Name: Strategieën voor de Studie van de neuronen van Cold-preconditionering (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-02T17:30:00.000+00:00
Duration: 16 min 27 s
Description: Leer hoe koude-preconditionering neuroprotectie induceert in rattenhippocampus-sliceculturen via pro-inflammatoire cytokinesignalering. Deze methode identificeert therapeutische doelen voor neurologische bescherming.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door subsidies van het Nationaal Instituut voor Neurologische Aandoeningen en Stroke (NS-19108), de Migraine Research Foundation, en de White Stichting Richard P. Kraig. Mw. Marcia P. Kraig geholpen bij de voorbereiding van cultuur media en het onderhoud van de slice culturen. Wij danken Yelena Grinberg voor haar opmerkingen en revisies over een definitieve versie van dit artikel.

<ol><li>Aptowicz, C. O., Kunkler, P. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic+plasticity+in+hippocampal+slice+cultures+involves+changes+in+voltage-gated+Na%2B+channel+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Homeostatic plasticity in hippocampal slice cultures involves changes in voltage-gated Na+ channel expression.</a> Brain Res. 998, 155-163 (2004).</li>
<li>Beattie, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+synaptic+strength+by+glial+TNFalpha%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of synaptic strength by glial TNFalpha.</a> Science. 295, 2282-2285 (2002).</li>
<li>Breder, C. D., Dewitt, D., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+inducible+cyclooxygenase+in+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Characterization of inducible cyclooxygenase in rat brain.</a> J Comp Neurol. 355, 296-315 (1995).</li>
<li>Caggiano, A. O., Breder, C. D., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+elevation+of+cyclooxygenase-2%2C+but+not+lipoxygenase%2C+in+regions+synaptically+distant+from+spreading+depression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Long-term elevation of cyclooxygenase-2, but not lipoxygenase, in regions synaptically distant from spreading depression.</a> J Comp Neurol. 376, 447-462 (1996).</li>
<li>Caggiano, A. O., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eicosanoids+and+nitric+oxide+influence+induction+of+reactive+gliosis+from+spreading+depression+in+microglia+but+not+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Eicosanoids and nitric oxide influence induction of reactive gliosis from spreading depression in microglia but not astrocytes.</a> J Comp Neurol. 369, 93-108 (1996).</li>
<li>Caggiano, A. O., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandin+E2+and+4-aminopyridine+prevent+the+lipopolysaccharide-induced+outwardly+rectifying+potassium+current+and+interleukin-1beta+production+in+cultured+rat+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Prostaglandin E2 and 4-aminopyridine prevent the lipopolysaccharide-induced outwardly rectifying potassium current and interleukin-1beta production in cultured rat microglia.</a> J Neurochem. 70, 2357-2368 (1998).</li>
<li>Caggiano, A. O., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandin+E+receptor+subtypes+in+cultured+rat+microglia+and+their+role+in+reducing+lipopolysaccharide-induced+interleukin-1beta+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Prostaglandin E receptor subtypes in cultured rat microglia and their role in reducing lipopolysaccharide-induced interleukin-1beta production.</a> J Neurochem. 72, 565-575 (1999).</li>
<li>Calabrese, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+therapies+for+stroke+and+traumatic+brain+injury+often+display+U-shaped+dose+responses%3A+occurrence%2C+mechanisms%2C+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Drug therapies for stroke and traumatic brain injury often display U-shaped dose responses: occurrence, mechanisms, and clinical implications.</a> Crit Rev Toxicol. 38, 557-577 (2008).</li>
<li>Calabrese, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+stress+response+terminology%3A+Integrating+the+concepts+of+adaptive+response+and+preconditioning+stress+within+a+hormetic+dose-response+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Appl+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Biological stress response terminology: Integrating the concepts of adaptive response and preconditioning stress within a hormetic dose-response framework.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 222, 122-128 (2007).</li>
<li>Calabrese, E. J., Baldwin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormesis%3A+the+dose-response+revolution%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Hormesis: the dose-response revolution.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 43, 175-197 (2003).</li>
<li>Hansel, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+CD4%2B+T-cell+gene+expression+in+allergic+subjects+using+two+different+microarray+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%22%5BJournal%5D)">Analysis of CD4+ T-cell gene expression in allergic subjects using two different microarray platforms.</a> Allergy. 63, 366-369 (2008).</li>
<li>Hulse, R. E., Kunkler, P. E., Fedynyshyn, J. P., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+multiplexed+bead-based+cytokine+immunoassays+for+rat+serum+and+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of multiplexed bead-based cytokine immunoassays for rat serum and brain tissue.</a> J Neurosci Methods. 136, 87-98 (2004).</li>
<li>Hulse, R. E., Swenson, W. G., Kunkler, P. E., White, D. M., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monomeric+IgG+is+neuroprotective+via+enhancing+microglial+recycling+endocytosis+and+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Monomeric IgG is neuroprotective via enhancing microglial recycling endocytosis and TNF-alpha.</a> J Neurosci. 28, 12199-12211 (2008).</li>
<li>Hulse, R. E., Winterfield, J., Kunkler, P. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+clasmatodendrosis+in+hippocampal+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Astrocytic clasmatodendrosis in hippocampal organ culture.</a> Glia. 33, 169-179 (2001).</li>
<li>Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-alpha+and+Microglial+Hormetic+Involvement+in+Neurological+Health+and+Migraine%5BTitle%5D)+AND+%22International+Dose-Respose+Society%22%5BJournal%5D)">TNF-alpha and Microglial Hormetic Involvement in Neurological Health and Migraine.</a> International Dose-Respose Society. , (2010).</li>
<li>Kunkler, P. E., Hulse, R. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+cytokine+protein+expression+profiles+from+spreading+depression+in+hippocampal+organotypic+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Multiplexed cytokine protein expression profiles from spreading depression in hippocampal organotypic cultures.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 24, 829-839 (2004).</li>
<li>Kunkler, P. E., Hulse, R. E., Schmitt, M. W., Nicholson, C., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+current+source+density+analysis+in+hippocampal+organotypic+culture+shows+that+spreading+depression+occurs+with+uniquely+reversing+currents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optical current source density analysis in hippocampal organotypic culture shows that spreading depression occurs with uniquely reversing currents.</a> J Neurosci. 25, 3952-3961 (2005).</li>
<li>Kunkler, P. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+astrocytosis+from+excitotoxic+injury+in+hippocampal+organ+culture+parallels+that+seen+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Reactive astrocytosis from excitotoxic injury in hippocampal organ culture parallels that seen in vivo.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 17, 26-43 (1997).</li>
<li>Kunkler, P. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+waves+precede+electrophysiological+changes+of+spreading+depression+in+hippocampal+organ+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Calcium waves precede electrophysiological changes of spreading depression in hippocampal organ cultures.</a> J Neurosci. 18, 3416-3425 (1998).</li>
<li>Kunkler, P. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P%2FQ+Ca2%2B+channel+blockade+stops+spreading+depression+and+related+pyramidal+neuronal+Ca2%2B+rise+in+hippocampal+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">P/Q Ca2+ channel blockade stops spreading depression and related pyramidal neuronal Ca2+ rise in hippocampal organ culture.</a> Hippocampus. 14, 356-367 (2004).</li>
<li>Lambertsen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+protect+neurons+against+ischemia+by+synthesis+of+tumor+necrosis+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia protect neurons against ischemia by synthesis of tumor necrosis factor.</a> J Neurosci. 29, 1319-1330 (2009).</li>
<li>Lee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulator+of+G-protein+signaling+10+promotes+dopaminergic+neuron+survival+via+regulation+of+the+microglial+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulator of G-protein signaling 10 promotes dopaminergic neuron survival via regulation of the microglial inflammatory response.</a> J Neurosci. 28, 8517-8528 (2008).</li>
<li>Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormesis+and+disease+resistance%3A+activation+of+cellular+stress+response+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Exp+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Hormesis and disease resistance: activation of cellular stress response pathways.</a> Hum Exp Toxicol. 27, 155-162 (2008).</li>
<li>Ning, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+simultaneous+gene+profiling+of+84+drug-metabolizing+genes+in+primary+human+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Systematic and simultaneous gene profiling of 84 drug-metabolizing genes in primary human hepatocytes.</a> J Biomol Screen. 13, 194-201 (2008).</li>
<li>Oppenheim, J., Feldman, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOppenheim%2C+J+%22in+Cytokine+Reference%22">in Cytokine Reference</a>. Oppenheim, J. J., Feldman, M. 1, Academic. New York. (2001).</li>
<li>Pfaffl, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 29, e45-e45 (2001).</li>
<li>Stellwagen, D., Beattie, E. C., Seo, J. Y., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+AMPA+receptor+and+GABA+receptor+trafficking+by+tumor+necrosis+factor-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of AMPA receptor and GABA receptor trafficking by tumor necrosis factor-alpha.</a> J Neurosci. 25, 3219-3228 (2005).</li>
<li>Stellwagen, D., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+scaling+mediated+by+glial+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synaptic scaling mediated by glial TNF-alpha.</a> Nature. 440, 1054-1059 (2006).</li>
<li>Streit, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+as+neuroprotective%2C+immunocompetent+cells+of+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Microglia as neuroprotective, immunocompetent cells of the CNS.</a> Glia. 40, 133-139 (2002).</li>
<li>Wilde, G. J., Pringle, A. K., Sundstrom, L. E., Mann, D. A., Iannotti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+and+augmentation+of+ischaemia-related+neuronal+death+by+tumour+necrosis+factor-alpha+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Attenuation and augmentation of ischaemia-related neuronal death by tumour necrosis factor-alpha in vitro.</a> Eur J Neurosci. 12, 3863-3870 (2000).</li>
</ol>

