Name: Rechtop beeldvorming van Drosophila Embryos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-13T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Leer een rechtopstaande beeldvormingsmethode voor Drosophila-embryo's met confocale microscopie. Deze techniek maakt nauwkeurige meting van embryogrootte en kwantificering van eiwit- en RNA-expressieniveaus mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs zijn vooral schatplichtig aan Deborah Harris en Danielle MacKay. Steun voor dit werk werd geleverd door het departement Biologie en de Hogeschool voor de Kunsten en Wetenschappen van CWRU, en door HHMI verlenen nummer 52005866 voor de ondersteuning van undergraduate onderwijs in de biologische wetenschappen.

1. Imaging Methodologie <ol><li> Gelei Smelt glycerine in een 55 ° C graden waterbad gedurende 20-30 minuten tot het een homogene vloeistof. Swirl, doe maar niet schudden de fles om de vorming van luchtbellen te voorkomen. </li><li> Terwijl de gelei smelt, breng een dunne laag van glycerol met behulp van een Kimwipe op een schoon glasplaatje (optioneel). </li><li> Pipetteer 1 tot 1,5 ml gesmolten glycerine gelei met behulp van een cut P1000 pipettip op het oppervlak van de dia om een ​​dunne eerste laag te creëren. Pipet voorzichtig om luchtbellen te vermijden. </li><li> Laat de gelei stollen gedurende 5 minuten op een horizontaal oppervlak, dan is de schuif plaats bij -20 ° C gedurende 5 minuten en ga verder met embryo uitlijning. U kunt ook betrekking hebben op de dia met Saran Wrap en plaats deze bij 4 ° C gedurende maximaal 5 dagen. </li><li> Pipetteer een kleine druppel gekleurd embryo's in 70% glycerol / PBS of andere antifade glycerol-based montage media (bijvoorbeeld Slowfade of Vectashield) aan de zijde van de gelei beddengoed. </li><li> Begin pre-embryo's door het afstemmen van de individueel over te dragen van de drop naar de gelei oppervlak. Overbrengen met behulp van een schuine injectienaald, het gebruik van de schuine zijde als een lepel. </li><li> Ruwweg plaats van de embryo's langs de 2 tot 3 kolommen. Als een embryo vast komt te zitten in de naald, roer het in de druppel die de andere embryo's om deze los. Verspil geen tijd zorgvuldig uitlijnen hen op dit punt. Laat wat ruimte tussen de kolommen. </li><li> Lijn de embryo's door ze horizontaal op de gelei medium met behulp van de injectienaald. Tijdens het glijden, oriënteren de koppen en staarten in dezelfde richting. Maak ze parallel aan elkaar langs de kolom. Verwijder overtollig van PBS glycerol links als een parcours met een stukje gedraaid Kimiwipe. Let op: Excess glycerol zal leiden tot embryo's te losjes verpakt binnen gel, wat resulteert in scheiding van de twee gelei lagen, waardoor het moeilijk om te knippen en te monteren. Omgekeerd zal het verwijderen van te veel glycerol droog en plat embryo's. </li><li> Gebruik een afgezaagd geel tip om een ​​dun laagje gelei verspreid over de embryo's (50-150 pi, afhankelijk van hoeveel waren uitgelijnd). </li><li> Plaats dia in -20 ° C vriezer voor 10-20 min. of bewaar deze bij 4 ° C gedurende de nacht. Zorg ervoor dat de gelei is helemaal stijf voor het snijden. Anders zal het blok van de embryo's zeer moeilijk te accijnzen. De beste resultaten voor het snijden worden verkregen op de volgende dag. </li><li> Onder een ontleding bereik, gebruik dan een scheermesje om volledig dwars door de gelei op beide zijden van de lijn embryo's. Houd het scheermesje in een hoek van 90 ° rechte zaagsneden te maken. De bezuinigingen moeten worden gemaakt zeer dicht bij de voorste en achterste polen van de embryo's om overtollige gelei die kunnen belemmeren beeldvorming te voorkomen. </li><li> Voeg 100 tot 200 ul van koude PBT (4 ° C, PBS +0,1% Tween 20) naast de bezuinigingen en voorzichtig afschrapen van de gelei tussen embryo's met behulp van een spatel. Opmerking: Het wasmiddel in PBT helpt bij het verwijderen van de gelei van de dia zonder beschadiging van de embryo's. </li><li> Met behulp van een naald, de overdracht het blok van de gelei met embedded embryo's op een schoon objectglas voor verdere snijden. Gesneden kleinere blokken met 5-7 embryo's. Gebruik PBT om gemakkelijk te verplaatsen rond de gelei blok. Als alternatief, plaats het blok op een droge ondergrond te laten hechten aan het glas, waardoor meer stabiliteit voor het precies trimmen van de gelei, indien nodig, creëert. </li><li> Flip rechtop de embryo's ingebed in de gelei met behulp van een scheermesje en een naald. Voor