Name: Mutagenese en Functionele analyse van ionenkanalen heteroloog Uitgedrukt in zoogdiercellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-01T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 28 s
Description: Leer hoe je site-directed mutagenese en patch clamp analyse gebruikt om de functie van GRK-ionenkanalen in zoogdiercellen te onderzoeken. Deze methode helpt onderzoekers mutatie-effecten op kanaalactivatie te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ons werk werd mogelijk gemaakt door financiële steun van McKnight Endowment Fund voor Neurowetenschappen (PAS), het National Institute on Drug Abuse (R01 DA019022, PAS) en een pre-doctorale NIH NRSA fellowship aan PA (F31AA017042) van het National Institute on Alcohol melden en alcoholisme. De GIRK2-L257W mutant werd verzorgd door dr. Prafulla Aryal. Fluorescentiemicroscoop en sponsoring vriendelijk verschaft door Leica Instruments.

1. Plaatsgerichte mutagenese We maken gebruik van zoogdieren expressieplasmide pcDNA3.1 dat codeert voor een cDNA voor GIRK2 en invoering van een punt mutatie met behulp van Stratagene (Agilent Technologies) Quikchange XL II plaats-gerichte mutagenese kit, volgens de instructies van de fabrikant. Primers volgorde kan eenvoudig worden gegenereerd met behulp van online primer ontwerp van het programma te vinden op: <a href="https://www.genomics.agilent.com/CollectionSubpage.aspx?PageType=Tool&amp;SubPageType=ToolQCPD&amp;PageID=15">https://www.genomics.agilent.com/CollectionSubpage.aspx?PageType=Tool&amp;SubPageType=ToolQCPD&amp;PageID=15</a> Opmerking: Wij gebruiken standaard 1,5 ml Eppendorf buizen in plaats van BD 14 ml buizen beschreven in het protocol. Echter, het gebruik van XL10-Gold ultracompetent E. coli voorbehandeld met β-mercapto-ethanol, 30s heat shock tijd en NZY + (of NZYM +) media zijn van cruciaal belang voor de succesvolle mutagenese. Indien mogelijk, kan het vervaardigen van een extra stille mutatie die een nieuwe beperking site maakt handig zijn voor het screenen van mutant kolonies hieronder. 2. Miniprep, DNA-sequencing en Maxiprep 2.1 Qiagen Miniprep en sequencing. Individuele kolonies worden geplukt en gekweekt in LB-bouillon met ampicilline (AMP). We volgen de instructies van de fabrikant voor de zuivering van het cDNA. Een eenvoudige restrictiedigestie kan worden gebruikt bevestigen de succesvolle introductie van de mutatie, indien een beperking site is opgenomen in stap 1 hierboven. Geautomatiseerde DNA-sequencing is off-site gedaan, en is essentieel om te bevestigen de aanwezigheid van de mutatie in het cDNA, evenals beoordelen of er sprake is van ongewenste mutaties. Deze stap is zeer belangrijk. We volgorde de hele GIRK coderende sequentie met behulp van forward T7 promoter en reverse BGH sequencing primers die flank meerdere kloneringsplaats van de pcDNA3.1 plasmide. Opmerking: Het is belangrijk om zorgvuldig te inspecteren de sequentiebepaling electropherogram om voldoende kwaliteit van de sequencing gegevens te verzekeren. Hoge kwaliteit electropherogram heeft scherpe, niet-overlappende pieken met weinig ruis. 2.2 Qiagen maxiprep. We volgen de instructies van de fabrikant. Opmerking: Deze stap is opgenomen in onze experimenten om de zuiverheid van het cDNA, die wij belangrijk vinden is voor een efficiënte transfectie te verbeteren. 3. Cultuur en de Transfectie van cellen HEK293T Al deze stappen moeten worden gedaan in een steriele weefselkweek kap. 3,1 cel cultuur HEK293T cellen zijn gemakkelijk te gebruiken omdat ze gemakkelijk te kweken (37 ° C, 5% CO 2 bevochtigde incubator), hebben een snelle replicatie, hoge transfectie-efficiëntie en vatbaar zijn voor whole-cell patch-clamp elektrofysiologie. HEK293T cellen brengen SV40 grote T antigen dat episomale replicatie van plasmide pcDNA3.1 zorgt. HEK293T cellen worden gekweekt in lage-glucose DMEM media aangevuld met L-glutamine en 10% foetaal runderserum (FBS). Voor de passage cellen toe te voegen 0,25% trypsine / EDTA tot samenvloeiing (90-95%) HEK293T cellen, wachten tot cellen los te maken van het weefsel schotel, stop dan met de enzymactiviteit door toevoeging van verse media met FBS /. Plaat ~ 1 X 10 5 cellen / putje in een 12 goed celkweek schotel, samen met 1 ml van antibiotica-vrije cultuur media per well. (1 X 10 5 cellen is ~ 350 pi van de celsuspensie verkregen uit samenvloeiende T25 fles opnieuw gesuspendeerd met 10 ml media). 3.2 Transfectie Na 8-24 uur, zal HEK-cellen zich te houden aan de kunststof en zijn klaar voor transfectie. Transfecteren cellen met 0,2 ug kanaal cDNA, 0,4 microgram M2R receptor cDNA en 0,04 microgram YFP cDNA met behulp van Invitrogen Lipofectamine 2000. Let op: we gebruiken een kleine hoeveelheid YFP cDNA om te bepalen welke cellen worden getransfecteerd met succes (groene cellen zullen waarschijnlijk bevatten zowel GIRK kanalen en M2-receptoren). De concentratie van cDNA te gebruiken zullen moeten worden aangepast voor elke kloon. 3.3 Fluorescentie visualisatie van getransfecteerde cellen. Plaats 12-wells plaat op het podium van een omgekeerde fluorescentie microscoop, en te onderzoeken cellen voor YFP expressie. Te vergelijken met DIC afbeelding en noteer bij benadering het aantal groene cellen. Dit geeft een schatting van de transfectie-efficiëntie. 3.4 Voorbereiding van de 24-well gerechten en Poly-D-lysine gecoate dekglaasjes Schoon 12 mm glas dekglaasjes (Warner, CS-12R) door schudden ze 's nachts met Radiacwash, gevolgd door wassen met gedemineraliseerd water en' s nachts te schudden in 95% ethanol. Bewaar de schone dekglaasjes in 70% ethanol tot gebruik. Plaats dekglaasjes in een petrischaal met ethanol, vlam uit ethanol met behulp van pincet en de brander, eend plaats in een putje van een steriele 24 wells plaat. Bedek elk putje met 250 ul van poly-D-lysine (PDL) oplossing [0,2 mg / ml] en laat de dekglaasjes zitten 's nachts ondergedompeld in PDL oplossing onder steriele kap. Wikkel de 24 wells plaat in Parafilm om de verdamping te voorkomen. De volgende ochtend, aspireren PDL en was 2x met steriel water. Laat platen te openen om te drogen onder de motorkap dan, te dekken. De 24 goed gerechten met gecoate dekglaasjes kan worden verpakt in met steriele aluminiumfolie en opgeslagen bij kamertemperatuur weken. 3.5 Plating getransfecteerde HEK293T cellen op de dekglaasjes 24 uur na transfectie, splitsen cellen in 24-well schaal (~ 4 X 10 3 cellen / putje) bevattende glazen dekglaasjes bekleed met poly-D-lysine. Let op: getransfecteerde cellen kunnen gebruikt worden tot 24-72 uur na transfectie. De cellen zijn verdeeld aan individuele dekglaasjes bieden voor patch clamp elektrofysiologie experiment. 4. Elektrofysiologie 4.1 voorbereiden Solutions Extracellulaire (bad) oplossing: 20 mM KCl, 140 mM NaCl, 0,5 mM CaCl 2, 2 mM MgCl 2 en 10 mM HEPES (pH 7,4 ingesteld met NaOH). Aliquot 20K bad-oplossing en voeg de juiste modulatoren <ul><li> 20K + Ba 2 +: oplossing met 1 mM BaCl 2: een specifieke remmer van naar binnen stromen rectificeren </li><li> 20K + carbachol: oplossing met 5 uM carbachol: een specifieke M2R agonist; M2R koppels om G-eiwitten die open GIRK kanalen </li><li> 20K + Ethanol: bad oplossing die 100 mM EtOH om direct te activeren GIRK kanalen </li></ul> Plaats bad oplossingen in spuiten (oplossing containers) van de snelle uitwisseling perfusie-systeem. Opmerking: We maken gebruik van een Warner knijpklep systeem om het bad oplossingen te controleren. PE-buizen wordt aanbevolen. Interne / elektrode-oplossing: 140 mM KCl, 20 mM NaCl, 5 mM EGTA, 5,4 mM MgCl2, 10 mM HEPES (pH 7,4) met 2,5 mM K 2 ATP en 0,3 uM Li 2 GTP. Wij maken de elektrode oplossing zonder ATP en GTP. We afzonderlijk voor te bereiden aliquots van ATP en GTP, die zijn opgeslagen bij -80 ° C, en toe te voegen aan de elektrode oplossing op de dag van het experiment. We houden spuit met de definitieve elektrode oplossing op ijs om de ATP / GTP te behouden. We steriel filter (0,2 um) de interne / externe oplossingen voor microbiële groei te remmen en verminderen de mogelijkheid van verstopping van de buizen en de elektrode. 4.2 Pulling elektroden We maken gebruik van Narishige twee-staps verticale puller en borosilicaatglas elektrode van Warner Instrument (1,5 mm buitendiameter, 0,86 mm, inwendige diameter en 7,5 cm lengte) om elektroden te verkrijgen met 3-7 MΩ weerstand bij gevuld met intracellulaire oplossing. Opmerking: Het is noodzakelijk om experimenteel parameters te bepalen voor de elektrode trekker en het type van de elektrode glas in uw lab. Voor onze verticale trekker maken wij gebruik van een warmte-instelling van 60,2 voor de eerste trek en ~ 43 voor de tweede te trekken. 