Twee fundamenteel belangrijke concepten belangrijk voor afbakening van de cytokine signaalsysteem betrokken bij koude-preconditionering neuroprotectie worden geïllustreerd in de figuren 6 en 7. Ten eerste, cytokines zijn extreem lage concentratie signaalmoleculen in de normale hersenen. Toch, fysiologische cytokine concentratie veranderingen hebben een enorm potentieel om de hersenen structuur en functie (dat wil zeggen, fenotype) te veranderen omwille van hun vermogen om expressie van genen te veranderen (figuur 6). Bovendien, cytokines zijn zeer redundant en pleiotropische in dat meerdere cytokinen kunnen hebben vergelijkbare effecten hebben en een cytokine verschillende effecten kan hebben (figuur 7). Dus, om nauwkeurig vast te stellen van de aangeboren cytokine-bases voor neuroprotectie van koud-conditionering (of andere fysiologische stimuli conditionering), samengestelde analyse van gerelateerde signalering variabelen moet worden bepaald. Dit wordt bereikt via een multiplex assay strategieën. Dit zal zorgen voor de cytokine "handtekening" van de koude-preconditionering neuroprotectie. <img src="/files/ftp_upload/2192/2192fig6.jpg" alt="Figuur 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 6"> Figuur 6. Vermogen van de hersenen cytokine signaaltransductie. De illustraties brengen de immense signalering kracht van fysiologische concentraties van de hersenen cytokines in vergelijking met de concentraties van andere goed-erkende collega's. Concentratie is voorgesteld als de inverse van de afstand, te beginnen met een enkele kat snorhaar als referentiepunt. Natrium (10 -1 M geïllustreerd door een korreltje peper) en kalium (10 ~ 3 M geïllustreerd door een tomaat) zijn aanwezig in de interstitiële ruimte hersenen op een niveau van rond de 150 en 3 mM, respectievelijk, en hebben goed herkend rollen in neurale cel elektrofysiologische functie. Op dezelfde manier, pH (dat wil zeggen, ~ 10 -7 M niveaus van waterstof-ionen en geïllustreerd als 780 meter langs de oevers van het meer van Chicago) en calcium (dat wil zeggen, ~ 10 -8 M niveaus weergegeven als 7.8 km gezien vanuit een satelliet Google afbeelding langs de oevers van het meer Chicago's van McCormick Place to Promontory Point in Hyde Park in de buurt van de universiteit van Chicago). Daarnaast, neurotransmitters vrijgegeven aan interstitiële ruimte over deze concentraties van invloed op de lokale hersengebied activiteit. In tegenstelling, kunnen cytokines (weergegeven als de afstand vanaf de aarde naar Mars) te veranderen functioneren van de hersenen bij concentraties meer dan tien miljoen keer minder. <img src="/files/ftp_upload/2192/2192fig7.jpg" alt="Figuur 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 7"> Figuur 7. Interactieve signalering van aangeboren cytokine paden. Cytokines zijn zeer redundant en pleiotropische in dat meerdere cytokinen kunnen hebben vergelijkbare effecten hebben en een cytokine verschillende effecten kan hebben. Dergelijke diversiteit komt voort uit complexe interactieve signaleren die zich voordoet op het niveau van de liganden, receptoren, en fosforeiwitten. Verder complexiteit komt voort uit het feit dat de hersenen bestaan ​​uit verschillende celtypen, met elk in staat van cel-specifieke aangeboren cytokine, receptor, en de daarmee samenhangende fosfo veranderingen. Voor illustratieve doeleinden hier worden alleen aangeboren cytokine signaalwegen (afgeleid van immuuncellen studies) getoond. Voor de eenvoud, is het brein getekend als een enkele cel (witte lijn) waarin de mogelijke interacties voor aangeboren cytokines (IL-1α en IL-1β (hier aangeduid als IL-1α / β), TNF-α, IL-6, IFN-γ en IL-10), receptoren (IL-1R1, TNFR1, IL-6/gp130, IFNγR, en IL-10R) en fosforeiwitten (dat wil zeggen, kinases ERK1 / 2, P38 (P38-MAPK) en JNK) en transcriptiefactoren (ATF-2, NFκB, en STAT3). Bijvoorbeeld, TNF-α signalen via TNFR1 tot JNK, p38-MAPK en ERK1 / 2, die genexpressie triggers via ATF-2. TNF-α verandert ook genexpressie rechtstreeks via NFκB activering. Samen activering van deze transcriptiefactoren roepen toegenomen (pijl) en afgenomen (stomp eind) expressie van cytokines en hun receptoren zoals aangegeven. Belangrijk is dat deze routes laten zien dat veranderingen in een cytokine (bijvoorbeeld TNF-α) invloed productie van andere (bv. IL-1β) cytokinen. Dus, om nauwkeurig vast te stellen van de cytokine-bases voor neuroprotectie van koud-conditionering samengestelde analyse van gerelateerde signalering variabelen moet worden bepaald. Dit zorgt voor de aangeboren cytokine "handtekening" van de koude-preconditionering. (Afbeelding werd samengesteld op basis van gegevens van referentie # 25).

