd bij 37 °C gedurende ten minste 30 minuten. Na de incubatie worden de SCN T-embryo's overgebracht naar druppels calciumvrij activatiemedium dat strontiumchloride bevat. Strontiumchloride activeert de oocyt door de calciumoscillaties te induceren die op vergelijkbare wijze tijdens de bevruchting zouden optreden.

Incubeer gedurende zes uur. Indien gewenst, voeg TSA toe, een aspecifieke inhibitor van histondeacetylasen, aan het activatiemedium. Om de efficiëntie na activatie te verbeteren, bestudeer de embryo's onder de omgekeerde microscoop om het aantal pseudo-pronuclei of PPN-positieve SCNT-embryo's te bepalen. De PPN kunnen worden geïdentificeerd op basis van hun uiterlijk.

Ze zien eruit als eitjes. Was en kweek ze in een 'sunny side up'-positie. De embryo's worden gedurende drie en een halve dag bij 37 °C in K-S-O-M-A-A druppels bewaard tot ze het blastocyststadium hebben bereikt.

In het begin moet u zich concentreren op het correct uitvoeren van de procedures die we zojuist hebben gedemonstreerd voor nucleatie en NU nucleaire transfer. Zodra u deze technieken onder de knie heeft, zijn de volgende procedures eenvoudiger te beheren. De gebruikte embryonale stamcellen of ES-cellen zijn hier verkregen met behulp van standaardtechnieken.

Deze moeten worden voorbereid op de dag van de blastocyst-geassisteerde injectie, drie en een halve dag na de copulatie. Bereid het deksel van een steriele bacteriële schaal voor door druppels met PVP en HCZP uit te platen. Bereid vervolgens een injectienaald van 15 micrometer voor de pico-puls zoals voorheen.

Plaats vervolgens de injectienaald in de micromanipulator en was deze met PVP-overdracht. Voer 10 tot 30 blast-assists uit in een druppel HCZB. Plaats daarna vijf tot 50 µL van de ESL-suspensie in een andere druppel HCZB.

Er moeten voldoende ES-cellen aanwezig zijn zodat ze gemakkelijk kunnen worden opgenomen, maar ze mogen niet te dicht op elkaar zitten. Neem vervolgens 30 tot 100 ES-cellen op met de injectienaald. Verplaats deze naar de druppel met de blast-assist.

Lijn de blast assist horizontaal uit en fixeer deze met de vasthoudnaald door vacuüm aan te leggen. Gebruik de injectienaald om de blast assist te draaien totdat de inner cell mass op negen uur staat. Plaats de injectienaald op drie uur.

Zorg ervoor dat er geen ES-cellen op de punt van de naald zitten en dien een pips-puls toe totdat de injectienaald door de zona pellucida en de trifecta in de blastoceel penetreert. Laat vijf tot 15 ES-cellen los zodat ze aan de binnenste cellassa hechten. Ga hiermee door totdat alle blastocyste-embryo's zijn geïnjecteerd nadat de injecties zijn voltooid.

Was twee keer in K-S-O-M-A-A en ga over tot chirurgische embryo-transfer naar pseudodrongravende vrouwtjes; plaats een geanestheseerde pseudodrongravende ontvangermuis in het chirurgische gebied. Verwijder met een elektrisch scheerapparaat het haar van het rechteronderkwadrant. Desinfecteer het gebied met een jodiumoplossing en 70% ethanol onder een dissectiemicroscoop.

Gebruik een schaar om de huid open te knippen, plaats vervolgens een gesloten schaar tussen de huid en het peritoneum en open deze om het peritoneum van de huid te scheiden. Lokaliseer de eierstok door het peritoneum, welke zichtbaar zou moeten zijn als een rode vlek. Gebruik daarna een schaar om het peritoneum in dat gebied open te knippen.

Gebruik een pincet om de UCT of het omliggende vet voorzichtig vast te pakken en trek de uterus eruit met behulp van een capillair dat is verbonden met een mondpipet. Neem een groep van ongeveer 10 blastocysten op terwijl u de eileider en de uterus met een pincet vasthoudt. Gebruik een naald om een klein gaatje in de uterus te prikken.

Voer vervolgens de capillair met de blast assist in het lumen van de uterus in en laat deze los. Duw de uterus terug in de buikholte. Lokaliseer de randen van het peritoneum en sluit deze met enkele hechtingen.

Sluit de huid van de muis met enkele nietjes. Dien subcutaan pijnstillende medicatie toe. Plaats de muis vervolgens terug in de kooi onder een warmtelamp.

Houd de ademhaling van de muis in de gaten tot deze wakker wordt. Na enucleatie en somatische celkernoverdracht waren ongeveer 70% van de embryo's positief voor pseudo-pronuclei.

Zoals getoond in deze figuur. Behandeling met TSA gedurende respectievelijk zes of 10 uur had geen effect. Na drie en een halve dag in cultuur ontwikkelde vijf tot 10% van de embryo's zich tot blastocysten.

Ook nu had de toevoeging van TSA geen effect op de snelheid van de blastocyste-ontwikkeling. De SCNT-blastocysten werden vervolgens gebruikt voor de afleiding van embryonale stamcellen. TSA verbeterde de snelheid waarmee ESL werden afgeleid uit blastocysten aanzienlijk.

De S-C-N-T-E-S-cellen worden gebruikt om chimere muizen te genereren. Er wordt bloed afgenomen van deze muizen, dat vervolgens wordt geanalyseerd op de aanwezigheid van specifieke T-cellen met behulp van FACS-analyse, zoals hier wordt getoond. Wanneer het bloed wordt gekleurd met anti-CD4-antilichaam en een specifiek tetrameer, kan een dubbel positieve populatie worden geïdentificeerd.

Dit geeft aan dat de donorcel die werd gebruikt voor SCNT de juiste specificiteit had. Ik heb u zojuist laten zien hoe u somatische cel LU-transfer, blast assist-injecties en embryotransfer uitvoert. Het belangrijkste punt om rekening mee te houden is de zuiverheid van uw T-cellen of B-cellen.

Zodra u heeft geleerd hoe u somatische transfer moet uitvoeren en uw embryo's het blastocyste-stadium hebben bereikt, kunt u kiezen tussen het direct terugplaatsen van deze embryo's in pseudodronginaire vrouwtjes of het gebruik ervan voor het afleiden van embryonale stamcellen en het genereren van chimere muizen.