visualisatie onder de microscoop, ga dan verder met een van de twee onderstaande stappen, afhankelijk van het type microscoop stand wordt gebruikt. </li><li> Omkeermicroscoop: plaats embryo blokken afgewerkt op een lange dekglaasje, met embryo's in een rechtopstaande positie. Zorg ervoor dat de zijde van het embryo met de minste hoeveelheid gelei zal in nauwer contact met de doelstelling. </li><li> Rechtop microscoop: maak twee stapels met vier # 1 coverslips gelijmd met superlijm om gebruikt te worden als "ondersteunt", en het embryo blok in glycerol plaats in tussen de "ondersteunt". Brug de stapels met behulp van een lange dekglaasje aan. </li><li> Voor de confocale analyse, controleer dan de werkafstand van de doelstellingen die moeten worden gebruikt om te achterhalen of u foto helemaal door het embryo of slechts gedeeltelijk. Bijvoorbeeld, D. melanogaster embryo's ~ 0,55 mm in lengte en kan volledig worden afgebeeld met behulp van een Zeiss 20x Plan-Apo of een 40x LD Neo-Fluor doelstelling. De volgende website is informatie over de beschikbare Zeiss doelstellingen en geeft u de mogelijkheid om doelstellingen te zoeken op werkafstanden: https://www.micro-shop.zeiss.com/us/us_en/objektive.php </li></ol> 2. Representatieve resultaten Omdat het embryo intact worden gelaten, kan deze methode worden gebruikt om nauwkeurige metingen van embryo grootte en afstanden tussen de genexpressie patronen te nemen. In figuur 1 geven we een blastoderm stadium embryo's gekleurd met de nucleaire vlek DAPI (blauw), anti-Dorsale eiwit (rood), SOG mRNA (geel) en SNA mRNA (groen). Morfologische processes, kan zoals invaginatie van het mesoderm (Figuur 2A, B) en migratie van mesodermale cellen (Figuur 3 en 4) ook worden gevisualiseerd met behulp van deze methode. Verschillende Z-posities langs de DV-as kan worden verkregen door het veranderen van de focal plane, zoals weergegeven in de figuren 2-4. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Rechtop optische schijfje van een intacte embryo in blastoderm stadium. Dubbelklik kleuring voor mRNA en eiwit. Doelwit mRNA's voor in-situ sondes (SOG en SNA) en eiwit gekleurd door primaire antilichaam (anti-Dorsale) zijn aangegeven in de figuur. DAPI werd gebruikt om de kernen label. Merk op dat de uitdrukking van SOG en SNA apicaal bevinden zich in het cytoplasma, terwijl de uitdrukking van Dorsale is kernenergie. Sterke signalen van SOG ontluikende transcripten die zich bevinden in de kernen is ook te zien op deze vergroting. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Rechtop beeldvorming van een intacte gastrulating embryo. MRNA probes gebruikt en de bijbehorende kleuren zijn aangegeven in de figuur. A) Merk op dat in dit stadium, drie genen gekleurd met dezelfde Fluor (SNA, SOG en DPP, in het groen), worden uitgedrukt in ruimtelijk gescheiden domeinen. De invaginating mesoderm drukt SNA, de neuroblast laag drukt IND en het ectoderm uitdrukt DPP, terwijl de SOG uitdrukking is nog steeds aanwezig in ventrale regio's van het zenuwstelsel. B) In een diepere confocale vliegtuig van hetzelfde embryo, merken we de basis van het invaginating mesoderm sterk tot uitdrukking SNA, maar de apicale regio uitdrukt lagere niveaus. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Rechtop beeldvorming van een intacte embryo met een kiem band uitgebreid SOG RNA (geel);. Slak, IND en DPP mRNAs (groen), Dorsale eiwit (rood). Kernen werden gekleurd met DAPI (blauw). A) Focal plane in de buurt van embryo hoofd. B) Een ander focal plane in de kofferbak regio van hetzelfde embryo. Let op de massa van mesodermale cellen voordat laterale migratie (te vergelijken met 4 figuur) liggen dicht bij de ventrale middellijn aan beide zijden van een kiem-band uitgebreid embryo. Delamineren neuroblasts zijn geëtiketteerd in groen (IND en SNA). <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Rechtop beeldvorming van een intacte embryo tijdens de kiem band extensie SOG RNA (geel);. Slak, IND en DPP mRNAs (groen), Dorsale eiwit (rood). A) Let op de delamineren neuroblasts van het epitheel (pijl), gebeitst zowel voor de IND en SNA in dit stadium (groen). Let ook op de beperkte uitdrukking van SOG aan de ventrale middellijn (geel). Expressie van DPP in dit stadium te zien op zijkanten van het embryo (asterisk). B) Optische gedeelte in dezelfde embryo getoond in A aan het einde van het embryo lengte, die overeenkomt met mid-posterior regio. Het ventrale middellijn cellen zijn gekleurd voor SOG.