Voorbereiding van de Slice Culturen <table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de Reagens / Equipment </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus / Modelnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Millicell-CM weefselkweek inserts (30 mm) </td><td> Thermo Fisher </td><td> PICM0-3050 </td><td></td></tr><tr><td> Basale Medium Eagle </td><td> Invitrogen </td><td> 21010 </td><td></td></tr><tr><td> Balanced Salt Solution Earle s </td><td> Sigma </td><td> E2888 </td><td></td></tr><tr><td> Paardenserum </td><td> Invitrogen </td><td> 26050-088 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Invitrogen </td><td> 35050 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamicine </td><td> Invitrogen </td><td> 15710-064 </td><td></td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Invitrogen </td><td> 15295 </td><td></td></tr><tr><td> D-glucose </td><td> Sigma </td><td> G8769 </td><td></td></tr><tr><td> BSL-1 zuurkast </td><td> Bakker </td><td></td><td></td></tr><tr><td> McIlwain weefsel chopper </td><td> Brinkmann </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Teflon schijven </td><td> Brinkmann </td><td> 023-49-310-1 </td><td></td></tr><tr><td> Spatel </td><td> Thermo Fisher </td><td> 14 tot 373-25A </td><td></td></tr><tr><td> Gebogen iris schaar </td><td> Fijn Science Tools </td><td> 14091-09 </td><td></td></tr><tr><td> Lange rechte schaar </td><td> Fijn Science Tools </td><td> 14002-14 </td><td></td></tr><tr><td> Lange pincet </td><td> Thermo Fisher </td><td> 13-812-40 </td><td></td></tr><tr><td> Schuine pincet </td><td> Fijn Science Tools </td><td> 11808-02 </td><td></td></tr><tr><td> Korte pincet </td><td> Thermo Fisher </td><td> 13-812-38 </td><td></td></tr><tr><td> # 5 Inox tang </td><td> Fijn Science Tools </td><td> 11254-20 </td><td></td></tr><tr><td> 2 Iris spatulae </td><td> Fijn Science Tools </td><td> 10094-13 </td><td></td></tr><tr><td> 150 x 15 mm petrischaaltjes </td><td> Thermo Fisher </td><td> 08-757-148 </td><td></td></tr><tr><td> 60 x 15 mm petrischaaltjes </td><td> Thermo Fisher </td><td> 08 tot 757-100B </td><td></td></tr><tr><td> Wild M8 stereomicroscoop </td><td> Wild Heerbrugg </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gey s balans zoutoplossing </td><td> Sigma </td><td> G9779 </td><td></td></tr><tr><td> Blak-Ray kortegolf Ultraviolet meten meter </td><td> UVP </td><td> J-225 </td><td></td></tr><tr><td> 6-well Falcon kweekschalen </td><td> Thermo Fisher </td><td> 08 tot 772-1B </td><td></td></tr><tr><td> Neurobasal </td><td> Invitrogen </td><td> 21103</td><td></td></tr><tr><td> B27 supplement </td><td> Invitrogen </td><td> 17504 </td><td></td></tr><tr><td> Gem21 Neuroplex </td><td> Gemini Bioproducts </td><td> 400-160-010 </td><td></td></tr><tr><td> Ascorbinezuur </td><td> Sigma </td><td> A4544 </td><td></td></tr><tr><td> CO 2 Analyzer </td><td> Bacharach </td><td> # 2820 </td><td></td></tr></tbody></table> Pre-screening voor Vitaliteit van Slice Culturen <table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de Reagens / Equipment </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus / Modelnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Sytox Green </td><td> Invitrogen </td><td> S7020 </td><td></td></tr><tr><td> DMIBRE omkeermicroscoop </td><td> Leica </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Cold-Voorconditionering <table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de Reagens / Equipment </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus / Modelnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> BSL-2 zuurkast </td><td> NuAire </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Excitotoxische Letsel <table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de Reagens / Equipment </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus / Modelnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> CoolSNAP fx CCD-camera </td><td> Lichttechniek </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fluoroscein </td><td> Invitrogen </td><td> F36915 </td><td></td></tr><tr><td> Metamorph software </td><td> Molecular Devices </td><td> v. 7.5.04 </td><td></td></tr><tr><td> 100 micrometer diep hemacytometer </td><td> Hausser Wetenschappelijke </td><td></td><td></td></tr><tr><td> N-methyl-D-aspartaat </td><td> Calbiochem </td><td> 454575 </td><td></td></tr><tr><td> SigmaStat software </td><td> Systat Software Inc </td><td> v. 3.5 </td><td></td></tr></tbody></table> Co-behandelingen toegepast met Cold-conditioneringsfase <table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de Reagens / Equipment </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus / Modelnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> sTNFR1 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 425-R1-050 </td><td></td></tr><tr><td> Bovine Serum Albumine </td><td> Sigma </td><td> A-4503 </td><td></td></tr></tbody></table> RNA isolatie <table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de Reagens / Equipment </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus / Modelnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> RNAl ater </td><td> Ambion </td><td> AM7021 </td><td></td></tr><tr><td> Micro RNeasy Kit </td><td> Qiagen </td><td> 74004 </td><td></td></tr><tr><td> β-mercapto-ethanol </td><td> Visser </td><td> 03446-100 </td><td></td></tr><tr><td> Diposable 1.5 RNAse-vrij Stamper </td><td> South Jersey Precision Tool en Mold, Inc </td><td> 749521-1590 </td><td></td></tr><tr><td> RNasin </td><td> Promega </td><td> N261A </td><td></td></tr><tr><td> Tris [hydroxymethyl] aminomethaan </td><td> Sigma </td><td> T3069 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA (ethyleendiaminetetraazijnzuur dinatriumzout hydraat </td><td> Sigma </td><td> # E7889 </td><td></td></tr></tbody></table> RNA Kwantificering <table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de Reagens / Equipment </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus / Modelnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> RiboGreen Assay </td><td> Invitrogen </td><td> R11491 </td><td></td></tr><tr><td> Gist tRNA </td><td> Invitrogen </td><td> 15401-011 </td><td></td></tr><tr><td> 1,5 mL centrifugebuisjes </td><td> USA Wetenschappelijke </td><td> 16155500 </td><td></td></tr><tr><td> 96-well fluorescerende testplaat </td><td> Nunc </td><td> DK-4000 </td><td></td></tr><tr><td> 96-well plaat tl-lezer </td><td> Tecan </td><td> Safire II </td><td></td></tr></tbody></table> Kwantitatieve PCR <table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de Reagens / Equipment </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus / Modelnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> iScript reverse transcriptie kit </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-8891 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green </td><td> Invitrogen </td><td> S7563 </td><td></td></tr><tr><td> Platinum Taq-polymerase </td><td> Invitrogen </td><td> RNA Ultrasense 11732-927 </td><td></td></tr><tr><td> ICycler thermocycler </td><td> Bio-Rad </td><td> ICycler optische module </td><td></td></tr><tr><td> ICycler-systeemsoftware </td><td> Bio-Rad </td><td> v. 3.1 </td><td></td></tr></tbody></table> Kwantitatieve PCR voor Microarrays <table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de Reagens / Equipment </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus / Modelnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> RNase Away </td><td> Moleculaire Bioproducts </td><td> # 7000 </td><td></td></tr><tr><td> RT 2 Eerste Strand Kit </td><td> SABiosciences </td><td> C-03 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green-gebaseerde PCR-mix </td><td> SABiosciences </td><td> PA-011 </td><td> Specifiek voor ICycler </td></tr><tr><td> RT 2 Profiler PCR Array </td><td> SABiosciences </td><td> Parn-011A </td><td></td></tr></tbody></table> Proteomics Assay <table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de Reagens / Equipment </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus/ Modelnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Cellysis kit </td><td> Bio-Rad </td><td> 171-304011 </td><td></td></tr><tr><td> Microcentrifuge </td><td> Fisher Scientific </td><td> Micro 7 </td><td></td></tr><tr><td> BSA eiwit voorraad </td><td> Bio-Rad </td><td> 500-0007 </td><td></td></tr><tr><td> BCA eiwit assay kit </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23225 </td><td></td></tr><tr><td> Immuno 96 microputjes platen </td><td> Nunc </td><td> 449824 </td><td></td></tr><tr><td> Afdichtband </td><td> Bio-Rad </td><td> 2239444 </td><td></td></tr><tr><td> 96-well plaat reader </td><td> Perkin Elmer </td><td> 1420-mulilabel tegen te gaan </td><td></td></tr><tr><td> Bioplex Rat TNF-α cytokine assay </td><td> Bio-Rad </td><td> X0000001T </td><td></td></tr></tbody></table> Immunokleuring <table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de Reagens / Equipment </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus / Modelnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> 16% Paraformaldehyde </td><td> Alfa Aesar </td><td> 43368 </td><td></td></tr><tr><td> Lysine </td><td> Sigma </td><td> L-6001 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumfosfaat </td><td> Fisher Scientific </td><td> S374-1 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumperjodaat </td><td> Sigma </td><td> S-1878 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumazide </td><td> Sigma </td><td> S-2002 </td><td></td></tr><tr><td> Waterstofperoxide (30%) </td><td> Sigma </td><td> H1009 </td><td></td></tr><tr><td> Geit serum </td><td> Colorado Serum Company </td><td> CS 0920 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma </td><td> T-8787 </td><td></td></tr><tr><td> Vlekken gerechten </td><td> Ted Pella, Inc </td><td> 14511 </td><td></td></tr><tr><td> Plaat Shaker </td><td> Lab-Line Instruments, Inc </td><td> 3520 </td><td></td></tr><tr><td> # 1 Filter Papers (185 mm) </td><td> Whatman papier </td><td> 1001-185 </td><td></td></tr><tr><td> 3,3-diaminobenzidine </td><td> Sigma </td><td> D8001 </td><td></td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxide </td><td> Sigma </td><td> D8418 </td><td></td></tr><tr><td> Ethanol </td><td> Pharmco-AAPER </td><td> 111000200 </td><td></td></tr><tr><td> Xyleen </td><td> Fisher Scientific </td><td> X3S-4 </td><td></td></tr><tr><td> Permount montage media </td><td> Fisher Scientific </td><td> SP15-100 </td><td></td></tr><tr><td> Cryostaat </td><td> Leica </td><td> cm 3 050 S </td><td></td></tr><tr><td> Tissue-Tek </td><td> Ted Pella, Inc </td><td> 27050 </td><td></td></tr><tr><td> Fine-tip kwast </td><td> Ted Pella </td><td> 11806 </td><td></td></tr><tr><td> PAP blokkeren pen </td><td> Ted Pella, Inc </td><td> 22309 </td><td></td></tr><tr><td> SFX-signaal versterker </td><td> Invitrogen </td><td> A31631 </td><td></td></tr><tr><td> ProLong Antifade </td><td> Invitrogen </td><td> P7481 </td><td></td></tr></tbody></table>