4.3 whole-cell patch klemmen <ol><li> Mount dekglas in een 35 mm schaal met behulp van kleine hoeveelheid vaseline, dek af met externe oplossing en plaats schotel op het podium van een omgekeerde fluorescentie microscoop. Gebruik DIC om zich te concentreren en vinden cellen, overschakelen naar YFP fluorescentie te YFP positieve cellen te lokaliseren. </li><li> Positie tip van perfusie manifold de buurt van een groene cel (20-30 urn uit de cel van belang = 2-3 cell lengte van elkaar). </li><li> Vul de elektroden met een oplossing, bevestig deze aan de headstage van Axopatch 200B versterker (Axon Instruments) met de volgende basisinstellingen: Gain 1, Configuratie: whole-cell β = 1, mode V-klem. </li><li> Van toepassing zijn positieve druk op de elektrode om te voorkomen dat verstopping van de pipet, en gebruik de manipulator te elektrode plaats net boven de cel. </li><li> To Zero de pipet potentieel, selecteert u het Seal Test knop om een ​​testspanning stap te leveren. De 5 mV rechthoekige spanning stap zal verschijnen in het venster van Seal Test Clampex. Stel de Pipetteer Offset potentiometer op de versterker naar de basis-line stroom naar 0 nA te brengen. Als alternatief, nul de pipet potentieel door over te schakelen van de versterker functieschakelaar naar V-track modus en de meter knop om VTrack en de pipet Offset potentiometer te gebruiken op de versterker om de spanning te brengen op de versterker meter display "0.00". </li><li> Controleer de weerstand van de elektrode met behulp van dichtheidsbeproeving bevel van de Clampex 8.2 software (moet zijn 3-7 MΩ). </li><li> Open een opgeslagen protocol bestand of maak een nieuw protocol. Om open protocol bestand te selecteren in het hoofdmenu Acquire vervolgens op Openen Protocol en kies een opgeslagen spanning protocol bestand. Voor dit experiment is het protocol is gemaakt om membraanpotentiaal houden op-40mV, leveren een enkele 50 ms spanning stap tot -100 mV en oprit tot +40 mV meer dan 200 ms. Dit protocol is uitgevoerd om de 2 seconden. De helling-protocol zorgt voor observatie van de omkering potentieel en naar binnen rectificatie van GIRK kanalen. Voor de voltage-gated ionkanalen, kan een rechthoekige spanning stap meer aangewezen zijn. </li><li> Aanpak cel met behulp van fijne afstelling van de manipulator, laat een positieve druk, na het aanraken van het celoppervlak van toepassing zijn negatieve druk, en de monitor verhoging van de weerstand in de Seal Test oscilloscoop venster. Eenmaal weerstand is in de GΩ serie, heeft de elektrode verzegeld op membraan (Gigaseal heeft gevormd). </li><li> Breng een puls van negatieve druk op de celmembraan te breken en krijg toegang in de cel. Eenmaal in de whole-cell configuratie, zal u zich registreren verhoogde capacitieve stromen. </li><li> Schakel over naar Membraan Test in Clampex en noteer de toegang tot weerstand Ra, membraan weerstand Rm, membraan capaciteit Cm en controleer door het oog van de exponentiële pasvorm van de theoretische curve naar de echte capacitieve stroom. Membraan capaciteit is evenredig met celgrootte en zal later worden gebruikt om de huidige dichtheid te berekenen. </li><li> Schakel terug naar Test, set V-Out (membraan potentiële) tot -40 mV en filter Seal bij 10 kHz </li><li> Compenseren voor membraan capaciteit en serieweerstand op de versterker met de volgende stappen: <ol class="lalpha"><li> Schakel de hele cel GLB in te schakelen. Pas de hele cel GLB en serieweerstand wijzerplaten heen en weer, tot je een vlakke testpuls. U kunt ook moet pipet capaciteit FAST CAP knop aan te passen. </li><li> Schakel% VOORSPELLING knop naar ongeveer 60-80%, weer opnieuw aanpassen hele cel GLB en de serieweerstand kiezen (je kan hebben om pipet capaciteit schadevergoeding FAST GLB-knop ook te passen). </li><li> Zet% COMP-tot 100% zonder oscillerende de cel, terwijl het proberen om de pols te houden plat door het opnieuw te passen hele cel GLB en serieweerstand (je kan hebben om pipet capaciteit schadevergoeding FAST GLB-knop ook te passen). Stel de vertraging door het verminderen van de tijd constant. </li><li> Noteer de waarden voor de Cm (membraan capaciteit), Rs (serieweerstand),% COMP,% pred en Lag tijd in te stellen op de versterker in de notebook. De CM en Rs moet ongeveer dezelfde zijn als de Cm en Rm gemeten in het membraan Test hierboven. </li></ol></li><li> Schakel externe oplossing klep om het bad oplossing te controleren. Stel de versterker 8-polige Bessel-filter om 2kHz, opent een spanning klem protocol en beginnen met opnemen stromingen. </li><li> We nemen GIRK stromen met behulp van een helling protocol dat tot -100 mV stappen voor 50 ms dan opritten van 100 mV tot +40 mV meer dan 200 ms en wordt geleverd om de 2 seconden. De helling-protocol zorgt voor de observatie van de omkering potentieel en voor actieve rectificatie eigendom van GIRK kanalen. Bij kamertemperatuur (22-25 ° C), de huidige GIRK moet in de buurt van -50 mV (met 20 mM KCl in het bad), die in de buurt van de berekende evenwicht potentieel voor K (E K = -50 mV) achteruit, dan blijven tamelijk vlak bij potentialen positief naar E K. </li><li> Experimentele Protocol: Na het opnemen van een stabiele basislijn, overschakelen naar oplossing 20K + carbachol en wacht op top van de reactie, ga terug naar 20K bad oplossing, dan gelden 20K + Ethanol en wacht op grootste gevoeligheid, schakel dan over naar 20K bad oplossing, en ten slotte naar 20K + Ba 2 +-oplossing. Tijdens de toepassing van deze medicijnen zie je veranderingen in de amplitude van de GIRK stromingen (het meest uitgesproken bij -100 mV). Let op het trace nummer dat overeenkomt met de toepassing van verschillende extracellulaire oplossingen in de notebook. Een enkele Clampfit bestand bevat alle veegt voor de gehele experiment. </li></ol> 5. Data Analysis We maken gebruik van Clampfit 9.2 software om gegevens te analyseren GIRK stromen bij -100 mV. <ol><li> Open het bestand met de opname, stelt u de cursor bij -100 mV. Standaard ziet u alle sporen overlay op het scherm. Door te drukken op "Write cursors" icoon maakt u Excel-achtige spreadsheet met numerieke gegevens. </li><li> Door het toewijzen van X aan het trace nummer kolom en Y om de cursor te kolom en op "Create Graph"-pictogram kunt u snel tekenen een tijdsverloop plot van het experiment. </li><li> Bereken basale stroom door het aftrekken van de huidige in aanwezigheid van Ba 2 + van de huidige opgenomen in externe perfusie-oplossing alleen ("20K huidige" minus "20K + Ba 2 + current"). Bereken geïnduceerde stroom door het aftrekken van basale stroom in 20K van de geactiveerde stromen ("20K + carbachol huidige" minus "20K stroom", "20K + Ethanol huidige" minus "20K current"). Bereken de stroomdichtheid (pA / pF) door de huidige door de membraan capaciteit (rechtstreeks op de versterker). Bereken procent activatie door te delen geïnduceerde stroom door de basale stromen en te vermenigvuldigen met 100. </li></ol> 6. Representatieve resultaten U moet in staat zijn om huidige record van cellen getransfecteerd met wild-type kanalen. Voor GIRK kanalen metend in de extracellulaire oplossing die 20 mM K + (en 145 mM K + intracellulair) moeten ze sterke innerlijke rectificatie en een omkering potentieel van ~ -50 mV, dat is een essentiële eigenschap van kalium kanalen vertonen. De wild-type stroom zal sterk toenemen op carbachol applicatie (3-5 voudige toename van meer dan basale stroom) en reageert op dezelfde wijze als de 100 mm ethanol. Let op: de tekenconventie voor elektrofysiologie is het inwendige stroom negatief is en naar buiten stroom is positief. Voor de L257W mutatie in de alcohol bindingsplaats van GIRK2, ziet u verzwakt reacties op zowel de carbachol en ethanol. Dit suggereert dat de L257 is betrokken bij de alcohol-en G-eiwit activering van GIRK2 kanalen. Voor meer voorbeelden van de resultaten van GIRK2 mutagenese, zie de recente publicatie van Aryal et al.. 1. <img src="/files/ftp_upload/2189/2189fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Window of Clampfit 8.0 toont gegevens bestand voor wild-type GIRK2 opname. Linksboven toont bovenop veegt vastgelegd in reactie op een ramp spanning protocol in de aanwezigheid van verschillende externe bah oplossingen. Cursor een is geplaatst bij -100 mV. De cursor waarden worden weggeschreven naar de spreadsheet (rechter paneel). Linksonder paneel toont de plot van sweep nummer vs, de huidige. Let op de toename van de huidige (neerwaartse afbuiging) met ethanol (EtOH) en carbachol (Carb) en de huidige remming met Ba 2 +. <img src="/files/ftp_upload/2189/2189fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Window of Clampfit 8.0 toont gegevens bestand voor een mutant GIRK2-L257W opname. Beschrijvingen zijn dezelfde als in figuur 1. Gewezen op het verlies van de carbachol (Carb) activering en vermindering van EtOH-geïnduceerde stromingen in de mutant kanalen.

