Name: Evaluatie van de ruimtelijke verdeling van γH2AX volgende ioniserende straling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Leer de ruimtelijke verdeling van γH2AX foci na ioniserende straling analyseren met immunofluorescentie en 3D-reconstructie. Deze methode helpt onderzoekers DNA-schade en epigenetische veranderingen in celkernen te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De steun van het Australian Institute of Nuclear Science and Engineering wordt erkend. TCK was de ontvanger van AINSE awards. Epigenomisch Medicine Lab wordt ondersteund door de National Health en Medical Research Council van Australië (566.559). Dit werk wordt gefinancierd door het CRC for Biomedical Imaging Development Ltd, opgericht en ondersteund door Cooperative de Australische regering s Research Centres (CRC)-programma. LM wordt ondersteund door Melbourne Research (Universiteit van Melbourne) en Biomedical Imaging CRC aanvullende beurzen. De ondersteuning van Monash Micro Imaging (Drs Stephen Cody en Iska Carmichael) was van onschatbare waarde voor dit werk.

Celpreparaat <ol><li> Menselijke erythroleukemic K562 cellen worden gekweekt in RPMI-1640 medium aangevuld met 10% (v / v) foetaal runderserum en 20 mg / ml gentamicine in een bevochtigde 5% CO 2-omgeving bij 37 ° C. </li><li> Ongeveer 18 uur voorafgaand aan de kleuring wassen exponentieel groeiende cellen (optimaal bij 5 x 10 5 cellen / ml) met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), opnieuw in suspensie in verse media en terug te keren naar 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Was de cellen twee keer met PBS door centrifugeren bij ongeveer 1500 rpm gedurende 5 minuten en resuspendeer in verse media. </li><li> Tellen cellen en stel de celdichtheid tot ongeveer 5 x 10 5 cellen / ml. </li></ol> Cellen kunnen worden geteld door een geautomatiseerde methode (bijvoorbeeld Sysmex of Coulter counter met filter grootte van tussen de 5 tot 20 micron) of met behulp van de trypan blauw uitsluiting methode en een hemocytometer. Extra aantal cellen (&gt; 800 cellen / cm 2) kan leiden tot niet-uniforme vlekken. Bestraling en immunofluorescentiekleuring <ol><li> Monteer Cytospin clips, filter-kaarten en dia's met de juiste etikettering. </li></ol> Bij het monteren van de Cytospin apparaat ervoor te zorgen dat het gat in de filter-kaart valt samen met de trechter. <ol start="2"><li> Expose cellen om ofwel γ-straling of X-stralen (2Gy in dit voorbeeld). </li></ol> Om te voorkomen dat de vorming van foci tijdens de bestraling, houden de cellen op ijs gedurende 5 tot 10 minuten voorafgaand aan en tijdens de bestraling. Na bestraling Incubeer de cellen bij 37 ° C, 5% CO 2 voor de vereiste tijd (voor piek-γH2AX levels 30 minuten tot 1 uur, 1 uur in dit voorbeeld). <ol start="3"><li> Twee keer Was de cellen met koude PBS door centrifugeren en resuspendeer in verse PBS. </li><li> Verdeel 100 tot 150 pi van de celsuspensie in elk Cytospin trechter en draaien op 500 rpm gedurende 5 minuten. </li><li> Scheid de dia's van cytospins en laat de cellen tot matig droge lucht voor ongeveer 15 minuten. </li></ol> Niet laten cellen volledig droog als cellulaire morfologie kunnen desintegreren. <ol start="6"><li> Teken een cirkel rond de cellen met een hydrofobe pen. </li><li> Fix cellen met 4% paraformaldehyde gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT). </li></ol> In onze ervaring, fixatie met paraformaldehyde superieur is aan de bevestiging met ethanol of methanol. Suspensie-cellen nodig fixatie gedurende 5 minuten bij RT