<ol><li>Ay, A., Fakhouri, W. D., Chiu, C., Arnosti, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+processing+and+analysis+for+quantifying+gene+expression+from+early+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Image processing and analysis for quantifying gene expression from early Drosophila embryos.</a> Tissue Engineering. 14, 1517-1526 (2008).</li>
<li>Grβhans, J., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+link+between+morphogenesis+and+cell+division+during+formation+of+the+ventral+furrow+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A genetic link between morphogenesis and cell division during formation of the ventral furrow in Drosophila.</a> Cell. 101, 523-531 (2000).</li>
<li>Kosman, D., Mizutani, C. M., Lemons, D., Cox, W. G., McGinnis, W., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305, 846-846 (2004).</li>
<li>Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A. J., Crowley, J. C., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((End-on+imaging%3A+a+new+perspective+on+dorsoventral+development+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos.</a> Developmental Dynamics. 237, 3252-3259 (2008).</li>
<li>Zander, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+mounting+delicate+bryophytes+in+glycerol%5BTitle%5D)+AND+%22The+Bryologist%22%5BJournal%5D)">On mounting delicate bryophytes in glycerol.</a> The Bryologist. 100, 380-382 (1997).</li>
<li>Liberman, L. M., Reeves, G. T., Stathopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+imaging+of+the+Dorsal+nuclear+gradient+reveals+limitations+to+threshold-dependent+patterning+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Quantitative imaging of the Dorsal nuclear gradient reveals limitations to threshold-dependent patterning in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22317-2222 (2009).</li>
</ol>