<ol><li>Aryal, P., Dvir, H., Choe, S., Slesinger, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+discrete+alcohol+pocket+involved+in+GIRK+channel+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A discrete alcohol pocket involved in GIRK channel activation.</a> Nature Neurosci. 12, 988-995 (2009).</li>
<li>Panchenko, V. A., Glasser, C. R., Mayer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+similarities+between+glutamate+receptor+channels+and+K%2B+channels+examined+by+scanning+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Phys%22%5BJournal%5D)">Structural similarities between glutamate receptor channels and K+ channels examined by scanning mutagenesis.</a> J Gen Phys. 117, 345-360 (2001).</li>
<li>Doyle, D. A., Cabral, M. orais, Pfuetzner, J., Kuo, R. A., Gulbis, A., Cohen, J. M., Chait, S. L., &amp, B. T., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+potassium+channel%3A+molecular+basis+of+K%2B+conduction+and+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The structure of the potassium channel: molecular basis of K+ conduction and selectivity.</a> Science. 280, 69-77 (1998).</li>
<li>Nishida, M., Cadene, M., Chait, B. T., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+Kir3.1-prokaryotic+Kir+channel+chimera%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a Kir3.1-prokaryotic Kir channel chimera.</a> EMBO J. 26, 4005-4015 (2007).</li>
<li>Tao, X., Avalos, J. L., Chen, J., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+eukaryotic+strong+inward-rectifier+K%2B+channel+Kir2.2+at+3.1+%26Aring%3B+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the eukaryotic strong inward-rectifier K+ channel Kir2.2 at 3.1 &Aring; resolution.</a> Science. 326, 1668-1674 (2009).</li>
</ol>

