Name: Groei en differentiatie van volwassen hippocampus Arctic grondeekhoorn neurale stamcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-07T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Leer hoe je neurale stamcellen uit de hippocampus van volwassen Arctic grondeekhoorns zaait, expandeert en differentieert tot neuronen en gliacellen. Deze methode maakt onderzoek naar neurogenese en ischemische tolerantie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door US Army Medical Research en Materieel Command verlenen # 05178001 en door NS041069-06 van het Nationaal Instituut voor Neurologische Aandoeningen en beroerte. Wij danken Joel Vonnahme voor nuttige commentaar op het protocol.

1. AGS Neurale stamcellen en Media voorbereiding <ol><li> Volwassen hippocampus Arctic grondeekhoorn (AGS) neurale stamcellen geïsoleerd op een manier die eerder beschreven 9 kan nu commercieel worden verkregen als gecryopreserveerd flacons. Cellen worden 's nachts verstuurd in geïsoleerde verpakkingen met droog ijs om ervoor te zorgen dat de cellen blijven in een gecryopreserveerd staat. Te onderhouden integriteit, pak de cellen direct na ontvangst en op te slaan op een lager dan -150 ° C, of ​​in de dampfase van een vloeibare stikstof Dewar. </li><li> Bereid agsNSC Basale Medium + 5% FBS door toevoeging van 5 ml FBS (LS-1012) tot 95 ml agsNSC basismedium </li><li> Bereid agsNSC Uitbreiding Medium door de toevoeging van 500 pi B-27 Supplement (Invitrogen) tot 50 ml agsNSC Basale Medium. Verdeel de rest van de B27 in 1 ml porties en bewaar bij -20 ° C tot gebruik. </li><li> Warm 25 ml agsNSC Basale Medium + 5% FBS en 20 ml agsNSC Uitbreiding Medium in een 37 ° C waterbad. </li><li> Coat kolven gebruikt worden voor uitbreiding met poly-L-ornithine <ol><li> Ontdooi de poly-L-ornithine (10 ug / ml) werkende oplossing. Bewaar de oplossing tussen 2-8 ° C gedurende een maand een keer ontdooid. </li><li> Voeg 8 mL Poly-L-Ornithine werkende oplossing voor een geventileerde T-75 kolf en gelijkmatig verdelen van de oplossing over de hele cultuur oppervlak van de kolf. (Pas hoeveelheid van de werkoplossing voor de andere cultuur schepen die gebruikt kunnen worden gebruik 0,5 -.. 1,0 ml Poly-L-Ornithine werkende oplossing per 10 cm 2 cultuur oppervlak) </li><li> Incubeer kolven bij 37 ° C voor een minimum van 24 uur. (Gebruik van een incubator zonder toevoeging van CO 2 heeft de voorkeur voor incubatie van Poly-L-Ornithine gecoate kweekvaten.) Gecoate kolven kunnen worden opgeslagen voor maximaal twee weken in de couveuse. </li><li> Voorafgaand aan het gebruik, zuigen Poly-L-Ornithine werkende oplossing uit de kolf en was twee keer met steriele weefselkweek kwaliteit water. Aspireren vloeistof tot de kolf is bijna droog voor gebruik. </li></ol></li><li> Verwijder een flacon van de Dewar en controleer of de dop goed is afgesloten. Houd de bovenkant van de flacon het verlaten van de onderste helft van de flacon in een 37 ° C waterbad voor ongeveer 60-90 seconden, of totdat flacon is bijna helemaal ontdooid; een kleine hoeveelheid ijs moet nog steeds zichtbaar zijn. Om contaminatie te vermijden, houd de dop uit het water. Niet meer dan ontdooien, omdat dit kan schade aan de cellen. </li><li> Spray de buitenkant van de flacon met 70% ethanol of isopropanol, dan plaatst u de flacon in een biologisch veiligheidskabinet. Verwijder voorzichtig de dop om besmetting of spatten te voorkomen. </li><li> Voorzichtig resuspendeer de cellen in de flacon door het toevoegen van 1 ml van agsNSC Basale media + 5% FBS met behulp van een steriele pipet. Breng de re-geschorste cellen aan 25 ml warm agsNSC Basale Medium + 5% FBS in een centrifugebuis van 50 ml. </li><li> Zodra Spoel de cryo-flacon met verdunde celsuspensie. Centrifugeer de cellen op 150 xg gedurende 6 minuten. Voor de beste resultaten, het berekenen van de snelheid voor elke individuele centrifuge type. </li><li> Terwijl de cellen stoppen met draaien, voeg 10 ml agsNSC Uitbreiding Middelgrote tot het droge poly-L-ornithine gecoate T-75 erlenmeyer en voeg 40 ul van rh FGF-basic (40ng/mL). Na centrifugatie, zuig de bovenstaande vloeistof en zorg dat er niet te zuigen de korrel. Resuspendeer de cellen in 10 ml agsNSC Uitbreiding Medium. Breng de re-gesuspendeerd cellen in agsNSC Uitbreiding medium in de media in de T-75 kolf. </li><li> Schud de cultuur schip side-to-side gelijkmatig te verdelen cellen binnen het schip. </li><li> Plaats gezaaid cultuur vaartuig in een 37 ° C, 5% CO 2 incubator. De cellen moeten hechten aan de kolf en beginnen om processen vormen binnen twee uur van zaaien. Als de cellen blijven zweven en gebald binnen het medium, centrifugeer cellen in 5% FBS en uit te voeren stappen 1.8-1.10 met vers medium en fles. </li></ol> 2. Uitbreiding van AgsNSC <ol><li> Twee dagen (~ 48 uur) na het ontdooien en het zaaien van de cellen, dient een volledige vervanging van medium worden uitgevoerd met behulp van 20 ml agsNSC Uitbreiding Medium plus een 40 ul piek van RH FGF-basic. </li><li> Spike flesjes met 40 pl van rh FGF-basic op de dag na inenting. De cellen zullen klaar om trypsinize wanneer het bereiken van 75-80% confluentie door de derde of vierde dag na inoculatie. Het kweken van de ongedifferentieerde stamcellen langer dan 4 dagen na de inoculatie wordt niet aanbevolen omdat langere incubatietijd zal cellen beginnen te differentiëren tot neuronen en neuronen kunnen gewond raken door trypsinebehandeling tijdens stap 3. De RH FGF-basic kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende een week en nog steeds activiteit. De RH FGF-basic kan ook gaan via een extra vries / dooi bij -20 ° C als er meer tijd nodig is. </li></ol> 3. Behandeling met trypsine van cellen <ol><li> agsNSC moet worden gepasseerd 3 tot 4 dagen na inoculatie. Bereid een poly-L-ornithine gecoate fles tussen 24 uur en een week voor passage als de agsNSC weer worden uitgebreid. </li><li> Aspireren van demedium van de cultuur schip. Voeg 2,5 mL van 