strategieën voor de studie van de neuronen van cold-preconditionering

Strategies for Study of Neuroprotection from Cold-preconditioning

Neurologisch letsel is een veel voorkomende oorzaak van morbiditeit en mortaliteit van algemene anesthesie en gerelateerde operatieve ingrepen die kunnen worden verlicht door de ontwikkeling van effectieve, eenvoudig te beheren en veilig preconditionering behandelingen. Wij streven ernaar om de neurale immuun signalering die verantwoordelijk zijn voor koude-preconditionering als middel om nieuwe targets voor geneesmiddelen ontwikkeling identificeren hersenen te beschermen voor letsel ontstaan ​​definiëren. Low-level pro-inflammatoire mediator signaleren veranderingen in de tijd van essentieel belang zijn voor koude-preconditionering neuroprotectie. Deze signalering is consistent met de basisprincipes van fysiologische conditionering hormese, die vereisen dat irriterende prikkels een drempel omvang te bereiken met voldoende tijd voor aanpassing aan de stimuli voor de bescherming zichtbaar worden. Dienovereenkomstig, afbakening van het immuunsysteem signalering betrokken is bij koud preconditionering neuroprotectie vereist dat biologische systemen en experimentele manipulaties plus technische capaciteiten zijn zeer reproduceerbaar en gevoelig. Onze aanpak is om de hippocampus slice culturen gebruiken als een in vitro model dat nauw weerspiegelt hun in vivo tegenhangers met multi-synaptische neurale netwerken beïnvloed door volwassen en latente macroglia / microglia. Dit gliale toestand is vooral belangrijk voor microglia, omdat zij de belangrijkste bron van cytokines, die werkzaam zijn in de femtomolar bereik. Ook slice culturen kan worden gehandhaafd in vitro een aantal weken, dat is voldoende tijd om het activeren van stimuli op te roepen en te evalueren adaptieve reacties. Ten slotte kan milieu-omstandigheden nauwkeurig worden gecontroleerd met behulp van slice culturen, zodat cytokine signalering van koude-conditionering kan worden gemeten, nagebootst, en gemoduleerd om de kritische knooppunt aspecten ontleden. Cytokine signaleringssysteem analyses vereisen het gebruik van gevoelige en reproduceerbare multiplexed technieken. We maken gebruik van kwantitatieve PCR voor het TNF-α voor het screenen op microglia activatie, gevolgd door kwantitatieve real-time qPCR reeks screening van weefsel-brede cytokine veranderingen te beoordelen. Dit laatste is een zeer gevoelige en reproduceerbare manier om meerdere cytokine systeem te meten signalering veranderingen tegelijk. Belangrijke veranderingen worden bevestigd met gerichte qPCR en dan eiwit detectie. We probe voor weefsel-gebaseerde cytokine eiwitten veranderingen met behulp van multiplex microsfeer flowcytometrische analyses met behulp van Luminex-technologie. Cel-specifieke cytokine productie wordt bepaald met dubbel-label immunohistochemie. Bij elkaar genomen, kan dit hersenweefsel de voorbereiding en de stijl van het gebruik, gekoppeld aan de voorgestelde onderzoeks-strategieën, worden een optimale aanpak voor het identificeren van potentiële doelwitten voor de ontwikkeling van nieuwe therapieën die kunnen nabootsen de voordelen van koude-preconditionering.

Wij streven ernaar om de neurale immuun signalering die verantwoordelijk zijn voor koude-preconditionering als middel om nieuwe targets voor geneesmiddelen ontwikkeling identificeren hersenen te beschermen voor letsel ontstaan ​​definiëren. We presenteren de strategieën voor een dergelijk werk dat biologische systemen, experimentele manipulaties plus technische capaciteiten die zeer reproduceerbare en gevoelige vereisen.

Strategieën voor de Studie van de neuronen van Cold-preconditionering

Neurologisch letsel is een veel voorkomende oorzaak van morbiditeit en mortaliteit bij algehele anesthesie en gerelateerde chirurgische procedures, wat verlicht zou kunnen worden door ...