Plaats-gerichte mutagenese is een klassieke benadering van de structuur-functie relaties van ionenkanalen te bestuderen. Het is gebaseerd op het uitgangspunt dat door het veranderen van een kritische residu van het ionkanaal moet men in staat zijn om uitgesproken veranderingen in het kanaal functie waarnemen. In tegenstelling, kunnen veel mutaties in de niet-kritische houding worden ingevoerd zonder grote verstoringen om het kanaal te werken. Meestal wordt het residu in vraag te beginnen gemuteerd om alanine, een kleine niet-polair aminozuur, gevolgd door een mutatie aan tryptofaan, de grootste van aminozuren 2. Als het residu is van belang om het kanaal functie, zullen beide mutaties veranderen kanaal activiteit. Als een minder essentiële residu wordt gemuteerd, de effecten van de mutatie, vooral aan alanine zijn vaak onopvallend. Tryptofaan mutaties hebben meer kans om veranderingen als gevolg van sterische belemmeringen worden geassocieerd met het tryptofaan grootte veroorzaken. Vaak, wanneer kunnen de structurele informatie ontbreekt, systematische mutatie naar alanine of tryptofaan binnen een fragment van kanaal (de zogenaamde alanine of tryptofaan scan) worden gebruikt om kritische resten te vinden. Het is belangrijk op te merken dat meerdere klonen met verschillende puntmutaties kunnen worden bereid in parallel waardoor het testen van meerdere residuen binnen relatief korte tijd. Onlangs hebben meerdere kristalstructuren van de kanalen beschikbaar zijn 3,4,5. Ze kunnen worden gebruikt om potentiële sleutel residuen te testen met behulp van de aanpak beschreven in dit protocol te stellen. Metingen aan wild-type kanaal moet altijd gepaard gaan met de meting van een mutant kanaal om te dienen als een positieve controle om te verzekeren dat transfectie en elektrofysiologische experimenten correct werden uitgevoerd. Punt mutaties kunnen leiden tot een gebrek aan een functionele stroom, een stroom vergelijkbaar met de wild-type of gewijzigde regelgeving van het kanaal activiteit. Het ontbreken van meetbare stroom kan worden als gevolg van onjuiste vouwen of gewijzigde mensenhandel. In een dergelijk geval kan het nuttig zijn om uit te vinden of het kanaal correct trafieken naar de oppervlakte met behulp van een biotinylatie assay of immunofluorescentiekleuring tegen extracellulaire tag (zonder cel permeabilisatie) tussen niet-functionele kanalen onderscheiden op het plasmamembraan en kanalen behouden in de cel . Tot slot is het raadzaam om te onderzoeken, niet alleen basale activiteit van het kanaal, maar ook de gevolgen van de mutatie op het kanaal regelgeving. Verschillende mechanismen van de modulatie van het kanaal functie kan worden bestudeerd, afhankelijk van het ionkanaal van belang, met inbegrip regulering door G-eiwitten, PIP2, ionen, ATP-concentratie, fosforylering (met behulp van tyrosine, serine of threonine mutatie), ubiquitinering of sumoylation (met behulp van lysine mutatie) en directe kanaal openers of blokkers.