0,05% Trypsin/0.02% EDTA (CM-0017) het schip voor elke 75 cm 2 van het oppervlak. Roer voorzichtig om alle cellen te waarborgen worden bekleed met het trypsine / EDTA. Cellen normaal beginnen te los te maken van het oppervlak binnen 60 seconden, afhankelijk van de samenvloeiing van de cellen. Niet meer dan trypsinize, zal daar dit schade aan de cellen. Zachtjes tikken van de cultuur schip van meerdere kanten zal aanmoedigen onthechting. </li><li> Zodra de cellen los, voeg 10 ml agsNSC Basale Medium + 5% FBS aan de kolf. Zwenk om alle trypsine oplossing zorgen is geneutraliseerd. Met behulp van aseptische laboratoriumtechnieken, pipet de cellen in een steriele centrifugebuis met 10 ml agsNSC basismedium +5% FBS. Herhalen door het wassen van de kolf weer met een extra 10 ml agsNSC Basale Medium + 5% FBS en te combineren met de eerste wasbeurt. </li><li> Centrifugeer op 150 xg cellen gedurende 6 minuten zoals hierboven beschreven. Na het centrifugeren moeten de cellen vormen een schone losse pellet. Aspireren geneutraliseerd trypsine en medium van de centrifugebuis en resuspendeer de cel pellet in 10 ml (per T-75 fles) van voorverwarmde agsNSC Basale Medium + 5% FBS door zachtjes en neer te pipetteren 2X met een 10 ml pipet. Voer een celgetal zoals hieronder beschreven. </li></ol> 4. Standaard Berekening voor Plating van cellen <ol><li> Met behulp van aseptische technieken, zwenk de celsuspensie en overdracht 15 pi van de celsuspensie om een ​​microcentrifugebuis. Voeg 15 pl van 0,4% trypan Blue. Meng voorzichtig en de belasting 10 pi celsuspensie aan elk van de kamers van een schone hemacytometer, zoals een heldere lijn telkamer (catalogus # 1490: Hausser Scientific, <a href="http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm">http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm</a> ). </li><li> Graaf een minimum van vier kwadranten op de hemacytometer. De blauwe cellen die positief zijn voor trypan Blue zijn dood en mogen niet worden meegeteld. Voor een nauwkeurige cellen telt, is het optimale aantal cellen per kwadrant worden 25 tot 75 cellen. </li><li> Na het tellen van de cellen, bereken het gemiddelde van de vier kwadranten. Vermenigvuldig het aantal cellen met gemiddeld 10.000 en met de verdunningsfactor (2 bij gebruik van de aanbevolen hoeveelheden) om het aantal cellen per ml te bepalen. Merk op dat als de totale procentuele levensvatbaarheid lager is dan 92% kan er een aantal oorzaken. Een reden voor de lage levensvatbaarheid kan worden over behandeling met trypsine, voorafgaand aan de neutralisatie trypsine met FBS. Een andere reden kan zijn dat de concentratie van serum (FBS) om trypsine te laag is en de cellen blijven getrypsiniseerd. Ten derde kan de cellen zijn te samenvloeiing, waardoor stamcellen om te differentiëren ten gevolge van cel-cel contact, wat leidt tot schade tijdens behandeling met trypsine. Als deze methode wordt op de voet gevolgd met een opbrengst van 3 of meer verdubbelingen mag worden verwacht, waardoor een populatie van&gt; 4.000.000 cellen uit een eerste aantal van ~ 500.000. </li></ol> 5. Enten van een andere Uitbreiding Flask <ol><li> Voor het bepalen van het totale aantal cellen nodig is om een schip te enten, vermenigvuldigt u het gewenste zaaien dichtheid (6600 cellen per cm 2 of 500.000 cellen per T-75 fles) door de oppervlakte (in cm 2) van het schip te worden ingeënt. Als inenten van meer dan een vaartuig te vermenigvuldigen het aantal cellen per schip door het totaal aantal vaartuigen. Voor het bepalen van het volume (ml) van de celsuspensie die nodig is om elk vaartuig enten, delen het aantal cellen nodig is om een ​​schip te enten door het aantal levensvatbare cellen / ml in de celsuspensie. Als inenten van meer dan een vaartuig berekent het totale volume van de celsuspensie die nodig zijn door vermenigvuldiging van het volume nodig is voor een schip door het totale aantal vaartuigen te worden ingeënt. </li><li> Centrifugeer het gewenste volume van de cellen in agsNSC basismedium + 5% FBS, waardoor een losse pellet. Normaal gesproken 500.000 cellen worden gebracht tot een totaal volume van 25 ml in agsNSC basismedium +5% FBS zoals eerder is beschreven. Aspireren vloeistof en de losse pellet opnieuw te schorten in 10 ml agsNSC Uitbreiding Medium Deze extra centrifugatie stap nodig is om FBS te verwijderen voordat inenting. Voeg 10 ml van de voorverwarmde agsNSC Uitbreiding Medium op de T-75 kolf. Voeg de 10 ml geresuspendeerde celsuspensie aan de T-75 erlenmeyer en voeg 40 ul van rh FGF-basis aan de kolf. Van mening dat de behandeling met trypsine en enten moet niet langer dan 1,5 uur te nemen als het bepalen van het maximale aantal kolven om mee te werken op een bepaald moment. Men moet ook voldoende media voor volledige media verandert als met behulp van een groot aantal flessen. </li><li> Schud de kolf van links naar rechts gelijkmatig te verdelen de cellen en plaats de kweekvaten in een 37 ° C, 5% CO 2 incubator, zoals eerder beschreven. </li></ol> 6. Verdunning van cellen voor Enten van de well platen voor differentiatie <ol><li> Een multi-well formaat kunnen worden gebruikt, maar enting in BD Biocoat Poly-L-lysine gecoate platen met 96 putjes is deshier cribed. Bepaal het volume van de celsuspensie nodig zijn voor uw experiment door vermenigvuldiging van het aantal putten worden ingeënt met 0,2 mL per goed voor een 96 multi-well plaat en voeg ongeveer 10% aan een verlies in volume tijdens de inenting te dekken. Bereken de verdunning tot een cel-dichtheid van 75.000 cellen / ml. Bepaalt het bedrag van FBS te worden toegevoegd aan de Differentiatie Medium tot een uiteindelijke concentratie van 2% FBS (tabel 1) te bereiken. Meng de FBS en Differentiatie Medium. Meng voorzichtig de cellen met het berekende volume Differentiatie Medium met FBS. (Let op: tijdens het centrifugeren de cellen in de basale agsNSC Medium + 5% FBS Terwijl FBS cellen beschermt tijdens het centrifugeren en faciliteert celadhesie FBS remt differention