Evaluatie van de ruimtelijke verdeling van γH2AX volgende ioniserende straling
August 7th, 2010
Microscopische analyse van γH2AX foei, welke vorm na de fosforylatie van H2AX op Ser-139 in reactie op DNA dubbelstrengs breuken, is uitgegroeid tot een onmisbaar instrument in straling biologie. Hier hebben we gebruik gemaakt van een antilichaam aan mono-gemethyleerde histon H3 op lysine 4 als een epigenetische marker van actief transcriberen euchromatin, om de ruimtelijke verdeling van de straling-geïnduceerde γH2AX formatie binnen de kern te evalueren.
Hallo daar, ik ben Raja Ti Ik doe mijn doctoraat aan het Baker IDI Heart and Diabetes Institute. Ik zal je door de stappen leiden die betrokken zijn bij 3D-illustratie van oosterse modificatie die DNA-schade en chromatische condensatie in een nieuwe hartcel markeren. DNA is gewikkeld rond nucleaire zones.
Elk nucleosoom bestaat uit vier verschillende soorten histonen, H twee A, H twee b, H drie en H vier radi. De vorming van DNA-breuken en dit wordt gemarkeerd door PHO van H twee X. Deze pho van H twee X komt voornamelijk voor in creatine die wordt gemarkeerd door methylering van H drie K vier. Nu zullen we kijken naar de 3D-illustratie van modificaties in uw cel met immuunlabel met de pho-laag H twee X en de gemethyleerde H Drie K vier.
Laten we beginnen. We beginnen door E cursus van de celsuspensie in 15 ml. Falcon tubes S worden twee keer gewassen met PB-scentation bij één 50 G en Resus.
Suspensie in vers Media om het onmiddellijke effect van straling op cellulaire gebeurtenissen te zien. Houd cellen op ogen gedurende vijf tot 10 minuten voor en tijdens straling. Stel cellen bloot aan gammastraling of röntgenstralen Na straling, verdeel drie milliliter van de celsuspensie in elke GU van zes.
Well plate voor piek gamma H twee X, incubeer cellen tussen 30 minuten tot één uur bij 37 graden Celsius. We gebruiken de Cytosine-missie om de niet-adhesieven cellen op glazen schijven te plaatsen. Bij het assembleren van de cytosineclip, zorg ervoor dat de hele filterkoord samenvalt met de trechter.
Verdeel een 50 microliter, veeg deze celsuspensie in elke cytosine-finale plaats de cytosineclips in Cytosine-missie en draai het 500 RPM gedurende vijf minuten. Verwijder de cytosineclips en scheid de schijven van de filterkaart. Laat cellen niet te lang luchtdrogen, omdat dit de achtergrond in fluoresceren-kleuring kan beïnvloeden.
Met behulp van vloeibare blokkeringspen tekent cirkels Rond elke uitstrijk, fixeren we de cellen met 4% paraformhoofd bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. In vergelijking met ethanol of ol, werd een betere fixatie waargenomen met 4% paraformhoofd. Winddia's met PPS-permecellen met Triton X 100 bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten.
In vergelijking met twin 80, hebben we een betere signaal in cellen per met Triton X 100 waargenomen. Kijk cellen met PP S3 keer per keer gedurende vijf minuten. Blokkeer cellen in een persoon BSA gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en herhaal dit drie keer in vergelijking met andere blokkeringsagenten en tijden.
BSA was het meest efficiënt In het minimaliseren van niet-specifieke binding van primaire antilichamen, we hebben twee primaire antilichamen verdund gebruikt, een in 500 met 1% BSA bij ongeveer 50 microliters primaire antilichaam voor elke schijf. Incubatie van primaire antilichamen bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten vermindert achtergrondkleuring in vergelijking met overnacht incubatie bij vier graden Celsius. Was cellen drie keer met PBS gedurende vijf minuten.
Alexa-vloer 4 88, goed antimuis en Alexa-vloer 5 46 woord anti konijn. Secundaire antilichamen werden gebruikt om verschillende markers tegelijkertijd te blijven. Gebruik antilichamen die in verschillende soorten worden verhoogd.
Voeg ongeveer 50 microliters van verdund secundair antilichaam toe aan elke schijf. Incubeer cellen bij kamertemperatuur gedurende 90 minuten. Het wordt aanbevolen om cellen in uw vochtige kamer te incuberen, omdat dit cellen en antilichamen voor droogwas zullen voorkomen. Was dia's met PB S3 keer per keer gedurende vijf minuten.
50 microliters van een een in 500 verdunning van topo drie in PBS werd toegevoegd aan elke schijf. Was dia's met PBS drie keer per keer gedurende vijf minuten. Verwijder overtollig vocht van dia's en voeg Antifa-oplossing toe.
Het wordt aanbevolen om cellen niet volledig te drogen voordat u Antifa-oplossing toevoegt. Plaats een dekglas op de dia. K moet worden genomen om de vorming van luchtbellen te voorkomen.
Laat dia's een nacht in een donkere vochtige kamer. Verzegel de dia met nagellak om het drogen van cellen te voorkomen. Beeld verkregen aan een confocale microscoop onthullen.
Betere ruimtelijke resolutie zijn verdwenen en heliumlaser werden gebruikt voor de beeldacquisitie. Een 63 olie-emissieobject twee lenzen geprefereerd boven hogere of lagere vergrotingslenzen. Een zoomfactor van drie of vier zal een beter oplossend beeld produceren.
Voor FO-account van veel cellen, is het beter om een scannelheid van acht te gebruiken, een beeldgrootte van 1024 in 1024 pixelcellen. Bij het beeldvormen voor meerdere kanalen wordt een sequentiële lijnscanacquisitie aanbevolen in vergelijking met framescan. Om specimenbleaching te voorkomen, worden de detectorversterking en versterker-offset aangepast om de muizen en signaal verzadiging te verminderen.