Het nemen van doorsnede beelden van Drosophila embryo&#39;s kan lastig zijn, omdat het vereist hetzij een zorgvuldige hand dissectie van de plakjes 2 of het gebruik van embedded media voor de verwerking van microtoom, die meestal nadelig is voor tl-kleuringen. Als alternatief kan Z-stacks in een confocale microscoop worden gebruikt om de 3D-reconstructie van de doorsnede beelden te maken. Het is echter tijdrovend om meerdere dunne plakjes Confocale zorgen voor een nauwkeurige 3D-reconstructie en fotobleking wordt problematisch. Een andere zorg bij de beeldvorming embryo&#39;s die in lengterichting zijn gemonteerd is de lichtverstrooiing die optreedt bij het ​​bereiken van diepere delen van het embryo, die ook bemoeilijkt het nemen van nauwkeurige metingen van fluorescerende signalen ten behoeve van kwantificering van eiwit of mRNA expressie niveaus 1. Zelfs met een twee-foton confocale microscoop, lichtverstrooiing is nog een probleem vanwege de ondoorzichtigheid van de dooier materiaal in het midden van het embryo, welke selectie van montage media voor optimale transparantie van het monster te beperkt maakt. Om deze problemen te omzeilen, een nieuwe techniek genaamd &quot;End-on&quot; beeldvorming van de positionering embryo&#39;s verticaal werd onlangs ontwikkeld om beeld zowel live als vaste monsters 4. In deze paper hebben we een nieuw protocol voor verticaal geplaatste embryo&#39;s dat een eenvoudige voorbereiding en visualisatie van de vaste embryo&#39;s of weefsels van elke grootte en vorm die met meerdere gebeitst in situ sondes 3 mogelijk maakt. Onze methode bestaat uit het gebruik van een montage media met een geleiachtige consistentie die wordt gebruikt om embryo&#39;s zet je lijn binnen het. Snijd blokjes van deze montage media met embedded embryo&#39;s kan rechtop worden geplaatst voordat beeldvorming in elk type van confocale microscoop. Door het inbedden van de embryo&#39;s in de gelei en plaats ze verticaal, we zijn in staat om horizontale doorsnede te nemen met behulp van confocale microscopie, waarbij cellen langs de dorsale-ventrale as van het embryo gelijktijdig worden gepresenteerd. Dit is een significante verbetering voor de kwantificering werken, omdat problemen van lichtverstrooiing en fotobleken van fluorescerende kleurstoffen die optreedt bij conventionele Z-stack reconstructie van lengterichting gemonteerde embryo&#39;s zijn nu geëlimineerd. Zo, kwantificering van genexpressie of eiwit niveaus langs de rug-buik as is nauwkeurig, aangezien cellen zich aan tegenover rug-buik posities worden afgebeeld op hetzelfde tijdstip en op dezelfde confocale Z-positie. Daarnaast kan de beschreven methode stelt ons in staat om een complete 2-D beeld te krijgen over de rug-ventrale as van een 3-D-embryo zonder het gebruik van complexe computationele afrollen methoden om cellen op verschillende posities langs de DV-as 6 visualiseren. Een aantal van de kritische stappen omvatten het verwijderen van overtollige glycerol na het uitlijnen van embryo&#39;s, om te voorkomen dat verdeeld tussen de twee lagen van gelei. Echter, als het monster te uitgedroogd, zal het resulterende beeld worden misvormd en verkeerd morfologie. Bovendien, als de gelei medium rond het embryo wordt gesneden in een hoek in plaats van recht, kan het resulterende beeld lijken minder rond en meer ovular in vorm, als gevolg van een verkeerde positionering van de embryo&#39;s op een andere hoek dan 90 graden. Tot slot, als de gelei is niet nauw genoeg is gesneden om de embryo op de voorste / posterior eindigt, is het niet mogelijk om een ​​goed beeld te krijgen, want de doelstelling van de werkafstand zou vooral gebruikt worden om zich te concentreren in de gelei en niet het embryo. Een andere belangrijke stap die nodig kunnen zijn bij het beeld laat gastrulating embryo is om zorgvuldig de stadia van belang soort onder de reikwijdte voor het uitlijnen hen. Meestal worden embryo&#39;s opgevoerd op basis van morfologische kenmerken die kunnen de meeste gemakkelijk te herkennen wanneer in een longitudinale positie. Onder andere wijzigingen die kunnen worden gemaakt met deze methode is om een ​​anti-fade reagens (bv p-fenyleendiamine of PPD) op te nemen in de tweede laag van gelei te helpen beschermen tegen fotobleken van fluorescerende kleurstoffen.