Verdunnen FBS tot 2% zal de hechting van de cellen aan de multi-well ondergrond mogelijk te maken... De 2% FBS wordt daarna verder verdund tot differentiatie te bevorderen. insuline-transferrine-Seleen (ITS-e) is ook opgenomen in de Differentiatie Medium tot differentiatie te bevorderen. </li><li> In een kast bioveiligheid, afzien van 200 uL van verdunde celsuspensie van een steriele combitip reservoir aan elke well van een Poly-L-lysine gecoate 96-well plaat met behulp van een multi-channel pipet en een grote opening tips. Incubeer de platen gedurende 1,5-2 uur bij 37 ° C, 5% CO 2. Nadat de cellen hebben gehecht, na ongeveer 90 tot 120 minuten, verwijder voorzichtig 50% (100 ul voor 96-well platen) van het medium uit elk putje met behulp van grote opening pipetpunten. Plaats voorzichtig het volume verwijderd met warme agsNSC Differentiatie Medium, wederom met behulp van grote opening pipetpunten. (Gebruik van standaard opening tips kunnen verwonden de cellen). </li><li> Twee dagen na inoculatie (~ 48 uur), het uitvoeren van een 50% medium veranderen met behulp van agsNSC Differentiatie Middelgrote en grote opening pipetpunten. </li></ol> 7. Onderhoud van Neuronen <ol><li> Bereid Neuronale Onderhoud Medium met behulp van NeuraLife, glutamine en B27 volgens de instructies. Neuronale Onderhoud Medium moet wekelijks worden voorbereid. </li><li> Twee dagen na de laatste agsNSC Differentiatie Medium veranderen, normaal gesproken Dag 4 na de inoculatie, het uitvoeren van een 50% medium vervangen met behulp van Neuronale Onderhoud Medium. </li><li> Blijven tot 50% medium vervangingen met behulp van Neuronale Onderhoud Medium om de 2 tot 3 dagen uit te voeren. Neuronale processen moeten verschijnen binnen een paar dagen van het overschakelen op Neuronale Onderhoud Medium. De cellen worden gebruikt binnen de 3 weken worden overgedragen aan Neuronale Onderhoud Medium. Neuronen kunnen worden geïdentificeerd met behulp van een aantal commercieel beschikbare neuronale markers. Astrocyten zal ook altijd in acht worden genomen. </li><li> Cultuur populaties doorgaans drukken een meer dan 40% verhouding van neuronen het totale aantal cellen. Het gebruik van neuron onderhoud andere media dan de NeuraLife kan worden bepaald inferieur cellen die niet kijken morfologisch volwassen en mag niet overleven zo lang in cultuur. </li></ol> 8. Representatieve resultaten: De Arctic grondeekhoorn volwassen neurale stamcellen zal blijven om de 24 uur gedurende 3 tot 5 dagen verdubbelen gedurende ten minste twee passages toen gezaaid met 500,000-600,000 cells/75mm kolf. Deze cellen zullen gemakkelijk onderscheiden met de verwijdering van basicFGF en B27 en de aanwezigheid van 1-2% FBS en 1% insuline / Transferrine / Selenium, en zullen TUJ1 (Covance) positieve neuronen binnen 14-21 dagen (zie figuur 2). De verhouding van neuronen aan de totale cellen zullen variëren tussen 40-60%, afhankelijk van de leeftijd van de cultuur (figuur 3). Neuronen kan worden gebruikt voor experimenten van 12 dagen na het zaaien door middel van ten minste 21 dagen na het zaaien. <img src="/files/ftp_upload/2199/2199fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Microfoto van AGS volwassen hippocampus neurale stamcellen. Fase microfoto van AGS volwassen hippocampus neurale stamcellen na drie dagen van de groei in agsNSC basale media in Poly-L-Ornithine gecoat kolven. Verdubbeling gebeurt ongeveer elke 24 uur. Foto op 100X vergroting. <img src="/files/ftp_upload/2199/2199fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. TL-microfoto van gedifferentieerde AGS volwassen hippocampus neurale stamcellen AGS neurale stamcellen werden onderworpen aan differentiatie media voor 4 dagen, dan aangehouden in Neuralife gedurende 17 dagen voorafgaand aan de vaststelling. Cellen werden gefixeerd met 4% paraformaldehyde en neuronen geïdentificeerd met behulp van TUJ1 primaire antilichaam (Covance) en Alexa Fluor 568 secundair antilichaam (groen) van Invitrogen. Hoechst kleurstof 33343 werd toegevoegd aan alle kernen (blauw) vlek. Aantal cellen, het aantal en neuron neuron verhouding werden bepaald met behulp van neurietuitgroei software en de Arrayscan instrument van Cellomics. Deze foto vertegenwoordigt ongeveer 57% neuronen. 10X vergroting <img src="/files/ftp_upload/2199/2199fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Neuron nummers en Neuron Ratio van gedifferentieerde AGS neurale stamcellen op driecultuur leeftijden AGS neurale stamcellen werden onderworpen aan differentiatie media voor 4 dagen, dan aangehouden in Neuralife voor 12, 15 en 17 dagen voorafgaand aan de vaststelling. Cellen werden vaste en neuronen geïdentificeerd met TUJ1 primair antilichaam (Covance). Hoechst kleurstof werd toegevoegd aan alle kernen voor de totale cel identificatie vlek. Aantal cellen, neuron aantal en percentage neuron verhouding werden bepaald met behulp van neurietuitgroei software en de Arrayscan instrument van Cellomics. Waarden vertegenwoordigen gemiddelde van 15 putten per conditie + SD. Tabel 1. Proef de berekeningen gebruikt in de passage en zaaien <ol><li> Met behulp van 700.000 cellen / ml celsuspensie </li><li> Met behulp van een cel dichtheid van 75.000 cellen / ml of 15.000 cellen per putje van 0,2 ml volume in elk putje. </li><li> Inenten van 96 putten op 0,2 ml per well = 19,2 mL of gewenste eindvolume 21 ml. </li><li> (Uiteindelijke concentratie x Final Volume) ÷ beginconcentratie = oorspronkelijke volume (21 ml x 75.000 cellen / ml) ÷ 700.000 = 2,25 mL </li><li> Het volume van FBS in celsuspensie. 2,25 ml = 2,25 mL x 0,05 = 0,1125 ml </li><li> Het volume van FBS nodig in 21 ml = 21 ml x 0,02 = 0,42 mL </li><li> Volume van FBS toe te voegen aan Differentiatie Medium = 0,42 mL - 0,1125 = 0,3075 ml mL </li><li> Volume van Differentiatie Medium = 21 mL - 2,25 mL celsuspensie - 0,3075 ml 5% FBS = 18,44 mL. </li><li> Combineer 18,44 mL Differentiatie Medium met 0,308 mL FBS en voeg 2,25 ml celsuspensie. </li></ol>

