Mutagenese en Functionele analyse van ionenkanalen heteroloog Uitgedrukt in zoogdiercellen

G-eiwitgekoppelde inwaarts gelijkrichtende kaliumkanalen of GIRK zijn belangrijk voor het reguleren van de exciteerbaarheid van neuronen. GIRK kunnen worden geactiveerd door zowel G-eiwitgekoppelde receptoren (GPCR's), zoals de muscarinereceptor M2R, als door alcohol. Om de effecten van mutaties in de alcoholbindingsplaats van GIRK te bestuderen, wordt bij activatie een enkele puntmutatie in het GIRK-cDNA geïntroduceerd via site-directed mutagenese. Gezuiverde GIRK-constructen worden, samen met YFP-constructen, getransfecteerd in zoogdiercellen, waarna de transfectie-efficiëntie wordt beoordeeld middels fluorescentie-imaging.

Vervolgens wordt een whole-cell patchclamp-analyse uitgevoerd om de alcohol- en G-proteïne-afhankelijke activatie te vergelijken. Deze visuele experimentele demonstratie verschaft u essentiële informatie over het bestuderen van de functie van LY-kanalen. Vandaag kijken we naar de vraag hoe alcohol groepskanalen activeert.

De hier getoonde techniek voor site-directed neogenese kan inzicht bieden in de functie van ionkanalen. Deze techniek kan ook worden toegepast op andere systemen waarbij bekend is dat een mutatie in een gen menselijke ziekten veroorzaakt. Dit is een demonstratie van de hot cell patch-techniek; deze is cruciaal omdat er veel stappen zijn die precisie, juiste elektronische compensatie en oefening vereisen om bruikbare gegevens te genereren.

Het DNA dat voor transfectie in dit protocol wordt gebruikt, wordt als volgt klaargemaakt. Eerst wordt de GRK-subeenheid, DNA uit PCR, direct gekloond in de mammale expressievector. In plasmide PC DNA 3.1 worden puntmutaties geïntroduceerd met behulp van specifiek ontworpen primers in combinatie met de QuickChange XL II site-directed mutagenesis kit.

Met behulp van dit systeem wordt er PCR uitgevoerd waarbij het gehele plasmide wordt gerepliceerd en puntmutaties, gecodeerd door de primers, worden geïntroduceerd. Na de PCR worden de gerepliceerde plasmiden behandeld met het restrictie-enzym Dpn I en vervolgens via hittestok getransformeerd in XL10-Gold ultra-competente E. coli. De getransformeerde bacteriën worden gekweekt op LB-agarplaten met ampicilline; bacteriën die het plasmide bevatten zijn resistent tegen ampicilline en zullen kolonies vormen.

De geïsoleerde kolonies worden opgepikt en gekweekt in miniculturen. Er worden minipreps uitgevoerd om het plasmid-DNA te isoleren. Vervolgens wordt het DNA gesequenced om de succesvol getransformeerde mutanten te identificeren.

E coli worden in een grotere batch gekweekt en er worden maxi-preps uitgevoerd om grotere hoeveelheden plasmid DNA te verkrijgen. Plateer ongeveer 1 × 10⁵ HEK 293T-cellen in elk van de twee wells op een 12-wells plaat, één voor de mutant en één voor de controle (wildtype kanaal). Incubeer bij 37 °C.

Na acht tot 24 uur zullen de cellen aan hun substraat hechten en zijn ze klaar voor transfectie. Transfecteer de cellen met lipo 2000 volgens de instructies van de fabrikant met 0,2 micrograms channel CDNA, 0,4 micrograms M two R receptor CDNA en 0,04 micrograms Y-F-P-C-D-N-A. Om succesvol getransfecteerde cellen te identificeren, moeten de cellen 24 uur worden geïncubeerd.

Nadat de gewenste incubatietijd is verstreken, plaatst u de cellen op de tafel van een inverted fluorescentiemicroscoop om de transfectie-efficiëntie te bepalen. Vergelijk de fluorescentie- en DIC-beelden om het percentage getransfecteerde cellen vast te stellen. Plaats de kweekschaal vervolgens terug in de incubator.

Reinig glazen dekglasjes van 12 millimeter en bewaar deze in ethanol tot gebruik. Verwijder de resterende ethanol door ze kort in een vlam te houden in de steriele kast. Plaats de dekglasjes in een 24-wells plaat en coat deze met 0,2 milligram per milliliter.

Trypsiniseer 24 uur na transfectie de cellen op poly-D-lysine en zaai ze uit met een dichtheid van 4 × 10³ cellen per putje. Incubeer de cellen in vier tot acht putjes van een 24-wells schaal met poly-D-lysine gecoate glazen dekglasjes gedurende nog eens 24 tot 48 uur voordat de whole-cell patch clamp wordt uitgevoerd. Bereid patchelektroden met een twee-staps verticale puller en borosilicaatglas.