<table><tbody><tr><td>Chemicaliën</td><td>Sigma</td><td>Varieert</td><td></td></tr><tr><td>Mini Prep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Radiacwash</td><td>Biodex</td><td>005-100</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine hydrobromide</td><td>BD Biosciences</td><td>CB40210</td><td>Poly-L-lysine kan ook worden gebruikt</td></tr><tr><td>Maxi Prep Kit</td><td>Qiagen</td><td>12263</td><td></td></tr><tr><td>QuickChange XL II Site Directed Mutagenesis Kit</td><td>Stratagene</td><td>200512-5</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 200</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>Dekglasjes &amp;#710;&amp;#8230; 12 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>CS-12R</td><td></td></tr><tr><td>Capillair glazen buisje Borosilicaat-standaard wand</td><td>Warner Instruments</td><td>G150-3</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/clinical/inverted-microscopes/details/product/leica-dmi30-b/" target="blank"&gt;Inverted fluorescentiemicroscoop&lt;/a&gt;</td><td><a href="http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/clinical/inverted-microscopes/details/product/leica-dmi3000-b/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Leica</a></td><td>DMI30 B</td><td></td></tr><tr><td>Elektrofysiologie</td><td>Nikon/&lt;br/&gt;Leica/&lt;br/&gt;Zeiss</td><td>Elke omgekeerde DIC&lt;br/&gt;(Hoffmann)&lt;br/&gt;fluorescentiemicroscoop</td><td></td></tr><tr><td>Versterker</td><td>Molecular Devices</td><td>Axon Axopatch 200B-versterker</td><td></td></tr><tr><td>Perfusiesysteem</td><td>Warner Instruments</td><td>VC-6 Perfusie MM-6</td><td></td></tr><tr><td>Digitaliseerder</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1320 digitaliseersysteem</td><td></td></tr><tr><td>Manipulatoren</td><td>Sutter Instruments</td><td>Manipulator: MP-85</td><td></td></tr><tr><td>Elektrode-puller</td><td>Narishige</td><td>PC10 verticale elektrode-uittrekker</td><td></td></tr><tr><td>Isolatietabel</td><td>Technical Manufacturing Corporation</td><td>Luchttafel</td><td></td></tr></tbody></table>

mutagenese en functionele analyse van ionenkanalen heteroloog uitgedrukt in zoogdiercellen

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We zullen laten zien hoe je de functionele effecten van de invoering van een punt mutatie in een ionkanaal studie. Bestuderen we G-eiwit-gated innerlijk rectificeren kalium (hierna GIRK) kanalen, die belangrijk zijn voor het reguleren van de prikkelbaarheid van neuronen. Er zijn vier verschillende zoogdieren GIRK kanaal subeenheden (GIRK1-GIRK4) - richten we ons op GIRK2 want het vormt een homotetramer. Stimulatie van verschillende types van G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR&#39;s), zoals de muscarine receptor (M2R), leidt tot activatie van GIRK kanalen. Alcohol ook direct activeert GIRK kanalen. We zullen laten zien hoe je een aminozuur muteren door specifiek te veranderen van een of meer nucleotiden in het cDNA voor de GIRK kanaal. Deze gemuteerde cDNA-sequentie zal versterkt worden in bacteriën, gezuiverd, en de aanwezigheid van de puntmutatie wordt bevestigd door DNA-sequencing. De cDNA voor het gemuteerde en wild-type GIRK kanalen worden getransfecteerd in humane embryonale nier HEK293T cellen gekweekt in vitro. Ten slotte zal whole-cell patch-clamp elektrofysiologie gebruikt worden om de macroscopische kalium stromen studie door het ectopisch uitgedrukt wild-type of gemuteerde GIRK kanalen. In dit experiment zullen we onderzoeken het effect van een L257W mutatie in GIRK2 kanalen op M2R-afhankelijke en alcohol-afhankelijke activering.

We zullen zien hoe het effect van een enkele puntmutatie op de functie van een ionkanaal studie.

Mutagenese en Functionele analyse van ionenkanalen heteroloog Uitgedrukt in zoogdiercellen

We zullen demonstreren hoe de functionele effecten van het introduceren van een puntmutatie in een ionkanaal kunnen worden bestudeerd. We bestuderen G-proteïne-gestuurde, naar binnen gelijkrichtende ...