<ol><li>Barnes, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze+avoidance+in+a+mammal%3A+body+temperatures+below+0+degree+C+in+an+Arctic+hibernator%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Freeze avoidance in a mammal: body temperatures below 0 degree C in an Arctic hibernator.</a> Science. 244, 1593-1595 (1989).</li>
<li>Dave, K. R., Prado, R., Raval, A. P., Drew, K. L., Perez-Pinzon, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arctic+ground+squirrel+brain+is+resistant+to+injury+from+cardiac+arrest+during+euthermia%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">The Arctic ground squirrel brain is resistant to injury from cardiac arrest during euthermia.</a> Stroke. 37, 1261-1265 (2006).</li>
<li>Dave, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C+epsilon+activation+delays+neuronal+depolarization+during+cardiac+arrest+in+the+euthermic+arctic+ground+squirrel%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C epsilon activation delays neuronal depolarization during cardiac arrest in the euthermic arctic ground squirrel.</a> J Neurochem. 110, 1170-1179 (2009).</li>
<li>Ross, A. P., Christian, S. L., Zhao, H. W., Drew, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+tolerance+to+oxygen+and+nutrient+deprivation+and+N-methyl-D-aspartate+in+cultured+hippocampal+slices+from+hibernating+Arctic+ground+squirrel%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Persistent tolerance to oxygen and nutrient deprivation and N-methyl-D-aspartate in cultured hippocampal slices from hibernating Arctic ground squirrel.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 26, 1148-1156 (2006).</li>
<li>Christian, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arctic+ground+squirrel+%28Spermophilus+parryii%29+hippocampal+neurons+tolerate+prolonged+oxygen-glucose+deprivation+and+maintain+baseline+ERK1%2F2+and+JNK+activation+despite+drastic+ATP+loss%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Arctic ground squirrel (Spermophilus parryii) hippocampal neurons tolerate prolonged oxygen-glucose deprivation and maintain baseline ERK1/2 and JNK activation despite drastic ATP loss.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 28, 1307-1319 (2008).</li>
<li>Jin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+stroke-induced+neurogenesis+in+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Evidence for stroke-induced neurogenesis in the human brain.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 13198-13202 (2006).</li>
<li>Maysami, S., Lan, J. Q., Minami, M., Simon, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferating+progenitor+cells%3A+a+required+cellular+element+for+induction+of+ischemic+tolerance+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Proliferating progenitor cells: a required cellular element for induction of ischemic tolerance in the brain.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 28, 1104-1113 (2008).</li>
<li>Sung, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia%2Freoxygenation+stimulates+proliferation+through+PKC-dependent+activation+of+ERK+and+Akt+in+mouse+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Res%22%5BJournal%5D)">Hypoxia/reoxygenation stimulates proliferation through PKC-dependent activation of ERK and Akt in mouse neural progenitor cells.</a> Neurochem Res. 32, 1932-1939 (2007).</li>
<li>Brewer, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+adult+rat+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of adult rat hippocampal neurons.</a> J Neurosci Methods. 71, 143-155 (1997).</li>
<li>Palmer, T. D., Takahashi, J., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adult+rat+hippocampus+contains+primordial+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The adult rat hippocampus contains primordial neural stem cells.</a> Mol Cell Neurosci. 8, 389-404 (1997).</li>
</ol>