Neurologisch letsel is een veelvoorkomende oorzaak van morbiditeit en mortaliteit bij algehele anesthesie. Het doel van het in deze video gepresenteerde werk is om het effect van koude-preconditionering op de neurale immuunsignalering bij ratten te onderzoeken, als middel om nieuwe therapeutische doelwitten te identificeren voor de bescherming van de hersenen vóór het ontstaan van letsel. Dit wordt bereikt door het produceren van gezonde en langlevende hippocampus-plakculturen van volwassen ratten.De culturen worden blootgesteld aan koude preconditionering om immuungebaseerde neuroprotectie op te wekken. Vervolgens wordt anci toxine toegevoegd en worden de coupes-culturen gefotografeerd. Beeldanalyse suggereert dat koude preconditionering leidt tot een dramatische vermindering van het niveau van selectief neuronaal verlies.Mijn naam is Richard Craig en dit is Heidi Mitchell. Wij zijn verbonden aan de afdeling Neurologie van de University of Chicago, en vandaag gaan we beschrijven hoe de slice culture-preparatie kan worden gebruikt om vragen te beantwoorden over neuroprotectie waarbij een laag niveau van pro-inflammatoire immuunsignalering dient als middel om de hersenen weerbaarder te maken tegen hersenziekten. Over het algemeen hebben personen die niet bekend zijn met deze procedure moeite met het waarborgen van de langetermijnlevensvatbaarheid en gezonde culturen die in staat zijn om een laag niveau van pro-inflammatoire signalering te vertonen.Heidi zal u nu een aantal procedures laten zien die we in het laboratorium gebruiken om deze hindernissen te overwinnen, zodat laag-niveau pro-inflammatoire signalering kan worden gemeten als middel om neuroprotectoren voor de hersenen te maken. De volgende experimenten moeten worden uitgevoerd met een schone laboratoriumjas en steriele handschoenen die over de mouwen van de laboratoriumjas zijn getrokken. Begin met het plaatsen van alle benodigdheden voor de procedure in een BSL 1 laminaire flowkast, waaronder een Mcilwaine weefselhakker met bijbehorende Teflon-inzetstukken, een scheermesje, chirurgische instrumenten en dissectiepetrischalen.De zuiveringskast moet zich bevinden in een volgens HIPAA gefilterde kweekruimte met positieve druk, waarbij de lucht ten minste 30 minuten voor aanvang van de experimenten is gezuiverd door zelfstandige luchtzuiveringsventilatoren met ultraviolet licht. Plaats een dissectie-koelplaat in de kast en verbind deze met een nabijgelegen waterbad in de cellencultuurkast. Plaats een milli cell-insert in elke well van een six Well-plaat en voeg 1,1 milliliters kweekmedium aan elke well toe.Plaats de tray in een incubator bij 36 °C, 5% koolstofdioxide en 95% luchtvochtigheid voor ten minste 20 minuten. Houd de rattenpups warm tot ze nodig zijn door ze onder een warmtelamp te plaatsen. Anestheseer de pup door deze in 100% koolstofdioxide te plaatsen. Zodra de pup is geanestheseerd, wordt deze in 100% ethanol gedompeld, waarna de pup wordt gedecapiteerd en het lichaam in één 100 mm Petri-schaal en de kop in een andere wordt geplaatst.Gebruik vervolgens gebogen irisscharen om de schedel te openen met een incisie in de middellijn, gevolgd door twee laterale sneden links en rechts achter de ogen. Gebruik geknikte pincetten om het bovenliggende schedeldak terug te pellen en een spatel om het brein uit te scheppen. Verwijder het brein door de nervus trigeminalis door te snijden met de spatel en plaats het brein in de onderste helft van een 60 millimeter Petrischaal met 10 milliliters steriele koude gaze gebalanceerde zoutoplossing aangevuld met glucose.Gebruik vervolgens een nummer vijf IOx-pincet onder een nummer twee iris-spatel om de hippocampi uit elke hemisfeer te dissekeren en plaats deze op een Teflon-schijf voor de McIlwain-chopper. Gebruik de spatel om het medium van het hersenweefsel weg te duwen en gebruik de chopper met een ingestelde sectiedikte van 350 tot 400 micrometers. Snijd de hippocampi loodrecht op hun lange as met een one milliliter perpet met een vlotte beweging.Spoel de vers gesneden plakjes van de Teflon-inzetten af in de bovenste helft van een Petri-schaal van 60 millimeter die koude gaze BSS bevat. Plaats de plakjes onder een stereomicroscoop en onderzoek deze. Identificeer alle plakjes die een intacte gyrus dentatus en een parametale cellaag hebben.Plaats vervolgens voorzichtig de drie grootste plakjes op een insert, waarbij in totaal 12 plakjes per pop worden voorbereid. Plaats de inserts in een six-well tray en incubeer deze elke drie tot vier dagen bij 36 °C. Vernieuw het groeimedium door het oude medium te vervangen door vers, warm medium.Plaats de cellen na zeven dagen terug in de incubator op 36 °C. Vervang het medium door 1,1 milliliters serumvrij aangevuld NeuroBasal-medium. Beoordeel op dag 18 de vitaliteit van de plakculturen.Begin met het plaatsen van 1,1 milliliters ox poel in zes-wells cultiefasjes. Plaats het schaaltje in de incubator om het op te warmen tot 36 degrees Celsius. Zet ondertussen een fluorescentie-lichtbron met een fitzy-filter voor de microscoop aan en laat deze ten minste 20 minuten opwarmen.Dit zorgt voor een uniforme lichtintensiteit. Plaats vervolgens met een pincet de inzetstukken voor plakculturen gedurende 10 minuten in het medium. Breng ze daarna weer over naar het SIM-vrije medium.Plaats de cultuurinsert op de objecttafel van de microscoop en markeer de oriëntatie om te screenen op onomkeerbare letsels aan de parametrale laag. Plaats de culturen op een aseptisch oppervlak van een omgekeerde microscoop bij een 5x vergroting, waarbij de plakjes in een oriëntatie worden gehouden die vergelijkbaar is met die welke bij de pre-screening is gebruikt.Schakel over naar de FIT CX-citatie-emissiekubus. Selecteer culturen die minder dan 30 cytx-positieve cellen in het ca-één gebied hebben voor koudepreconditionering. Breng 1,1 milliliters serumvrij medium aan in een zes-wells kweekschaal en plaats de schaal in een incubator van 30 °C met 5% koolstofdioxide en 95% luchtvochtigheid gedurende ten minste 20 minuten om het medium te equilibreren; begin nadat er 20 minuten zijn verstreken.Verwijder het equilibratiemedium uit de incubator. Verplaats de cultuurinserts met de coupes van het normale serumvrije medium naar het medium van 30 graden. Plaats ze vervolgens na de incubatie gedurende 90 minuten in de incubator van 30 graden.Plaats de slice-culturen terug in het normale serumvrije medium en incubeer deze 24 uur lang bij 36 graden. Begin de pre-screening voor experimenteel gebruik van de slice-culturen door de cultuurinserts gedurende 20 minuten over te brengen naar cyt-media. Terwijl de slices incuberen, schakelt u de ultravioletlamp en een CCD-camera in en laat u deze 20 minuten opwarmen.Indien nodig, gebruik de software om de CCD te wissen door deze gedurende 50 cycli aan licht bloot te stellen. Pipetteer vervolgens een oplossing van 10 µL fluoresceïne in 90 µL PBS op een hemocytometer met een diepte van 100 µm en plaats deze op de microscooptafel. Stel met behulp van de software de belichtingstijd zo in dat het dynamisch bereik 1000 van de 4.096 is.Plaats vervolgens de schaal met koud voorbehandelde plakculturen op de microscoop en maak afbeeldingen. Deze worden gebruikt om het achtergrondfluorescentieniveau te bepalen, dat vervolgens wordt afgetrokken van de fluorescentie die wordt uitgezonden door beschadigde plakken. Indien de koude voorbehandeling zelf schade heeft veroorzaakt, zullen