<table><tbody><tr><td>Glycerine-gelei montage medium</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>17998-10</td><td>Bevat een lage concentratie fenol als conserveermiddel en moet in een zuurkast of in een goed geventileerde ruimte worden gebruikt. Het recept voor het maken van uw eigen medium wordt beschreven in Zander, 1997.</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 700 Confocale microscoop</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td>De volgende objectieven werden gebruikt: Plan-Apo 20x 0.8 M27 (WD 0.55mm); EC Plan-Neofluar 40x 1.3 olie (WD 0.21mm); LD Plan-Neofluar 0.6 Korr 40X (WD 2.9mm).</td></tr><tr><td>Fosfaatgebufferde zoutoplossing met 0.1% Tween 20 (PBT)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glazen objectglazen</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>Glazen dekglasjes</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72204-02</td><td>Maat 1 &amp;#189; (specifiek voor de objectieven die in dit werk zijn gebruikt).</td></tr><tr><td>Glazen dekglasjes (voor het maken van steunen)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-10</td><td>Gebruik vier dekglasjes die met secondelijm zijn vastgelijmd.</td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td>M5 Wild Heerbrugg Wild Makroskop</td><td>M420</td><td></td></tr><tr><td>Scheermesje</td><td></td><td></td><td>Industriële enkelzijdige lemmeten met stalen rug</td></tr><tr><td>Spatel</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-401-10</td><td></td></tr><tr><td>Hypodermische naalden</td><td>Fisher Scientific</td><td>1482610</td><td>26 Gauge</td></tr><tr><td>Pipetten</td><td>Labnet International</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rechtop beeldvorming van drosophila embryo&#39;s

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Verschillende bekende morfogenetische gradiënten en cellulaire bewegingen optreden langs de dorsale / ventrale as van de<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo. Echter, de huidige technieken die gebruikt worden om dergelijke processen te bekijken zijn enigszins beperkt. Het volgende protocol beschrijft een nieuwe techniek voor het monteren van vaste en gelabeld<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo&#39;s voor coronale bekijken met confocale beeldvorming. Deze methode bestaat uit inbedding van embryo&#39;s tussen de twee lagen van glycerine gelei montage media en beeldvorming gelei strips rechtop geplaatst. De eerste stap voor daartussen de embryo&#39;s is om een ​​dunne bedding van glycerine gelei op een dia. Vervolgens worden embryo&#39;s zorgvuldig afgestemd op dit oppervlak en bedekt met een tweede laag van gelei. Na de tweede laag is gestold, zijn reepjes gesneden gelei en bladerde rechtop voor de beeldvorming. Alternatieven zijn beschreven voor het visualiseren van de embryo&#39;s, afhankelijk van het type microscoop staan ​​om te worden gebruikt. Omdat alle cellen langs de dorsale-ventrale as worden afgebeeld binnen een confocale Z-plane, onze methode zorgt voor een precieze meting en vergelijking van fluorescente signalen zonder fotobleken of lichtverstrooiing gebruikelijk om 3D-reconstructies van lengterichting gemonteerde embryo&#39;s.

Hier presenteren wij een montage protocol voor gebrandschilderde<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo&#39;s in een rechtopstaande positie die beeldvorming van doorsneden met behulp van confocale microscopie mogelijk maakt.