JA Kelleher-Andersson is de oprichter van Neuronascent en is de uitvinder van de Arctische grondeekhoorn octrooiaanvragen. Neuronascent royalty&#39;s ontvangt voor de verkoop van AGS media en stamcellen. RC McGee is in dienst van Lifeline, Inc die de media en de AGS neurale stamcellen verdeelt.

AGS volwassen neurale stamcellen zijn robuust en kan worden uitgebreid voor een groot aantal passages waardoor ze een uitstekende bron van neurale stamcellen voor onderzoek naar elementaire neurale stamcellen eigenschappen. De uitbreiding bedraagt ​​ongeveer een verdubbeling elke vierentwintig uur, maar deze cellen moet voorafgaand aan het bereiken van samenloop worden gepasseerd, omdat contact tussen de cellen zal differentiatie gunst astrocyten. Contact-gemedieerde differentiatie zal daarom leiden tot de verhouding va...

<table><tbody><tr><td>agsNSC</td><td>Lifeline Cell Technology</td><td>FC-0004</td><td></td></tr><tr><td>agsNSC expansiekit</td><td>Lifeline Cell Technology</td><td>LL-0008</td><td>Alternatieve bron voor DMEM/F12, B27 en rhFGFb (&lt;a href=&quot;http://www.invitrogen.com">www.invitrogen.com&lt;/a&gt;)</td></tr><tr><td>agsNSC differentiatiekit</td><td>Lifeline Cell Technology</td><td>LL-0009</td><td>Alternatieve bron voor DMEM/F12 en ITS-x (&lt;a href=&quot;http://www.invitrogen.com">www.invitrogen.com&lt;/a&gt;)</td></tr><tr><td>NeuraLife onderhoudsmedium kit</td><td>Lifeline Cell Technology</td><td>LL-0012</td><td>Alternatieve bronnen zijn NeuraBasal (LifeLine) of Neurobasal (Invitrogen), glutamine en B27 (&lt;a href=&quot;http://www.invitrogen.com">www.invitrogen.com&lt;/a&gt;). Gedifferentieerde cellen worden tot 3 weken onderhouden in NeuroLife, maar niet langer dan 2 weken in Neurobasal (&lt;a href=&quot;http://www.invitrogen.com">www.invitrogen.com&lt;/a&gt;)</td></tr><tr><td>Micrometer (zoals een Bright Line Counting Chamber)</td><td>Hausser Scientific</td><td>1490</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm">http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Biocoat Poly-L-Lysine gecoate 96-wells platen</td><td>BD Biosciences</td><td>356516</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.bdbiosciences.com">www.bdbiosciences.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Pipetpunten met grote opening</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-141</td><td>Voorkomt beschadiging van neurale cellen tijdens het pipetteren. &lt;a href=&quot;http://www.fishersci.com">http://www.fishersci.com&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

groei en differentiatie van volwassen hippocampus arctic grondeekhoorn neurale stamcellen

Growth and Differentiation of Adult Hippocampal Arctic Ground Squirrel Neural Stem Cells

Arctic grondeekhoorns (Urocitellus parryii, AGS) zijn uniek in hun vermogen om te overwinteren met een lichaamstemperatuur de buurt van of onder het vriespunt 1. Deze dieren ook verzetten tegen ischemische schade aan de hersenen in vivo 2,3 en zuurstof-glucose ontbering in vitro 4,5. Deze unieke kwaliteiten op voorwaarde dat de impuls gegeven aan AGS neuronen te isoleren om de inherente neuronale eigenschappen die zou kunnen zijn voor de capaciteit van de AGS neuronen om letsel en celdood veroorzaakt door ischemie en extreem lage temperaturen weerstaan ​​onderzoeken. Het identificeren van eiwitten of genen doelstellingen die het mogelijk maken voor de onderscheidende eigenschappen van deze cellen kunnen helpen bij de ontdekking van effectieve therapieën voor een aantal van ischemische indicaties en voor de studie van koude tolerantie. Volwassen AGS hippocampus bevat neurale stamcellen die blijven prolifereren, waardoor voor een gemakkelijke uitbreiding van deze stamcellen in een kweek. We beschrijven hier methodes waarmee onderzoekers kunnen deze stamcellen en gedifferentieerde neuronen te gebruiken voor een aantal doeleinden. Door nauw samen de volgende stappen van de AGS neurale stamcellen kan worden uitgebreid via twee doorgangen of meer en dan gedifferentieerd om een ​​cultuur hoog in TUJ1-positieve neuronen (~ 50%), zonder gebruik te maken van giftige chemicaliën om het aantal delende cellen te minimaliseren. Ischemie veroorzaakt neurogenese 6 en neurogenese, die verloopt via MEK / ERK en PI3K/Akt overleven signaalwegen draagt ​​bij aan ischemie weerstand in vivo en in vitro 7 8 (Kelleher-Anderson, Drew ea., In voorbereiding). Verdere karakterisatie van deze unieke zenuwcellen kunnen voorschot op vele fronten, met behulp van enkele of alle van deze methoden.