G-eiwitgekoppelde inwaarts gelijkrichtende kaliumkanalen of GIRK zijn belangrijk voor het reguleren van de exciteerbaarheid van neuronen. GIRK kunnen worden geactiveerd door zowel G-eiwitgekoppelde receptoren (GPCR's), zoals de muscarinereceptor M2R, als door alcohol. Om de effecten van mutaties in de alcoholbindingsplaats van GIRK te bestuderen, wordt bij activatie een enkele puntmutatie in het GIRK-cDNA geïntroduceerd via site-directed mutagenese. Gezuiverde GIRK-constructen worden, samen met YFP-constructen, getransfecteerd in zoogdiercellen, waarna de transfectie-efficiëntie wordt beoordeeld middels fluorescentie-imaging.Vervolgens wordt een whole-cell patchclamp-analyse uitgevoerd om de alcohol- en G-proteïne-afhankelijke activatie te vergelijken. Deze visuele experimentele demonstratie verschaft u essentiële informatie over het bestuderen van de functie van LY-kanalen. Vandaag kijken we naar de vraag hoe alcohol groepskanalen activeert.De hier getoonde techniek voor site-directed neogenese kan inzicht bieden in de functie van ionkanalen. Deze techniek kan ook worden toegepast op andere systemen waarbij bekend is dat een mutatie in een gen menselijke ziekten veroorzaakt. Dit is een demonstratie van de hot cell patch-techniek; deze is cruciaal omdat er veel stappen zijn die precisie, juiste elektronische compensatie en oefening vereisen om bruikbare gegevens te genereren.Het DNA dat voor transfectie in dit protocol wordt gebruikt, wordt als volgt klaargemaakt. Eerst wordt de GRK-subeenheid, DNA uit PCR, direct gekloond in de mammale expressievector. In plasmide PC DNA 3.1 worden puntmutaties geïntroduceerd met behulp van specifiek ontworpen primers in combinatie met de QuickChange XL II site-directed mutagenesis kit.Met behulp van dit systeem wordt er PCR uitgevoerd waarbij het gehele plasmide wordt gerepliceerd en puntmutaties, gecodeerd door de primers, worden geïntroduceerd. Na de PCR worden de gerepliceerde plasmiden behandeld met het restrictie-enzym Dpn I en vervolgens via hittestok getransformeerd in XL10-Gold ultra-competente E. coli. De getransformeerde bacteriën worden gekweekt op LB-agarplaten met ampicilline; bacteriën die het plasmide bevatten zijn resistent tegen ampicilline en zullen kolonies vormen.De geïsoleerde kolonies worden opgepikt en gekweekt in miniculturen. Er worden minipreps uitgevoerd om het plasmid-DNA te isoleren. Vervolgens wordt het DNA gesequenced om de succesvol getransformeerde mutanten te identificeren.E coli worden in een grotere batch gekweekt en er worden maxi-preps uitgevoerd om grotere hoeveelheden plasmid DNA te verkrijgen. Plateer ongeveer 1 × 10⁵ HEK 293T-cellen in elk van de twee wells op een 12-wells plaat, één voor de mutant en één voor de controle (wildtype kanaal). Incubeer bij 37 °C.Na acht tot 24 uur zullen de cellen aan hun substraat hechten en zijn ze klaar voor transfectie. Transfecteer de cellen met lipo 2000 volgens de instructies van de fabrikant met 0,2 micrograms channel CDNA, 0,4 micrograms M two R receptor CDNA en 0,04 micrograms Y-F-P-C-D-N-A. Om succesvol getransfecteerde cellen te identificeren, moeten de cellen 24 uur worden geïncubeerd.Nadat de gewenste incubatietijd is verstreken, plaatst u de cellen op de tafel van een inverted fluorescentiemicroscoop om de transfectie-efficiëntie te bepalen. Vergelijk de fluorescentie- en DIC-beelden om het percentage getransfecteerde cellen vast te stellen. Plaats de kweekschaal vervolgens terug in de incubator.Reinig glazen dekglasjes van 12 millimeter en bewaar deze in ethanol tot gebruik. Verwijder de resterende ethanol door ze kort in een vlam te houden in de steriele kast. Plaats de dekglasjes in een 24-wells plaat en coat deze met 0,2 milligram per milliliter.Trypsiniseer 24 uur na transfectie de cellen op poly-D-lysine en zaai ze uit met een dichtheid van 4 × 10³ cellen per putje. Incubeer de cellen in vier tot acht putjes van een 24-wells schaal met poly-D-lysine gecoate glazen dekglasjes gedurende nog eens 24 tot 48 uur voordat de whole-cell patch clamp wordt uitgevoerd. Bereid patchelektroden met een twee-staps verticale puller en borosilicaatglas.Idealiter heeft de voltooide elektrode een weerstand van drie tot zeven megaohm en is er geen verdere bewerking, zoals hittepolijsten, nodig. Plaats voor patch clamping een dekglas met getransfecteerde cellen in een schaal van 35 millimeter met een externe oplossing van 20 millimolar kalium of 20 K. Plaats de schaal op de tafel van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop.De hier gebruikte patchclamp-opstelling maakt gebruik van een perfusiesysteem. Dit systeem bevat de extracellulaire oplossingen die op de cellen worden aangebracht, welke via slangen naar een manifold worden geleid door middel van zwaartekrachtvoeding. Elke oplossing wordt op afstand aangestuurd met een solenoid-knijpklep.Gebruik DIC om scherp te stellen en cellen te vinden. Schakel over naar het YFP-filter om de YFP-positieve cellen te lokaliseren. Zodra de YFP-positieve cellen zijn geïdentificeerd, positioneert u de tip van het perfusiesysteem, neuro fluorescente cel, op 20 tot 30 micron of twee tot drie cellengtes afstand.Vul een elektrode met interne elektrodensolution. Tik met een spuit en een flexibele naald voorzichtig tegen de gevulde elektrode om luchtbellen uit de tip te verwijderen. Bevestig de elektroden aan de head stage van een AXO patch 200 B versterker.Controleer opnieuw of de instellingen op de versterker overeenkomen met één configuratie. De whole cell-schakelaar staat op bèta equals een, en het laagdoorlaatfilter van het vat is ingesteld op 10 kilohertz. Breng met de spuit positieve druk aan en gebruik de klem om de elektrodepunt schoon te houden.Gebruik vervolgens een micromanipulator om de punt van de elektrode in het bad te plaatsen en verplaats deze naar een positie boven de cel. Zet de versterker in de V track-modus en de meterknop op V track. Gebruik vervolgens de pipette offset potential-meter op de versterker om het pipetpotentiaal te nulstellen door de spanning op het display van de versterker op 0,00 te brengen.Schakel alternatief over naar de V-clamp-modus op de versterker en selecteer de testpulse-knop om een testspanningsstap toe te dienen. De rechthoekige spanningsstap verschijnt in het seal-testvenster van de clamp. Pas de pipet-offset op de versterker aan om de basislijnstroom naar nul nanoampère te brengen.De afdichtingstest geeft de elektroderesistentie weer, die drie tot zeven megaohm moet zijn. Sluit vervolgens het venster van de afdichtingstest. Selecteer 'acquire open protocol' in het vervolgkeuzemenu.Select vervolgens een opgeslagen spanningsprotocol. In dit geval is het geselecteerde protocol vooraf geprogrammeerd om een enkele spanningsstap naar min 100 millivolt te leveren en elke twee