er in de volgende stap cellen met een verhoogde fluorescentie zichtbaar zijn.Om het effect van ExoToxic letsel te onderzoeken, worden de inserts overgebracht naar serumvrij medium dat 20 tot 50 µM NMDA bevat en gedurende ten minste 20 minuten is voorverwarmd tot 36 °C. Incubeer gedurende 60 minuten bij 36 °C; NMDA imiteert de effecten van de neurotransmitter glutamaat. Spoel na de incubatie de NMDA van de inserts door elke insert drie keer in drie afzonderlijke schaaltjes van 60 mm te dippen.Elk bevat 10 milliliters neurobasaal medium, opgewarmd tot 36 graden Celsius. Gebruik niet meer dan drie inserts voor elke set wasschalen van 360 millimeter. Plaats de inserts na het wassen in een tray met vers medium en zet ze terug in de incubator van 36 graden.Kalibreer na 24 uur de camera opnieuw met een fluoresceïnestandaard zoals eerder beschreven. Plaats de culturen vervolgens gedurende 20 minuten in OX-medium voordat de beelden worden vastgelegd. Als de letselniveaus één dag na het letsel laag zijn, kan het experiment naar twee tot drie dagen worden verlengd indien nodig om het letsel te kwantificeren met Metamorph-software.Definieer een gebied van interesse rond de CA1-regio om de intensiteit van een geselecteerd letselgebied te meten. Kopieer en plak het gebied van interesse van het letselbeeld naar het achtergrondbeeld. Voer vervolgens de waarden van het letsel en de achtergrond in Excel in met behulp van statistische software.Kwantificeer de teller minus de achtergrond voor controle- en koudvoorbehandelde culturen en voer de passende statistische test uit om de schade in de experimentele groep te vergelijken met een controlegroep, die altijd bij elke experimentele run moet worden opgenomen. Deze afbeelding toont een typische kleuring van een rijpe hippocampus-snede-cultuur na 21 dagen in vitro cultuur. De in groen getoonde nieuwe end-labeling wordt gebruikt om de cytoarchitectuur van de hoofdneuronen te illustreren.Parametale neuronen zijn te zien in de gebieden ca one en ca three van de hippocampus, en dentate gyrus- of DG-neuronen zijn hier links zichtbaar. Het bij een hogere vergroting getoonde CA one-gebied illustreert de vertakte aard van quiescente microglia. Binnen volwassen slice-culturen werden cellen gelabeld met de microglia-oppervlaktemarker CD 11 B. Deze figuur toont de effecten van koude-preconditionering, neuroprotectie en hippocampale slice-culturen geïncubeerd met cytx green marker voor dode cellen.De prescreen-afbeeldingen links tonen hier geen ca one-letsel. De sham-controleculturen worden bovenaan weergegeven en de koud-preconditioneer-culturen worden onderaan weergegeven. De afbeeldingen in de middelste rij tonen het relatieve letsel van de slice-cultuur 24 uur na blootstelling aan 20 micromolar NMDA.Merk op dat de schijncontrole-beschadiging groter is dan die van culturen die zijn blootgesteld aan koude-preconditionering, aangeduid als cp. De kleurkalibratieschaal voor de relatieve beschadiging wordt getoond in de afbeelding linksboven. Traditioneel worden culturen vervolgens blootgesteld aan een maximaal beschadigingsniveau, zoals 20 µM MDA gedurende de nacht, om de beschadigingsniveaus van CA1-neuronen te maximaliseren en de relatieve beschadiging van koude-preconditionering versus schijn vast te stellen, genoteerd als een ratio van beschadiging ten opzichte van de maximale beschadiging.Blootstelling aan maximale letselstimuli is echter mogelijk onvoldoende om de neuroprotectie door preconditioning te overwinnen. Bijgevolg is het gebruik van ratio's van letsel ten opzichte van maximaal letsel mogelijk geen nauwkeurige weergave van de neuroprotectie door preconditioning. Dit is duidelijk zichtbaar in de afbeeldingen aan de rechterkant, waaruit blijkt dat de maximale niveaus bij koude preconditioning lager zijn dan die van de sham-controles.In deze studie werd vastgesteld dat het gebruik van ratio's van letsel ten opzichte van maximaal letsel neuroprotectie door koude preconditionering kan maskeren. Dit is te zien in het schema, waarbij schijnletsel in het rood wordt weergegeven en letsel na koude preconditionering in het blauw; één dag na NMDA-blootstelling werd het letselniveau bij koude preconditionering bepaald op drie, vergeleken met een niveau van vijf bij de schijncontrole. Dit is consistent met 40% neuroprotectie.Echter, wanneer een traditioneel formaat wordt gebruikt met ratio's zoals letsel ten opzichte van maximaal letsel, is er geen bescherming zichtbaar. In andere woorden, 50% voor sham versus 50% voor koude preconditionering. Kwantitatieve PCR werd uitgevoerd met mRNA-monsters zoals hier getoond.De spiegels van TNF alpha na koude preconditioning, weergegeven door de blauwe lijn, waren hoger dan die van de controles, die worden weergegeven door de groene, gele en paarse lijnen. Dit suggereert dat koude preconditioning een verhoogde productie van TNF alpha in de hersenen triggert; om de resultaten van de kwantitatieve PCR en de kwantitatieve PCR-array te bevestigen, werd immunokleuring uitgevoerd. Deze plakcultuur werd verwerkt voor interleukine 11, weergegeven in het rood, en NeuN om neuronen weer te geven, getoond in het groen.Let op dat sommige parametale neuronen, die door de pijlen worden aangewezen, interleukine 11- en neuend-kleuring vertonen en in geel zijn weergegeven. De pijlen wijzen naar enkele kleinere cellen die waarschijnlijk astrocyten zijn en enkel een toegenomen interleukine 11-kleuring vertonen. Bij het beschrijven van het cytokine-signaleringssysteem dat betrokken is bij neuroprotectie door koude preconditionering, is het belangrijk om enkele fundamenteel belangrijke concepten te vermelden.Hoewel cytokinen in de normale hersenen in extreem lage concentraties voorkomen, leiden kleine veranderingen in de cytokinenconcentraties tot veranderingen in de genexpressie. Zelfs bij lage concentraties hebben cytokinen dus een enorm potentieel om de structuur en functie van de hersenen en daarmee het fenotype van een organisme te beïnvloeden. Dit concept wordt hier weergegeven door de inverse van de afstand, beginnend bij een kattenvioorsnar als referentiepunt, waarbij natrium, kalium, pH en calcium worden vergeleken met TNF alpha.Het is daarnaast belangrijk om in gedachten te houden dat cytokinen sterk redundant en pleiotroop zijn; meerdere cytokinen kunnen soortgelijke effecten hebben en een enkel cytokine kan variabele effecten hebben. Om zo de aangeborene cytokinebasis voor neuroprotectie door koude preconditioning nauwkeurig vast te stellen, moet daarom een samengestelde analyse van gerelateerde signaleringsvariabelen worden bepaald. Dit wordt bereikt via multiplex-assaystrategieën, waarmee de cytokinehandtekening van neuroprotectie door koude preconditioning wordt vastgesteld. Eenmaal beheerst, kunnen deze culturen in ongeveer drie uur worden voorbereid en gemanipuleerd voor studie.De respons op koudepreconditionering kan over ongeveer drie dagen worden uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedures is het essentieel om eraan te denken dat steriele technieken en minimale hantering noodzakelijk zijn om het vermogen te behouden om laagwaardige pro-inflammatoire signalering na deze procedures te detecteren. Andere methoden, zoals proteomische en moleculair-biologische analyses, kunnen op de culturen worden toegepast om de mechanismen te ontcijferen waarmee koudepreconditionering zijn nutritieve en beschermende effect op de hersenen uitoefent.