Neurale stamcellen werden bereid uit de hippocampus van de volwassen niet-winterslaap jaarling Arctic grondeekhoorns (AGS). Deze neurale stamcellen kan worden uitgebreid door middel van talrijke passages, gedifferentieerde en onderhouden als een bijna 50:50 neuron te glia-cultuur.

Groei en differentiatie van volwassen hippocampus Arctic grondeekhoorn neurale stamcellen

Arctische grondeekhoorns (*Urocitellus parryii*, AGS) zijn uniek in hun vermogen om te winterslapen met een kerntemperatuur nabij of onder het vriespunt 1. Deze ...

Het algemene doel van deze procedure is het uitplaten, expanderen en differentiëren van neurale stamcellen die zijn geprepareerd uit de hippocampus van volwassen, niet-hibernerende jaaroude arctische grondeekhoorns. Dit wordt bereikt door eerst de A GS neurale stamcellen uit te platen. Vervolgens worden de neurale stamcellen geëxpandeerd en uitgeplaat in differentiatiemedium.De derde stap van de procedure is het differentiëren en onderhouden van de neuronen, waarna de cellen uiteindelijk worden gefixeerd, of behandeld en gefixeerd voor analyse. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen waaruit blijkt dat GS neurale progenitorcellen blijven delen gedurende twee weken van differentiatie en onderhoud, en zelfs onder ischemische omstandigheden. Het aantal neuronen wordt bepaald met kleuringen en fluorescentiemicroscopische technieken waarmee de neuronratio's worden gemeten.De implicaties van deze techniek reiken tot de ontdekking van therapieën voor beroertes en hartstilstanden. Aangezien gedifferentieerde neuronen van de arctische grondeek resistent zijn tegen alle ischemische insulten. Bereid vóór het starten van deze procedure de kolf voor die wordt gebruikt voor de expansie van A-G-S-N-S-C door deze te coaten met polyol-ornithine. Volg de instructies voor de werkopleossing van polyol-ornithine door deze in de incubator te laten staan.Na het ontdooien kan de oplossing tot een maand worden bewaard bij 2 tot 8 °C. Voeg 8 mL Polyol ornithine-werkoplossing toe aan een geventileerde T 75-fles en verdeel de oplossing gelijkmatig over het gehele kweekoppervlak van de fles. Incubeer de fles gedurende minimaal 24 uur bij 37 °C, bij voorkeur in een incubator zonder toegevoegde CO2 vóór gebruik.Aspireer de Polyol ornithine-werkoplossing uit de kolf en was deze twee keer met steriel weefselkweekwater. Aspireer de vloeistof totdat de kolf bijna droog is voordat u deze gebruikt om arctic ground squirrel neurale stamcellen te ontdooien en uit te zaaien. Verwijder eerst een vial A-G-S-N-S-C uit de vloeibare stikstofbewaring en controleer of de dop van de vial stevig is afgesloten.Houd de bovenkant van het vial vast terwijl de onderste helft ongeveer 60 tot 90 seconden in een waterbad van 37 °C blijft. Houd de dop van het vial buiten het water om mogelijke contaminatie te voorkomen. Haal het vial uit het waterbad wanneer het bijna volledig is ontdooid.Er moet nog steeds een kleine hoeveelheid ijs zichtbaar zijn. Laat het monster niet te veel ontdooien, omdat dit de cellen kan beschadigen. Bespuit de buitenkant van het vials met 70% ethanol of isopropanol en breng het vials vervolgens naar een biologische veiligheidskast.Verwijder de dop voorzichtig om contaminatie of spatten te voorkomen. Voeg met een steriele pipet één milliliter basaal medium toe aan het vial en resuspendeer voorzichtig.Resuspendeer de cellen. Breng de geresuspendeerde cellen over naar 25 milliliter warm basaal medium in een centrifugebuis van 50 milliliter. Centrifugeer de cellen bij 150 G gedurende zes minuten om de cellen te pelletteren.Voeg 10 milliliters expansiemedium toe aan de droge, met poly-L-ornithine gecoate T 75-fles, en voeg vervolgens 40 microliters Rh FGF basic toe wanneer de centrifugatie is voltooid. Aspireer het supernatant en de vloeistof voorzichtig zonder het pellet te aspireren. Resuspendeer de cellen in 10 milliliters expansiemedium.Breng de geresuspendeerde cellen over naar het medium in de T 75-fles. Schud de fles voorzichtig heen en weer om de cellen gelijkmatig in het vat te verdelen. Plaats de ingezaaide fles in een incubator bij 37 °C en 5% CO2.De cellen moeten zich hechten aan de fles en binnen twee uur na het uitplaten op de dag na inoculatie processen beginnen te vormen. Voeg 40 µL Rh FGF basic toe aan de fles met A-G-S-N-S-C. Voer twee dagen na het ontdooien en uitplaten van de cellen, op de derde of vierde dag na inoculatie, een volledige mediumverversing uit met 20 mL expansiemedium aangevuld met een spike van 40 µL RH FGF basic.De A-G-S-N-S-C moeten worden gesubcultiveerd: aspireer het medium uit de T 75-fles en voeg 2,5 milliliters trypsine EDTA toe; draai voorzichtig rond om ervoor te zorgen dat alle cellen zijn bedekt met de trypsine EDTA en tik voorzichtig tegen verschillende zijden van het kweekvat om de loslating te bevorderen. Zodra de cellen zijn losgekomen, voegt u 10 milliliters basaal medium toe aan de fles en draait u voorzichtig rond om ervoor te zorgen dat de gehele trypsine-oplossing is geneutraliseerd.Pipetteer de cellen in een steriele centrifugebuis met 10 milliliters basaal medium. Was de kolf vervolgens met nog eens 10 milliliters basaal