Idealiter heeft de voltooide elektrode een weerstand van drie tot zeven megaohm en is er geen verdere bewerking, zoals hittepolijsten, nodig. Plaats voor patch clamping een dekglas met getransfecteerde cellen in een schaal van 35 millimeter met een externe oplossing van 20 millimolar kalium of 20 K. Plaats de schaal op de tafel van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop.

De hier gebruikte patchclamp-opstelling maakt gebruik van een perfusiesysteem. Dit systeem bevat de extracellulaire oplossingen die op de cellen worden aangebracht, welke via slangen naar een manifold worden geleid door middel van zwaartekrachtvoeding. Elke oplossing wordt op afstand aangestuurd met een solenoid-knijpklep.

Gebruik DIC om scherp te stellen en cellen te vinden. Schakel over naar het YFP-filter om de YFP-positieve cellen te lokaliseren. Zodra de YFP-positieve cellen zijn geïdentificeerd, positioneert u de tip van het perfusiesysteem, neuro fluorescente cel, op 20 tot 30 micron of twee tot drie cellengtes afstand.

Vul een elektrode met interne elektrodensolution. Tik met een spuit en een flexibele naald voorzichtig tegen de gevulde elektrode om luchtbellen uit de tip te verwijderen. Bevestig de elektroden aan de head stage van een AXO patch 200 B versterker.

Controleer opnieuw of de instellingen op de versterker overeenkomen met één configuratie. De whole cell-schakelaar staat op bèta equals een, en het laagdoorlaatfilter van het vat is ingesteld op 10 kilohertz. Breng met de spuit positieve druk aan en gebruik de klem om de elektrodepunt schoon te houden.

Gebruik vervolgens een micromanipulator om de punt van de elektrode in het bad te plaatsen en verplaats deze naar een positie boven de cel. Zet de versterker in de V track-modus en de meterknop op V track. Gebruik vervolgens de pipette offset potential-meter op de versterker om het pipetpotentiaal te nulstellen door de spanning op het display van de versterker op 0,00 te brengen.

Schakel alternatief over naar de V-clamp-modus op de versterker en selecteer de testpulse-knop om een testspanningsstap toe te dienen. De rechthoekige spanningsstap verschijnt in het seal-testvenster van de clamp. Pas de pipet-offset op de versterker aan om de basislijnstroom naar nul nanoampère te brengen.

De afdichtingstest geeft de elektroderesistentie weer, die drie tot zeven megaohm moet zijn. Sluit vervolgens het venster van de afdichtingstest. Selecteer 'acquire open protocol' in het vervolgkeuzemenu.

Select vervolgens een opgeslagen spanningsprotocol. In dit geval is het geselecteerde protocol vooraf geprogrammeerd om een enkele spanningsstap naar min 100 millivolt te leveren en elke twee seconden op te lopen naar plus 40 millivolt. Dit ramp-protocol maakt het mogelijk om het omkeerpotentiaal en de eigenschap van binnenwaartse rectificatie van GK-kanalen waar te nemen.

Voor spanningsgestuurde ionkanalen kan een rechthoekige spanningsstap geschikter zijn. Gebruik de fijne instelling van de micromanipulator om de cel te naderen, laat de positieve druk los en breng, nadat het celoppervlak is geraakt, een lichte negatieve druk toe. Monitor de resulterende toename in weerstand in de seal-test. Zodra de weerstand in het gigaohm-bereik ligt, is de elektrode verzegeld op het membraan.

Dit wordt een giga-seal genoemd. Gebruik een spuit om een puls negatieve druk toe te passen om het membraan te doorbreken en toegang tot de cel te verkrijgen. Zodra de whole-cell configuratie is bereikt, zal de seal-test grote capacitieve stromen registreren die zichtbaar zijn als spikes of transiënten aan het begin en einde van de test.

Pulse in seal test. Klik vervolgens op de knop voor de membraantest. Registreer in klem X de toegangsweerstand en de membraanweerstand.

Een membraancapaciteit in een notitieblok om de exponentiële fit visueel te verifiëren. De membraancapaciteit is proportioneel aan de celgrootte en zal worden gebruikt om de stroomdichtheid te berekenen. De toegangsweerstand en membraanweerstand worden gebruikt om te evalueren of de registratie voldoende zal zijn om door te gaan.

Een goede opname kenmerkt zich door een lage toegangsweerstand. Sluit nu het venster voor de membraantest en klik opnieuw op de knop voor de sealtest; stel in het venster voor de sealtest de V-out in op minus 40 millivolt om te compenseren voor de membraancapaciteit en de serieweerstand op de versterker, schakel de whole cell cap in, en stel de whole cell cap en serieweerstand bij totdat de transient is geminimaliseerd en de stroom een vlakke lijn vormt. Pas indien nodig de pipetcapaciteit aan met de fast cap-knop op de versterker.