terwijl langere fixatietijden (15 tot 20 minuten) zijn nodig voor een optimale fixatie van het aanklevende cellen. We vinden dat de vlekken onmiddellijk betere resultaten oplevert dan het opslaan van de vaste dia's bij -20 ° C, die doorgaans resulteert in hoge achtergrond fluorescentie. <ol start="8"><li> Twee keer wassen van de cellen met PBS gedurende 5 minuten elk. </li><li> Permeabilize de cellen met 0,1% Triton-X 100 bij RT gedurende 5 minuten. </li></ol> In vergelijking met Tween-80 hebben we meestal beter kijken signalen in cellen gepermeabiliseerd met Triton-X 100. Afhankelijk van het celtype kan het nodig zijn om de permeabilisation tijd te wijzigen. Bijvoorbeeld, in K562 cellen permeabilisatie gedurende 5 minuten bij RT voldoende is terwijl in hechtende cellen een 15 minuten permeabilisatie is vereist. <ol start="10"><li> Was de cellen drie keer met PBS gedurende 5 minuten elk. </li><li> Blok cellen in 1% BSA voor 30 minuten (3 x 10 minuten) bij RT. </li></ol> We vergeleken het blokkeren efficiëntie met serum (afgeleid van dezelfde soort als de secundaire antilichamen) en runder serum albumine in PBS. BSA efficiënter was in het minimaliseren van niet-specifieke binding van secundaire antilichamen in vergelijking met serum. We vergeleken verschillende blokkeren tijden, 's nachts blokkeren bij 4 ° C in vergelijking met 3 x 10 minuten en 3 x 20 minuten te blokkeren stappen bij kamertemperatuur, en bepaald dat het blokkeren van voor 3 x 10 minuten optimaal was. <ol start="12"><li> Voeg 50 ul van de primaire antilichaam (1: 500 verdund in 1% BSA) aan elke dia. </li></ol> Incubatie met de primaire antistof bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten resulteert in een verminderde achtergrondkleuring in vergelijking met een overnacht incubatie bij 4 ° C. <ol start="13"><li> Om vlek verschillende merkers tegelijk gebruiken antilichamen die zijn opgewekt in verschillende soorten (bijvoorbeeld een muis anti-γH2AX en konijn anti-gemethyleerde H3K4 in dit voorbeeld). </li><li> Incubeer met primaire antilichamen gedurende 90 minuten bij KT op een schommelende platform bij 250 rpm. </li></ol> Alle incubaties worden uitgevoerd in een vochtige vlekken trog. <ol start="15"><li> Was de cellen drie keer met PBS gedurende 5 minuten elk. </li><li> Voeg 50 ul van (1: 1000 verdund in 1% BSA) secundair antilichaam aan elke dia. </li></ol> Om vlek voor de verschillende markeringen op dezelfde dia te gebruiken secundaire antilichamen met dAllerlei mensen soortspecificiteit (volgens de primaire antilichaam) en fluorescentie-emissie golflengte (bijv. anti-muis Alexa 488 (groen) en anti-konijn Alexa-546 (rood) in dit voorbeeld). <ol start="17"><li> Incubeer cellen gedurende 60 minuten bij RT op een schommelende platform bij 250 rpm. </li></ol> Het wordt aanbevolen om cellen te incuberen in een donkere vochtige kamer om te voorkomen dat vervagen en drogen van het secundaire antilichaam. <ol start="18"><li> Was de cellen drie keer met PBS gedurende 5 minuten elk. </li><li> Voeg 50 ul van (1:500 verdund in PBS) TOPRO-3 aan elke dia. </li><li> Was de dia's met PBS voor 3x 5 minuten. </li><li> Overmaat aan vocht verwijderen uit dia's en voeg anti-fade oplossing. </li></ol> Het wordt aanbevolen niet naar de cellen drogen voor het toevoegen van anti-fade oplossing. <ol start="22"><li> Dekglaasje, afdichting met nagellak en laat dia's 's nachts in het donker bij kamertemperatuur. </li></ol> Het wordt aanbevolen om confocale specifieke dekglaasjes # 1.5 (0.16 tot 19 micron dik) en heldere nagellak te gebruiken. Terwijl