seconden op te lopen naar plus 40 millivolt. Dit ramp-protocol maakt het mogelijk om het omkeerpotentiaal en de eigenschap van binnenwaartse rectificatie van GK-kanalen waar te nemen.Voor spanningsgestuurde ionkanalen kan een rechthoekige spanningsstap geschikter zijn. Gebruik de fijne instelling van de micromanipulator om de cel te naderen, laat de positieve druk los en breng, nadat het celoppervlak is geraakt, een lichte negatieve druk toe. Monitor de resulterende toename in weerstand in de seal-test. Zodra de weerstand in het gigaohm-bereik ligt, is de elektrode verzegeld op het membraan.Dit wordt een giga-seal genoemd. Gebruik een spuit om een puls negatieve druk toe te passen om het membraan te doorbreken en toegang tot de cel te verkrijgen. Zodra de whole-cell configuratie is bereikt, zal de seal-test grote capacitieve stromen registreren die zichtbaar zijn als spikes of transiënten aan het begin en einde van de test.Pulse in seal test. Klik vervolgens op de knop voor de membraantest. Registreer in klem X de toegangsweerstand en de membraanweerstand.Een membraancapaciteit in een notitieblok om de exponentiële fit visueel te verifiëren. De membraancapaciteit is proportioneel aan de celgrootte en zal worden gebruikt om de stroomdichtheid te berekenen. De toegangsweerstand en membraanweerstand worden gebruikt om te evalueren of de registratie voldoende zal zijn om door te gaan.Een goede opname kenmerkt zich door een lage toegangsweerstand. Sluit nu het venster voor de membraantest en klik opnieuw op de knop voor de sealtest; stel in het venster voor de sealtest de V-out in op minus 40 millivolt om te compenseren voor de membraancapaciteit en de serieweerstand op de versterker, schakel de whole cell cap in, en stel de whole cell cap en serieweerstand bij totdat de transient is geminimaliseerd en de stroom een vlakke lijn vormt. Pas indien nodig de pipetcapaciteit aan met de fast cap-knop op de versterker.Te veel of te weinig compensatie zal leiden tot een resterende capaciteitstransiënt. Draai vervolgens de knop voor de voorspellingspercentage naar 60 tot 80% en pas de hele cel-capaciteit, de serieweerstand en de snelle capaciteit naar behoefte aan om een vlakke lijn in de sealtest te verkrijgen. Draai tot slot de compensatiepercentage naar ongeveer 100% zonder dat de cel gaat oscilleren, terwijl u probeert de puls zo lineair mogelijk te houden door de potentiometers van de hele cel-capaciteit, de serieweerstand en de snelle capaciteit opnieuw af te stellen.Zodra de compensatie van de weerstand en capaciteit is voltooid, noteert u de ingestelde waarden voor de serieweerstand van de versterker-capaciteit in procenten, het compensatiepercentage, de voorspelling en de vertragingstijd in een logboek en opent u het externe oplossingsventiel voor de 20 K badoplossing van de controle. Stel het laagdoorlaatfilter van het vat op de versterker in op 2 kHz. Start vervolgens de registratie van de stromen door op de opnameknop in de software te klikken.Let op de inward rectificatie-eigenschap van de ger-stroom. Dit is zichtbaar als een grote binnenwaartse stroom bij een potentiaal negatiever dan de kalium-omkeerpotentiaal die wordt bepaald door de Nernst-vergelijking EK, en een kleine buitenwaartse stroom bij een potentiaal positiever dan ek. Bepaal na het registreren van een stabiele baseline de receptor-gemedieerde activatie van stromen door extracellulaire oplossing 20 k plus carbachol toe te dienen.Zodra de piekactivatie is waargenomen en de stroom een stabiele toestand bereikt, wordt teruggeschakeld naar de K-badoplossing en wordt gewacht tot het basisstroomniveau is bereikt. Schakel vervolgens over naar externe oplossing 20 k plus 100 millimolar ethanol om de alcoholactivatie van gert-stromen te bestuderen en wacht op de piekrespons.Schakel vervolgens terug naar de 20 K badoplossing en wacht tot het basisstroomniveau is bereikt. Schakel ten slotte over naar de 20 K plus 20 K bariumoplossing om de basale gert-stroom te bepalen en wacht op de respons. De inhibitie van de gerk-stroom moet duidelijk zichtbaar zijn, waarbij deze gedurende de procedure het meest uitgesproken is bij minus 100 millivolts.Noteer het nummer van de trace-sweep dat correspondeert met de toevoeging van verschillende extracellulaire oplossingen. Eén enkel clamp fit-bestand bevat alle sweeps van de gehele experimenten. Gebruik de clamp FIT 8.2-software om GK-gegevens te analyseren.Volgens de instructies in het bijbehorende geschreven protocol werden twee verschillende whole-cell opnames gemaakt van HEC 2 9 3 T-cellen die respectievelijk wild-type of mutante GK-kanalen tot expressie brachten, en geanalyseerd volgens de instructies in deze video, zoals hier getoond voor wild-type GK2. Het paneel aan de linkerzijde bevat een venster met verschillende over elkaar heen gelegde stromingen die werden opgewekt door het voltage-ramp-protocol in aanwezigheid van verschillende oplossingen. Let op de inwaartse rectificatie.Dat is de grotere binnenwaartse stroom bij min 100 millivolt rond 50 milliseconden op het stroomspoor. De kleine uitwaartse stroom tussen nul en plus 40 millivolt rond 200 tot 260 milliseconden op het stroomspoor is afkomstig van een endogeen voltage-gestuurd kaliumkanaal. Het is niet de Gert-stroomcursor.Eén cursor wordt geplaatst op de maximale binnenwaartse stroom en de cursorwaarden worden in het spreadsheet genoteerd. In het spreadsheet zijn het sporenummer en de stroom bij -100 millivolt zichtbaar.De gegevens omvatten de basale stroom, door carbachol geïnduceerde en door alcohol opgewekte stromen, evenals een door barium geremde stroom. Evenzo de voltage ramp-stromen in de aanwezigheid van verschillende oplossingen. Voor het mutante kanaal L 2 57 w worden 20 k plus 100 millimol ethanol of 20 k plus vijf millimol carbachol of 20 k plus barium getoond.Let op de significant kleinere stromen die door alcohol en carbo-alcohol worden geïnduceerd. Deze bevindingen suggereren dat dit residu een belangrijke rol speelt bij de gating van GK-kanalen door alcohol en g beta gamma-subunits. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u een mutatie in een gen kunt construeren en hoe u het effect daarvan op de kanaalfunctie kunt bestuderen met behulp van geavanceerde elektrofysiologische technieken.Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze op site-gerichte neogenese gebaseerde methode in twee tot drie dagen worden uitgevoerd en worden uitgebreid naar vijf of meer mutaties. De ontwikkeling van deze technieken maakte het voor biofysici van ionkanalen mogelijk om fundamentele eigenschappen van de werking en gating van ionkanalen te onderzoeken. Daarnaast stellen ze onderzoekers in staat om menselijke ziekten te bestuderen die worden veroorzaakt door een enkele mutatie in een ionkanaalgen.