Aangezien de grootte van Kama HX X vier lager kan zijn dan 0,5 micrometer, wordt aanbevolen om beelden te verwerven met minimaal 0,5 micrometer. Stapgrootte langs jet-asbeelden zijn vereist in een jet-seriepatroon met behulp van het markeer-eerst- en markeer-verloren patroon. Om de ruimtelijke relatie tussen verschillende eiwitten te illustreren, wordt aanbevolen om een scannelheid van zes te gebruiken met een beeldgrootte van 2048 en 2 48 pixels met behulp van metamor eerst.
Tweede kan worden geteld Van beelden verkregen op verschillende confocale microscopen. Open gamma hgx-beeldtags rechtstreeks vanuit het menu Bestand of door factuurnummers.Tags te gebruiken. Ga naar het menu Proces en kies Stack arithmatic.
Kies maximale projectie en selecteer de plannen om te worden opgenomen. En klik op oké. Kies nu top hat en selecteer Gamma H twee X-beeld als een bronbeeld toepassen.
Top hat-filter en resulterend beeld zal een binair beeld zijn met minder ruis en verminderde variatie in foci-intensiteit. Ga naar regio's en selecteer de regio
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie richt zich op de analyse van γH2AX foci, die kritieke indicatoren zijn van DNA dubbelstrengsbreuken in de stralingsbiologie. Door gebruik te maken van een antilichaam voor mono-gemethyleerd histon H3 bij lysine 4, evalueert het onderzoek de ruimtelijke verdeling van γH2AX-vorming binnen de kern na blootstelling aan straling.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Stralingsbiologie
- DNA-schaderespons
- Epigenetica
Achtergrond
- γH2AX foci-vorming is een reactie op DNA-schade.
- Fosforylering van H2AX bij Ser-139 is een belangrijke marker.
- Mono-methylering van histon H3 bij lysine 4 duidt op actieve transcriptie.
- Het begrijpen van de ruimtelijke verdeling van DNA-schade is cruciaal voor stralingsstudies.
Doel van het onderzoek
- Om de vorming van γH2AX foci in reactie op straling te analyseren.
- Om de rol van epigenetische markers in de DNA-schaderespons te beoordelen.
- Om de ruimtelijke verdeling van deze markers binnen de kern te visualiseren.
Gebruikte methoden
- Microscopische analyse van γH2AX foci.
- Gebruik van antilichamen voor het detecteren van mono-gemethyleerd histon H3.
- 3D-illustratietechnieken voor het visualiseren van nucleaire modificaties.
- Evaluatie van door straling geïnduceerde effecten op chromatinestructuur.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van γH2AX foci als markers voor DNA dubbelstrengsbreuken.
- Demonstratie van de ruimtelijke verdeling van deze foci in de kern.
- Correlatie tussen histonmodificaties en transcriptionele activiteit.
- Inzichten in het epigenetisch landschap na blootstelling aan straling.
Conclusies
- γH2AX foci dienen als effectieve indicatoren van DNA-schade.
- Histonmodificaties leveren waardevolle informatie over de chromatinetoestand.
- De studie verbetert het begrip van de cellulaire respons op straling.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Understanding the spatial distribution of DNA damage markers like γH2AX provides mechanistic insights into chromatin context and transcriptional activity following radiation exposure. This approach supports target validation by linking epigenetic states to DNA repair pathways, enabling predictive confidence in preclinical models of genotoxic stress. The method enhances assay development for screening radiation-modifying compounds by quantifying foci formation in defined nuclear compartments.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by correlating γH2AX foci with active euchromatin marked by H3K4 methylation.
- Operational Value: Enables biological de-risking through spatial resolution of DNA damage in transcriptionally relevant chromatin regions.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that alter chromatin-dependent DNA damage responses.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream screening by standardizing foci detection and co-localization with epigenetic markers.
- Quantitative Output: Delivers reproducible, imaging-based readouts of γH2AX foci formation and spatial distribution in non-adherent cells.
- Screening Relevance: Supports reliable compound evaluation by enabling high-content analysis of DNA damage in chromatin-contextualized systems.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects early DNA damage signaling to preclinical validation through chromatin-state-specific biomarker alignment.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive value by elucidating how transcriptional activity influences γH2AX spreading post-irradiation.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by revealing disparities in damage repair between euchromatin and heterochromatin.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical assessment, particularly for genotoxic compound screening and mechanistic follow-up.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing spatial patterns of DNA damage relative to transcriptional activity.
- Screening: Enhances assay reproducibility and quantitative foci measurement for compound effect evaluation.
- Analytics: Provides integrated intensity and spatial distribution data enabling comparative condition analysis.
- Translational Research: Links to preclinical continuity via epigenetic biomarker alignment in radiation response models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis platform for chromatin-contextualized DNA damage studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in DNA damage localization.
- Operational Value: Delivers standardization, reproducibility, and scalability in foci quantification and co-localization analysis.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions, capital efficiency, and reduces late-stage biological risk in genotoxicology programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on chromatin-dependent DNA damage and repair phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence, confocal microscopy, and epigenetic marker detection.
- Dependent on instrumentation for 3D reconstruction, line scan analysis, and threshold-based image processing.
- Necessitates cross-team standardization for antibody validation, imaging parameters, and foci counting protocols.
- Involves adaptation considerations across cell types, particularly non-adherent and primary cell models.
- Practical limitations include signal resolution for sub-micrometer foci and potential bleaching during multi-channel acquisition.