het plaatsen van de dekglaasje op dia, moet ervoor worden getroffen om de vorming van luchtbellen te voorkomen. Beeldacquisitie <ol><li> Een Zeiss LSM510 Meta confocale microscoop wordt gebruikt om beelden met behulp van de standaard GFP (groen, 488 nm), PI (rood 543 nm) en ver rood (blauw 633 nm) lasers te verwerven. </li></ol> Beelden die met behulp van een confocale microscoop zichtbaar betere ruimtelijke resolutie. Aangezien de grootte van γH2AX foci kan lager zijn dan 0,5 μicrons, is het raadzaam om beelden te verwerven met ten minste een 0,5 μicron stapgrootte langs de Z-as. Een 63 x olie-immersie objectief heeft de voorkeur ten opzichte van een hogere of lagere vergroting. Voor beeldvorming van veel cellen voor het tellen van foci is het beter het gebruik van een scansnelheid van 8 en beeldgrootte van 1024 x 1024 pixels. Ter illustratie van de ruimtelijke relatie tussen de verschillende nucleaire eiwitten is het raadzaam om een ​​scan snelheid van 6 te gebruiken met beeldgrootte van 2048 x 2048 pixels. Bij de beeldvorming van meerdere kanalen een line scan overname wordt aanbevolen ten opzichte van een frame te scannen. Dit voorkomt bleken en een betere resolutie wordt bereikt. Sequentiële scanning wordt gebruikt om te bloeden te voorkomen door tussen de kanalen. Foci tellen Beeldanalyse en haarden geteld kan worden uitgevoerd met behulp van diverse software pakketten (onder wie Metamorph, Beeld-J en Imaris). De procedure voor het tellen van brandpunten gebruiken Metamorph wordt hier beschreven. <ol><li> Open γH2AX image stacks rechtstreeks vanuit het menu Bestand of met behulp van het buildnummer stacks optie. </li><li> Ga naar het menu Proces en koos stack rekenen. </li><li> Kies Maximale projectie en selecteer de vliegtuigen die moeten worden opgenomen en klik op OK. </li><li> Sla het resulterende beeld als een γH2AX Tiff. bestand en open de TOPRO-3 (blauw) afbeelding. </li><li> Ga naar de regio's en selecteer een regio tekengereedschap en teken de regio's rond kernen. </li><li> Klik op de γH2AX Tiff afbeelding en ga naar proces-menu en selecteer morfologische filters. </li><li> Kies Top-Hat en selecteer γH2AX beeld als een bron beeld. </li><li> Van toepassing zijn Top-Hat-filter en de resulterende beeld zal een binair beeld met minder ruis en minder variatie in de haarden intensiteit. </li></ol> Voorzichtigheid is geboden bij het kiezen van Top-Hat waarden. Optimale waarden kunnen worden verkregen door visuele vergelijking van beelden voor en na het toepassen van filters. <ol start="9"><li> Ga naar het proces-menu en selecteer drempel beeld. </li><li> Kies inclusief drempel en selecteer de lagere en hogere drempelwaarden. </li></ol> Het is meestal de drempel waarden die foci nummer beïnvloeden. Daarom is veel aandacht nodig bij het selecteren van drempelwaarden. Dit kan het beste worden bereikt door het tellen van brandpunten nummer met behulp van verschillende drempelwaarden in de cellen blootgesteld aan minder dan 2 Gy γ-straling en vervolgens foci cijfers vergelijken met de handmatige telling (per oog). De optimale drempelwaarde is degene die het opnemen van achtergrond minimaliseert en maximaliseert de inclusie van foci. <ol start="11"><li> Kies de TOPRO-3 afbeelding en ga naar de regio's menu en selecteer de overdracht regio optie. Selecteer de bron beeld als TOPRPO-3 en de bestemming als Top-Hat en klik op OK. </li><li> Zodra de nucleaire regio's worden overgebracht naar de Top-Hat afbeelding gaat u naar de maatregel menu en selecteer Integrated morfometrie Analysis. </li><li> In