mutagenesis-functional-analysis-ion-channels-heterologously-expressed

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Geoptimaliseerd transfectie strategie voor Expressie en elektrofysiologische opname van recombinant voltage-gated ion kanalen in HEK-293T cellen

Procedures voor volledige reconstructie van een prototype voltage-gated kalium kanaal in lipide membranen beschreven. De gereconstitueerde kanalen zijn geschikt voor biochemische assays, elektrische opnamen ligand screening en elektronenmicroscopie kristallografische studies. Deze methoden kunnen hebben algemene toepassingen om de structurele en functionele studies van andere membraaneiwitten.

Reconstructie van een Kv kanaal in Lipid Membranen voor structurele en functionele studies

Hier beschreven is een procedure voor het verkrijgen van lange stukken huidige opname van een ionkanaal met de cel-bijgevoegde patch-clamp techniek. Deze methode maakt het mogelijk voor het observeren, in real time, het patroon van open-close kanaal conformaties dat de biologische signaal ten grondslag liggen. Deze gegevens informeren over kanaal woningen in ongestoord biologische membranen.

Eenkanaals-Cell bevestigd Patch-clamp-opname

Hier beschreven is een snelle en efficiënte procedure voor de functionele reconstitutie van gezuiverde wildtype en mutante CFTR-eiwit dat activiteit behoudt deze chloride kanaal, die defect in Cystic Fibrosis. Jodide efflux uit opgelost proteoliposomen gemedieerd door CFTR maakt studies van het kanaal en de effecten van kleine moleculen.

Functionele Het oplossen en Channel activiteit Metingen van gezuiverde wildtype en mutante CFTR eiwit

Het eerste deel van dit artikel laat zien hoe mutante cellijnen te selecteren zijn die vesiculaire Na+/H+ uitwisselaars in hun plasmamembraan tot expressie brengen. Het tweede deel biedt protocollen gebaseerd op intracellulaire pH-metingen en snelle ionopname, die worden gebruikt om de ionselectiviteit en de kinetische parameters van deze uitwisselaars te bepalen.

Functionele karakterisatie van Na<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; Warmtewisselaars van intracellulaire compartimenten met Proton-doden Selectie om ze te uiten op het plasmamembraan

Erfelijke hartritmestoornissen worden vaak veroorzaakt door mutaties die de oppervlakte levering van één of meer ionkanalen wijzigen. Hier passen we flowcytometrie assays een kwantificering van de relatieve totale en celoppervlak-eiwit expressie van recombinant ionenkanalen tot expressie gebracht in TSA-201 cellen.

Bepaling van de Relatieve celoppervlak en Total Expressie van recombinant Ion kanalen met flowcytometrie

Het bestuderen van ionkanalen via een heteroloog tot expressie brengen systeem is uitgegroeid tot een kern techniek in het biomedisch onderzoek. In dit manuscript presenteren we een tijd efficiënte methode om strak ionkanaal expressie te komen door het uitvoeren transiënte transfectie onder controle van een induceerbare promoter.

Controleerbaar Ion Channel Expression door middel Induceerbare tijdelijke transfectie

De zuivering van ionenkanalen is vaak uitdagend, maar eenmaal bereikt, kan het potentieel toestaan in vitro onderzoeken van de functies en structuren van de kanalen. Hier beschrijven we de stapsgewijze procedures voor de expressie en de zuivering van eiwitten van zoogdieren bestrophin, een familie van Ca2 +-geactiveerd Cl- -kanalen.

Meningsuiting en zuivering van zoogdier Bestrophin ionenkanalen

Dit protocol beschrijft technieken gebruikt om te bepalen van ion kanaal structuren door cryo-elektronenmicroscopie, met inbegrip van een systeem van de baculovirus gebruikt om genen in zoogdiercellen met minimale inspanning en toxiciteit, eiwit winning, zuivering, efficiënt en kwaliteit controleren, Raster monstervoorbereiding en screening, evenals gegevensverzameling en verwerking.

Meningsuiting en zuivering van de TRPC3 mens lipide-gevoelige catie kanaal voor structurele bepaling door Single-deeltje Cryo-elektronenmicroscopie

Dit protocol beschrijft een methode voor de studie van elektrogene membraaneiwitten door het meten van veranderingen in membraanpotentiaal. Deze test biedt een platform voor de functionele uitlezing van meerdere ionkanalen endogeen uitgedrukt in epitheelcellijnen.

Een op fluorescentie gebaseerde test van membraanpotentiaal voor functionele studie met hoge doorvoer van twee endogene ionkanalen in twee epitheelcellijnen

De farmacologische targeting van ionkanalen is een veelbelovende benadering voor de behandeling van solide tumoren. Gedetailleerde protocollen worden verstrekt voor het karakteriseren van ionkanaalfunctie in kankercellen en het testen van de effecten van ionkanaalmodulatoren op de levensvatbaarheid van kanker.

Screening van ionkanalen in kankercellen

Leer hoe je site-directed mutagenese en patch clamp analyse gebruikt om de functie van GRK-ionenkanalen in zoogdiercellen te onderzoeken. Deze methode helpt onderzoekers mutatie-effecten op kanaalactivatie te bestuderen.

Mutagenese en Functionele analyse van ionenkanalen heteroloog Uitgedrukt in zoogdiercellen

Meer video's verkennen