Rechtop beeldvorming van Drosophila Embryo&#39;s

Verschillende bekende morfogenetische gradiënten en cellulaire bewegingen vinden plaats langs de dorsaal/ventrale as van het embryo van de Drosophila. Echter, de huidige ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om coronale beelden van intacte oph-embryo's te verkrijgen met behulp van confocale microscopie, die gebruikt kunnen worden om de grootte van het embryo nauwkeurig te meten en de expressieniveaus van eiwitten en RNA te kwantificeren. Dit wordt bereikt door gebruik te maken van een montage medium met een gelatineuze consistentie om de embryo's erin in te kapselen en ze rechtop te positioneren. Als eerste stap.De embryo's worden uitgelijnd over een dunne laag glycerinegelei en vervolgens bedekt met een tweede laag van dit medium. Vervolgens wordt het montage-medium met de embryo's in blokjes gesneden, die verticaal kunnen worden gekanteld om ze vast te houden. De embryo's worden in positie gebracht voor beeldvorming, wat resulteert in dwarsdoorsnedebeelden gevisualiseerd met een willekeurige confocale microscoop.Hallo, mijn naam is Milu. Ik ben een promovendus bij het Meso Lab van de afdeling biologie aan de Case Western Reserve University. Vandaag gaan we een montageprotocol demonstreren om PHI-embryo's in een breedliggende positie af te beelden met behulp van een confocale microscoop.We hebben deze methode ontwikkeld tijdens onze laboratoriumcursus ontwikkelingsbiologie hier aan Case in samenwerking met Dr. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de Endon-imagingtechniek ontwikkeld door het Mindin Laboratory, is dat het een eenvoudige preparatie en visualisatie mogelijk maakt van gefixeerde embryo's of weefsels van elke grootte en vorm. We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we dwarsdoorsneden wilden visualiseren van zeer kleine embryo's van andere gesso-soorten, die zeer moeilijk met de hand te snijden zouden zijn. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van vragen binnen het veld van de ontwikkelingsbiologie door nauwkeurige kwantificaties van genexpressie en eiwitniveaus langs de dorsoventrale as mogelijk te maken.Doorgaans worden embryo's longitudinaal gemonteerd. Hoewel het mogelijk is om Zack-reconstructies van dwarsdoorsneden te maken, treden er vaak problemen op met fotobleken van de fluorescerende ogen en lichtverstrooiing, bovendien is het zeer tijdrovend. Onze techniek minimaliseert deze problemen omdat dwarsdoorsneden van embryo's worden gevisualiseerd langs één enkel confocaal punt.Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn met deze methode enige moeilijkheden ervaren bij het snijden van de glycerine-blokjes vlakbij de uiteinden van de embryo's. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat er een zorgvuldige hantering vereist is. We hebben vandaag een demonstratie van onze studenten, Catherine Chen en Catty, over het voorbereiden van Drosophila-embryo's voor rechtopstaande beeldvorming.Smelt eerst glycerinegelei in een waterbad van 55 °C gedurende 20 tot 30 minuten totdat het een homogene vloeibare werveling vormt. Schud de fles echter niet om de vorming van luchtbellen te voorkomen. Pipetteer vervolgens voorzichtig één milliliter gesmolten glycerinegelei op de objectglas met behulp van een afgeknotte P 1000 pipetpunt.Laat de gelei vijf minuten op een horizontaal oppervlak stollen om een dunne, gelijkmatige eerste laag zonder luchtbellen te creëren. Plaats het objectglas vervolgens vijf minuten in een vriezer van -20 °C. Alternatief kan het objectglas worden afgedekt met vershoudfolie en tot vijf dagen bij 4 °C worden bewaard.Zodra de eerste laag gelei is gestold, brengt u het objectglas naar de microscoop en gaat u over tot de uitlijning van de embryo's. Pipetteer een kleine hoeveelheid gekleurde embryo's en 70% PBS glycerol aan de zijkant van de eerste laag gelei. Lijn de embryo's onder de microscoop naast elkaar uit in drie tot vier