medium en voeg dit samen met de eerste wasbeurt; centrifugeer de cellen bij 150 G gedurende zes minuten. Na centrifugatie moeten de cellen een schone, losse pellet vormen; aspireer het supernatant uit de centrifugebuis.Voeg vervolgens met een pipet van 10 milliliter 10 milliliter voorverwarmd basaal medium toe en resuspendeer. Suspendeer het celpellet door voorzichtig twee keer op en neer te pipetteren. Wanneer deze methode nauwkeurig wordt gevolgd, kan een opbrengst van drie of meer verdubbelingen worden verwacht, wat resulteert in een populatie van meer dan 4 miljoen cellen vanuit een initieel aantal van ongeveer 500.000. We zullen de inoculatie van A-G-S-N-S-C in een met poly-L-lysine gecoate 96-wells plaat voor differentiatie demonstreren, hoewel elk multi-well formaat voor deze procedure kan worden gebruikt.Bepaal eerst het volume cel-suspensie dat nodig is voor uw experiment en de hoeveelheid FBS die aan het A-G-S-N-S-C-differentiatiemedium moet worden toegevoegd om een eindconcentratie van 2%FBS te bereiken. Een voorbeeld van deze berekeningen wordt in de volgende protocoltekst getoond in een veiligheidskast. Meng de FBS en het differentiatiemedium.Meng vervolgens de cellen voorzichtig met een berekend volume differentiatiemedium met FBS en overbreng de cellen in het medium naar een steriel combi-tip reservoir. Gebruik een meerkanaals pipet en tips met een grote opening om 200 µL van de verdunde cel-suspensie uit het reservoir over elke well van de met poly-L-lysine gecoate 96-well plaat te verdelen. Incubeer de plaat gedurende anderhalf tot twee uur bij 37 °C en 5% CO2 om de cellen de kans te geven aan te hechten. Het medium.Het vervangen van het medium kan een uitdagend onderdeel van deze techniek zijn, omdat u de cellen daadwerkelijk kunt beschadigen met pipetpunten van normale grootte. Daarom gebruiken we pipetpunten met een grote opening om te voorkomen dat de cellen tijdens het vervangen van het medium beschadigd raken. Wanneer de cellen zijn gehecht, verwijdert u voorzichtig 50% van het medium uit elke put, wat in dit geval 100 µL is, met behulp van pipetpunten met een grote opening.Vervang het verwijderde volume zorgvuldig door warm differentiatiemedium. Gebruik hiervoor opnieuw pipetpunten met een grote opening. Incubeer de plaat bij 37 °C en 5% CO2 gedurende twee dagen na inoculatie.Voer een mediumverversing van 50% uit met differentiatiemedium en pipetpunten met een grote opening. Het neuronaal onderhoudsmedium voor het onderhoud van neuronen dient wekelijks te worden bereid volgens de instructies van de fabrikant. Twee dagen na de laatste differentiatie.Mediumverversing. Voer een 50% mediumvervanging uit met behulp van neuronale onderhoudsmedium. Verwijder voorzichtig 100 microliters van het differentiatiemedium uit elke well met behulp van pipetpunten met een grote opening en vervang dit door 100 microliters neuronale onderhoudsmedium.Zet voort met het elke twee tot drie dagen vervangen van 50% van het medium door neuronaal onderhoudsmedium. De neuronale uitlopers zouden binnen enkele dagen na de overschakeling naar het neuronale onderhoudsmedium zichtbaar moeten worden. De cellen moeten binnen drie weken na overdracht naar het neuronale onderhoudsmedium worden gebruikt.Gemiddelde arctische grondeekhoorn. Adulte neurale stamcellen zullen gedurende drie tot vijf dagen elke 24 uur blijven verdubbelen gedurende ten minste twee passages wanneer ze worden uitgeplaat met 500 000 tot 600 000 cellen per fles van 75 vierkante centimeter. Deze fotomicrografie bij 100x toont GS adulte hippocampale neurale stamcellen na drie dagen groei in A-G-S-N-S-C.Het basale medium in met polyol-ornithine gecoate flessen, samen met FBS en RH FGF basic, wordt verwijderd. De A GS neurostambehandelingen zullen differentiëren tot ongeveer de helft neuronen en de helft astrocyten. De neuronen zullen binnen 14 tot 21 dagen T tuj one positief worden, zoals geïllustreerd door deze fluorescentiemicrografie.Hier werden de cellen gefixeerd met 4%paraformaldehyde en werden neuronen in het groen geïdentificeerd. Met behulp van TJ one primair antilichaam en LOR 5 68 secundair antilichaam werden alle kernen blauw gekleurd door de toevoeging van hooks die. De verhouding van neuronen ten opzichte van het totaal aantal cellen zal variëren tussen 40 tot 60%, afhankelijk van de leeftijd van de kweek.Deze grafiek toont het aantal neuronen en de neuronratio's van gedifferentieerde GS neuro stamcellen op 16, 19 en 21 dagen na inoculatie. Voor differentiatie kunnen neuronen worden gebruikt voor experimenten vanaf 12 dagen na het uitplaten tot ten minste 21 dagen na het uitplaten. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u neuronen van de arctische grondeekhoorn klaarmaakt voor gebruik in ischemie-experimenten.

growth-differentiation-adult-hippocampal-arctic-ground-squirrel

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

This video demonstrates the process of neurosphere formation and their expansion from hippocampal tissue. Neural stem and progenitor cells from the postnatal mouse dentate gyrus tissue proliferate and form primary neurospheres, which are then reseeded to form secondary neurospheres.