Te veel of te weinig compensatie zal leiden tot een resterende capaciteitstransiënt. Draai vervolgens de knop voor de voorspellingspercentage naar 60 tot 80% en pas de hele cel-capaciteit, de serieweerstand en de snelle capaciteit naar behoefte aan om een vlakke lijn in de sealtest te verkrijgen. Draai tot slot de compensatiepercentage naar ongeveer 100% zonder dat de cel gaat oscilleren, terwijl u probeert de puls zo lineair mogelijk te houden door de potentiometers van de hele cel-capaciteit, de serieweerstand en de snelle capaciteit opnieuw af te stellen.

Zodra de compensatie van de weerstand en capaciteit is voltooid, noteert u de ingestelde waarden voor de serieweerstand van de versterker-capaciteit in procenten, het compensatiepercentage, de voorspelling en de vertragingstijd in een logboek en opent u het externe oplossingsventiel voor de 20 K badoplossing van de controle. Stel het laagdoorlaatfilter van het vat op de versterker in op 2 kHz. Start vervolgens de registratie van de stromen door op de opnameknop in de software te klikken.

Let op de inward rectificatie-eigenschap van de ger-stroom. Dit is zichtbaar als een grote binnenwaartse stroom bij een potentiaal negatiever dan de kalium-omkeerpotentiaal die wordt bepaald door de Nernst-vergelijking EK, en een kleine buitenwaartse stroom bij een potentiaal positiever dan ek. Bepaal na het registreren van een stabiele baseline de receptor-gemedieerde activatie van stromen door extracellulaire oplossing 20 k plus carbachol toe te dienen.

Zodra de piekactivatie is waargenomen en de stroom een stabiele toestand bereikt, wordt teruggeschakeld naar de K-badoplossing en wordt gewacht tot het basisstroomniveau is bereikt. Schakel vervolgens over naar externe oplossing 20 k plus 100 millimolar ethanol om de alcoholactivatie van gert-stromen te bestuderen en wacht op de piekrespons.

Schakel vervolgens terug naar de 20 K badoplossing en wacht tot het basisstroomniveau is bereikt. Schakel ten slotte over naar de 20 K plus 20 K bariumoplossing om de basale gert-stroom te bepalen en wacht op de respons. De inhibitie van de gerk-stroom moet duidelijk zichtbaar zijn, waarbij deze gedurende de procedure het meest uitgesproken is bij minus 100 millivolts.

Noteer het nummer van de trace-sweep dat correspondeert met de toevoeging van verschillende extracellulaire oplossingen. Eén enkel clamp fit-bestand bevat alle sweeps van de gehele experimenten. Gebruik de clamp FIT 8.2-software om GK-gegevens te analyseren.

Volgens de instructies in het bijbehorende geschreven protocol werden twee verschillende whole-cell opnames gemaakt van HEC 2 9 3 T-cellen die respectievelijk wild-type of mutante GK-kanalen tot expressie brachten, en geanalyseerd volgens de instructies in deze video, zoals hier getoond voor wild-type GK2. Het paneel aan de linkerzijde bevat een venster met verschillende over elkaar heen gelegde stromingen die werden opgewekt door het voltage-ramp-protocol in aanwezigheid van verschillende oplossingen. Let op de inwaartse rectificatie.

Dat is de grotere binnenwaartse stroom bij min 100 millivolt rond 50 milliseconden op het stroomspoor. De kleine uitwaartse stroom tussen nul en plus 40 millivolt rond 200 tot 260 milliseconden op het stroomspoor is afkomstig van een endogeen voltage-gestuurd kaliumkanaal. Het is niet de Gert-stroomcursor.

Eén cursor wordt geplaatst op de maximale binnenwaartse stroom en de cursorwaarden worden in het spreadsheet genoteerd. In het spreadsheet zijn het sporenummer en de stroom bij -100 millivolt zichtbaar.

De gegevens omvatten de basale stroom, door carbachol geïnduceerde en door alcohol opgewekte stromen, evenals een door barium geremde stroom. Evenzo de voltage ramp-stromen in de aanwezigheid van verschillende oplossingen. Voor het mutante kanaal L 2 57 w worden 20 k plus 100 millimol ethanol of 20 k plus vijf millimol carbachol of 20 k plus barium getoond.

Let op de significant kleinere stromen die door alcohol en carbo-alcohol worden geïnduceerd. Deze bevindingen suggereren dat dit residu een belangrijke rol speelt bij de gating van GK-kanalen door alcohol en g beta gamma-subunits. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u een mutatie in een gen kunt construeren en hoe u het effect daarvan op de kanaalfunctie kunt bestuderen met behulp van geavanceerde elektrofysiologische technieken.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze op site-gerichte neogenese gebaseerde methode in twee tot drie dagen worden uitgevoerd en worden uitgebreid naar vijf of meer mutaties. De ontwikkeling van deze technieken maakte het voor biofysici van ionkanalen mogelijk om fundamentele eigenschappen van de werking en gating van ionkanalen te onderzoeken. Daarnaast stellen ze onderzoekers in staat om menselijke ziekten te bestuderen die worden veroorzaakt door een enkele mutatie in een ionkanaalgen.