strategies-for-study-of-neuroprotection-from-cold-preconditioning

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Er is een groeiend aantal aanwijzingen, dat ischemische preconditionering (PC) - een niet-schadelijk ischemische uitdaging voor de hersenen - verleent een tijdelijke bescherming aan een volgende schadelijke ischemische schade. Wij opgericht bilaterale gemeenschappelijke occlusie van de halsslagader (BCCAO) als voorbehandeling stimulans voor vroege ischemische tolerantie (IT) in C57Bl6 / J muizen aanzetten tot voorbijgaande focale cerebrale ischemie (geïnduceerd door midden cerebrale slagader...

Bilaterale Gemeenschappelijke occlusie van de halsslagader als een adequate Voorconditionering Stimulus naar Early ischemische tolerantie te induceren bij focale ischemie

Source: Zheng, Y., et al. Experimental Models to Study the Neuroprotection of Acidic Postconditioning Against Cerebral Ischemia. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the application of acidic postconditioning (APC) to evaluate its neuroprotective effects against ischemic injury in a mouse model of middle cerebral artery occlusion (MCAO). It outlines the steps involved in reperfusion in the MCAO model and the application of APC during reperfusion to mitigate excitotoxicity, oxidative...

 Assessing the Neuroprotective Effects of Acidic Postconditioning in a Mouse Model of Cerebral Ischemia

Source: Poinsatte, K., et al., Quantification of Neurovascular Protection Following Repetitive Hypoxic Preconditioning and Transient Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the method of repetitive hypoxic preconditioning (RHP) by exposing a mouse to controlled hypoxia cycles before inducing an ischemic stroke. The experiment evaluates its effects on blood-brain barrier stability, neuronal adaptation, and inflammation.

Neuronal Adaptation to Repetitive Hypoxic Preconditioning in Mice

Source: Brandli, A. Remote Limb Ischemic Preconditioning: A Neuroprotective Technique in Rodents. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates a non-invasive limb ischemic preconditioning protocol in rats to induce systemic neuroprotection. The procedure involves controlled arterial occlusion and reperfusion, triggering cellular stress pathways that release protective factors. These factors enhance resistance to ischemic and metabolic injuries in distant organs such as the brain and retina.

Non-Invasive Limb Ischemic Preconditioning in a Rat Model for Neuroprotection

Remote ischemische preconditionering (RIP) is een werkwijze voor het conditioneren weefsels tegen schadelijke stress. We hebben een methode van remote ischemie vastgesteld op de achterste ledematen, door het opblazen van een bloeddrukmeter manchet voor 5-10 min. De neurobeschermende capaciteiten van RIP zijn aangetoond in een model van retinale degeneratie in knaagdieren.

Remote Limb Ischemische preconditionering: Een Neurobeschermende Technique in Knaagdieren

Dit protocol beschrijft repetitieve hypoxische preconditie, of korte blootstellingen aan systemische hypoxie die infarctvolumes en bloed-hersenbarrière-storingen verminderen na een voorbijgaande occlusie van de middelste hersenslagader bij muizen. Het beschrijft ook dubbele kwantificering van infarctvolume en bloed-hersenbarrière-storing na een beroerte om de werkzaamheid van neurovasculaire bescherming te beoordelen.

Kwantificering van Neurovasculaire Protection Na Repetitive Hypoxische Voorconditionering en Transient midden cerebrale slagader Occlusie in Muizen

Chirurgische occlusie van een distale middelste cerebrale slagader tak (MCAo) is een veel gebruikte model in de experimentele beroerte onderzoek. Dit manuscript beschrijft de basistechniek vaste MCAo, gecombineerd met het inbrengen van een laterale craniale venster, dat de mogelijkheid voor longitudinaal intravitale microscopie bij muizen heeft.

Laterale Chronische Cranial Window Voorbereiding Maakt In Vivo Observatie Na distale midden cerebrale slagader Occlusie in Muizen

Zure postconditioning beschermt tegen cerebrale ischemie. Hier presenteren wij twee modellen om APC uit te voeren. Ze worden respectievelijk bereikt door corticostriatale plakjes over te brengen naar zure buffer na zuurstof-glucose-deprivatie in vitro en door inademing van 20% CO 2 na middelste cerebrale arterie-occlusie in vivo .

Experimentele modellen om de neuroprotectie van zure postconditioning te bestrijden tegen cerebrale ischemie

Complexe motoriek in naturalistische omgevingen vereisen zorgvuldige coördinatie van de ledematen omvat de regio's van de pariëtale cortex. Het volgende protocol beschrijft het gebruik van omkeerbare koeling-geïnduceerde deactivering om aan te tonen van de rol van de pariëtale gebied 5 bij geheugen-geleide obstakel vermijden in de wandelende kat.

Omkeerbare koeling-geïnduceerde deactiveringen te bestuderen van de corticale bijdragen aan belemmering geheugen in de wandelende kat

De verschillende effecten van verschillende graden van onderkoeling op myocardbescherming zijn niet grondig geëvalueerd. Het doel van deze studie was om de niveaus van celdood na verschillende hypothermiebehandelingen te kwantificeren in een op humane cardiomyocyten gebaseerd model, dat de basis legde voor toekomstig diepgaand moleculair onderzoek.

In vitro beoordeling van myocardbescherming na hypothermie-conditionering in een humaan cardiale myocytenmodel

Dit artikel beschrijft twee methoden voor kortdurende hypothermie-inductie van het hele lichaam bij ratten. De eerste, snelle inductiemethode, maakt gebruik van actieve koeling met behulp van ventilatoren en ethanolspray voor een snelle temperatuurdaling. De tweede methode is een geleidelijke afkoelmethode. Dit wordt bereikt door de combinatie van isofluraan-anesthesie en de verlaging van temperatuurinstellingen op de huisotherme warmtemat. Dit resulteert in een geleidelijke daling van de...

Kortdurende hypothermie-inductie bij ratten met behulp van modellen voor studies die klinische relevantie en mechanismen onderzoeken

Leer hoe koude-preconditionering neuroprotectie induceert in rattenhippocampus-sliceculturen via pro-inflammatoire cytokinesignalering. Deze methode identificeert therapeutische doelen voor neurologische bescherming.

Strategieën voor de Studie van de neuronen van Cold-preconditionering

Meer video's verkennen