kolommen per objectglas.Gebruik een hypodermische naald om ze op te scheppen met de schuine zijde van de naald, als een lepel. Orienteer de koppen van alle embryo's zorgvuldig in dezelfde richting door ze met behulp van de naald horizontaal over het gelei-medium te verschuiven.De uiteindelijke configuratie van de uitgelijnde embryo's zal vergelijkbaar zijn met die beschreven voor DNA-injectie. Gebruik een gedraaid stukje Kim wipe om overtollig PBS glycerol van de embryo's te verwijderen. Pipetteer voorzichtig tussen 50 tot 300 µL gesmolten glycerinegelei over de embryo's, afhankelijk van het aantal embryo's, om een tweede laag gelei aan te brengen.Koel tot slot het objectglas vijf tot 10 minuten af bij -20 °C, of bewaar het overnight bij 4 °C. Om de in glycerol ingebedde embryo's van het objectglas te verwijderen voor beeldvorming onder een dissectiemicroscoop, gebruikt u een scheermesje om de gelei vlakbij de anterieure en posterieure zijden van de uitgelijnde embryo's door te snijden. Houd het scheermesje in een hoek van 90 graden.Voeg om rechte sneden te maken 100 tot 200 µL koude PBT naast de sneden toe. Schraap de gelei voorzichtig rondom de embryo's weg. PBT helpt bij het losmaken van het blok embryo's met behulp van een spatel.Breng het blok over naar een droge microscoopglasplaat voor verdere doorsnijding. Snijd eerst kleinere blokken met vijf tot zeven embryo's erin. Trim vervolgens het overtollige glycerinegelei dat de beeldvorming kan verstoren.Draai ten slotte de ingebedde embryo's met behulp van een scheermesje en een naald naar een rechtopstaande positie. Om drosophila-embryo's te visualiseren met een geïnverteerde confocale microscoop, plaatst u het gelei-blok met de embryo's op een dekglas. Zorg ervoor dat de zijde van het embryo met de minste hoeveelheid gelei in nauwer contact staat met het objectief.Indien er een rechtopstaande microscoop voor beeldvorming wordt gebruikt, maak dan vier stapels supra glue. Nummer één: gebruik dekglasjes als steunen en plaats het embryo-blok in glycerol tussen de steunen. Verbind de stapels met een langer dekglasje voor confocale analyse.Plaats het preparaat op de objecttafel van de microscoop. Controleer de werkafstand van de te gebruiken objectieven om vast te stellen of u door het gehele embryo kunt beelden of slechts gedeeltelijk; stel de confocale configuratie in de computer in om te beginnen met beelden, zoals hier wordt getoond. Als het protocol correct is uitgevoerd, kunnen dwarsdoorsneden van embryo's met een intacte morfologie worden waargenomen, aangezien de embryo's intact blijven.Deze methode kan worden gebruikt om nauwkeurige metingen uit te voeren van embryo-groottes en genexpressieniveaus langs de dorsoventrale as. Zodra men deze techniek onder de knie heeft, kan deze in 30 tot 45 minuten worden uitgevoerd. Het is belangrijk om overtollig glycerol te verwijderen voordat de tweede laag glycerinegelei over de embryo's wordt gegoten.Anders kunnen de twee lagen splijten, waardoor de snijstap bemoeilijkt wordt. Controleer daarnaast de werkafstand van de gebruikte objectieven om vast te stellen of u het gehele embryo of slechts een deel ervan kunt afbeelden, aangezien de werkafstand een beperking vormt voor het beeldveld. Zorg ervoor dat de gelei dicht langs de zijde van het embryo wordt weggesneden die zich het dichtst bij het objectief bevindt.Anders beeldt u alleen gelei af in plaats van de embryo's. Na het bekijken van deze video hopen we dat u een goed inzicht heeft gekregen in hoe u dwarsdoorsneden van Joseph-embryo's kunt maken. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Mesoscopische fluorescentie tomografie opereert buiten de grenzen van de penetratie-weefsel snijden fluorescentie microscopie. De techniek is gebaseerd op multi-projectie verlichting en een foton transport beschrijving. Tonen we aan in-vivo het hele lichaam 3D-visualisatie van de morfogenese van GFP-expressie vleugel imaginaire schijven...