Formation and Expansion of Neurospheres from a Hippocampal Tissue

Neurale stamcellen geoogst uit de volwassen hersenen worden steeds gebruikt in toepassingen, variërend van het fundamenteel onderzoek van de ontwikkeling van het zenuwstelsel aan het verkennen van potentiële klinische toepassingen in de regeneratieve geneeskunde. Dit maakt strenge controle op de isolatie en kweekomstandigheden gebruikt om deze cellen cruciaal voor experimentele resultaten goed groeien.

Groeiende neurale stamcellen uit Conventionele en Niet-conventionele Regio&#39;s van de Adult knaagdierhersenen

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het gelijktijdig opwekken van neurale precursoren celculturen, hetzij als hechtende monolagen of neurosferen, uit de subventriculaire zone en dentate gyrus van individuele volwassen muizen.

Een muis, twee culturen: Isolatie en Cultuur van adulte neurale stamcellen uit de Twee Neurogeen Zones van individuele muizen

Deze video-artikel illustreert een uitgebreid protocol om alle stadia van neurogenese van de hippocampus bij volwassenen binnen dezelfde weefselsectie te detecteren en te kwantificeren. We hebben een methode ontwikkeld om de beperkingen van indirecte meervoudige immunofluorescentie te overwinnen die zich voordoen wanneer geschikte antilichamen van verschillende gastheersoorten niet beschikbaar zijn.

Immunohistochemie en Multiple Labeling met antilichamen van dezelfde Host te onderzoeken soorten volwassen hippocampus Neurogenese

We rapporteren een op Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS) gebaseerde methode om neurale stamcellen (NSC's) en hun nakomelingen te isoleren uit de subventriculaire zone (SVZ) van de volwassen muizenhersenen. Toegepast op Fluorescent Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgene muizen, maakt het de studie van celcyclusprogressie mogelijk door live beeldvorming.

Celsortering van neurale stamcellen en stamcellen uit de Adult Mouse subventriculaire zone en Live-beeldvorming van de celcyclus Dynamics

De hond hersenen is een waardevol model waarin volwassen neurogenese bestuderen. hier gepresenteerde zijn protocollen voor het isoleren en het uitbreiden van volwassen honden hippocampus neurale voorlopercellen uit primaire hersenweefsel.

Isolatie en uitbreiding van Adult Canine hippocampus Neural Voorlopers

Het doel van dit protocol is om een aanpak te beschrijven voor het analyseren van gedrag van volwassen neurale stam/voorlopercellen in reactie op chemogenetische manipulatie van een specifiek lokaal neuraal circuit.

Asgezegde circuit specifieke regulering van volwassen Hippocampal neurale precursor cellen

Hier gepresenteerd is een protocol voor de spontane generatie van neuro sferen verrijkt in neurale voorlopercellen uit hoge dichtheid vergulde neuronen. Tijdens hetzelfde experiment, wanneer neuronen worden verguld met een lagere dichtheid, het protocol resulteert ook in langdurige primaire rat neuron culturen.

Generatie van neuro sferen van gemengde primaire Hippocampal en corticale neuronen geïsoleerd van E14-e16 Sprague Dawley rat embryo

In dit artikel beschrijven we, in detail, een protocol voor het genereren van neurosfeerculturen uit postnatale muisneurale stamcellen afkomstig van de belangrijkste muisneurogene niches. Neurosferen worden gebruikt om neurale stamcellen te identificeren uit hersenweefsel waardoor de schatting van voorloper celnummers. Bovendien kunnen deze 3D-structuren worden verguld met differentiërende omstandigheden, waardoor neuronen, oligodendrocyten en astrocyten ontstaan, waardoor het cellot kan worden...

Isolatie en uitbreiding van Neurosferen van Postnatale (P1−3) Muis Neurogene Niches

Transplantatie van menselijke pluripotente stamcel-afgeleide GABAerge neuronen gegenereerd door neuronale programmering zou een potentiële behandelingsbenadering kunnen zijn voor neurologische ontwikkelingsstoornissen. Dit protocol beschrijft de generatie en transplantatie van menselijke stamcel-afgeleide GABAerge neuronale voorlopers in de hersenen van neonatale muizen, waardoor langdurig onderzoek van geënte neuronen en evaluatie van hun therapeutisch potentieel mogelijk is.

Transplantatie van menselijke stamcel-afgeleide GABAerge neuronen in de vroege postnatale muis hippocampus om neurologische ontwikkelingsstoornissen te verminderen

Hier beschrijven we een nucleofectiesysteem dat is ontworpen om de efficiëntie van genafgifte te verbeteren in uitgebreide neurale stamcellen (NSC's) geïsoleerd uit de subventriculaire zone van volwassen muizen. De bevindingen tonen aan dat deze methode de genverstoring in NSC's aanzienlijk verbetert, de effectiviteit van traditionele transfectieprotocollen overtreft en de celoverleving verbetert.

Isolatie, expansie en nucleofectie van neurale stamcellen uit de subventriculaire zone van volwassen muizen

Leer hoe je neurale stamcellen uit de hippocampus van volwassen Arctic grondeekhoorns zaait, expandeert en differentieert tot neuronen en gliacellen. Deze methode maakt onderzoek naar neurogenese en ischemische tolerantie mogelijk.

Groei en differentiatie van volwassen hippocampus Arctic grondeekhoorn neurale stamcellen

Meer video's verkennen