Mesoscopische Fluorescentie Tomografie voor In-vivo Imaging van de ontwikkelingslanden Drosophila</em

Drosophila hemocytes verspreiden over het geheel van de zich ontwikkelende embryo. Dit protocol laat zien hoe te monteren en het imago van deze migraties met behulp van embryo's met fluorescent gelabelde hemocytes.

Live-beeldvorming van Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migraties

Vroege ontwikkeling van de fruitvlieg, Drosophila melanogaster, wordt gekenmerkt door een aantal celvorm veranderingen die zeer geschikt zijn voor de beeldvorming benaderingen. Dit artikel beschrijft elementaire instrumenten en methoden die nodig zijn voor live-confocale beeldvorming van Drosophila embryo's, en zal zich richten op een cel van vorm te veranderen genaamd cellularization.

Imaging Cel Vorm wijzigen in Living Drosophila Embryo&#39;s

Drosophila popstadium Buik Immunohistochemie

Immuunkleuring is een effectieve techniek voor het visualiseren van specifieke celtypen en eiwitten in weefsels. Door het gebruik van sonicatie vermindert het hier beschreven protocol de noodzaak om Drosophila melanogaster weefsels van laat-stadium embryo's en larven te dissekeren voordat immunokleuring wordt uitgevoerd. We bieden een efficiënte methodologie voor de immunokleuring van formaldehyde-gefixeerde hele larven.

-Sonicatie vergemakkelijkt immunofluorescentiekleuring van Late-fase embryonale en larvale<em&gt; Drosophila</em&gt; Weefsels<em&gt; In Situ</em

Dit protocol presenteert een efficiënte methode voor het beeldvormen van het levende Drosophila pupale oogneuro-epitheel. Deze methode compenseert voor weefselbeweging en ongelijke topologie, verbetert de visualisatie van celgrenzen door het gebruik van meerdere GFP-gelabelde junctie-eiwitten en maakt gebruik van een eenvoudig te monteren beeldvormingsopstelling.

Live-beeldvorming van de Drosophila Pupal Eye

De rechtopstaande beeldvormingsmethode die in dit protocol wordt beschreven, maakt de gedetailleerde visualisatie mogelijk van de polen van een zich ontwikkelend Drosophila melanogaster -ei. Deze uiteinden-op-weergave biedt een nieuw perspectief op de arrangementen en morfologieën van meerdere celtypen in het folliculaire epitheel.

Rechtop Imaging van<em&gt; Drosophila</em&gt; Egg Chambers

We beschrijven een gedetailleerd protocol met behulp van hoog-resolutie episcopische microscopie om driedimensionale (3D) beelden van muis-embryo's te verkrijgen. Dit verbeterde protocol maakt gebruik van een gemodificeerde weefselvoorbereidingsmethode om de penetratie van de fluorescente kleurstof te verbeteren, waardoor morfometrische analyse van zowel kleine als grote specimen mogelijk wordt gemaakt.

Rapid Overname van 3D-beelden met behulp van hoge-resolutie episcopische Microscopie

Dit werk beschrijft een semi-High-throughput protocol dat gelijktijdige 3D time-lapse beeldvorming van embryogenese in 80 – 100 C. elegans embryo's in een enkele nachtelijke run toestaat. Daarnaast worden tools voorbeeld verwerking en visualisatie meegeleverd om de gegevensanalyse te stroomlijnen. De combinatie van deze methoden met aangepaste reporter stammen maakt gedetailleerde controle van embryogenese.

Een semi-High-throughput imaging methode en data visualisatie Toolkit om C. elegans embryonale ontwikkeling te analyseren

Dit protocol beschrijft de op maat gemaakte op antilichamen gebaseerde fluorescentie-etikettering en injectie in vroege Drosophila-embryo's om live beeldvorming van eiwitten met een lage abundantie of posttranslationele modificaties mogelijk te maken die moeilijk te detecteren zijn met behulp van traditionele GFP/mCherry-tag-benaderingen.

Visualisatie van eiwitten met een lage abundantie en posttranslationele modificaties in levende Drosophila-embryo's via fluorescerende antilichaaminjectie

Deze protocollen beschrijven hoe de organisatie en occluderende functie van geplooide septaatverbindingen in controle- en mutante Drosophila-embryonale epitheel karakteriseerd kunnen worden.

Immunokleuring en kleurstofpenetratie-experimenten om kerngeplooide septaat-junction-eiwitten te definiëren in het embryonale epitheel van Drosophila

Leer een rechtopstaande beeldvormingsmethode voor Drosophila-embryo's met confocale microscopie. Deze techniek maakt nauwkeurige meting van embryogrootte en kwantificering van eiwit- en RNA-expressieniveaus mogelijk.

Rechtop beeldvorming van Drosophila Embryo's

Meer video's verkennen