het pop-up venster te selecteren bronafbeelding-Top-Hat en meet per gebied. </li><li> Selecteer meten alle regio's en klik op maat om de brandpunten nummer te verkrijgen in alle kernen van de overeenkomstige in de Top-Hat beeld. </li><li> De brandpunten cijfers van elke regio kunnen worden geëxporteerd naar een MS-Excel-bestand met behulp van de log-data optie. </li></ol> 3Dde reconstructie van beelden Voor het maken van een 3D-beeld van een stapel met Metamorph: <ol><li> Ga naar de stapel menu en kies 3D-reconstructie. </li><li> Selecteer de hoek van de rotatie (bijvoorbeeld 160 °, 320 °). </li><li> Selecteer de 3D-reconstructie type-maximum. </li><li> Kies het vlak van rotatie (horizontaal of verticaal). </li><li> Koos voor de Z-kalibratie afstand. </li></ol> Het is beter om de gebruiker opgegeven gebruik van Z-afstand (optimaal is 0,5 μicrons). <ol start="6"><li> Kies OK om een ​​3D-reconstructie te maken. </li></ol> Lijn scan analyse Voor de line scan analyse met behulp van Metamorph: <ol><li> Open ofwel een enkel vlak afbeelding of een gestapelde bestand. </li><li> Ga naar de maatregel werkbalken opdracht en selecteer line scan analyse. </li><li> Teken een lijn over de cel en dit zal de fluorescentie-intensiteit en de afstand van elke merkdraad automatisch laten zien langs het pad van de lijn. </li></ol> Licht te werpen op de ruimtelijke relatie van de verschillende chromatine markers, bijvoorbeeld, γH2AX foci en histon-methylatie, is het beter om lijnen die de regio's die zowel dicht en armen in deze merkers omvatten trekken. Representatieve gegevens Voor de toepassing van deze demonstratie gebruikten we antilichamen tegen γH2AX foci en H3K4me, om de ruimtelijke verdeling van de DSB's evalueren om een ​​epigenetische determinant van actief transcriberen euchromatin. Zoals weergegeven in figuur 1, na bestraling met 2Gy, γH2AX brandpunten gevormd voornamelijk in regio's die saai waren voor zowel de H3K4me kleuring en voor de DNA vlek TOPRO-3 (fel gekleurde DNA-regio's zijn een indicatie van heterochromatine). <img src="/files/ftp_upload/2203/2203fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. ΓH2AX foci vorm voornamelijk in euchromatin in reactie op ioniserende straling. (A) Immunofluorescentie visualisatie van γH2AX foci (groen) in menselijke erythroleukemic K562 cellen, 1 uur na γ-bestraling (2 Gy). γH2AX foci worden getoond in relatie tot H3K4me, die actief transcriptie euchromatin (rood). DNA wordt gelabeld met TOPRO-3 (blauw). De samengevoegde afbeelding (blauw, rood en groen) toont de uitsluiting γH2AX brandpunten van heterochromatic regio's. De lijn scan analyse (fluorescentie-intensiteit versus afstand) geeft de relatieve verdeling van de markers in een enkel vlak. (B) Slices op verschillende vlakken van de 3D-reconstructie van de samengevoegde afbeelding hierboven beschreven.

<ol><li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J Cell Biol. 146 (5), 905-916 (1999).</li>
<li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-stranded+breaks+induce+histone+H2AX+phosphorylation+on+serine+139%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139.</a> J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).</li>
<li>Bonner, W. M. Nat Rev Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).</li>
<li>Dickey, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX%3A+functional+roles+and+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">H2AX: functional roles and potential applications.</a> Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).</li>
<li>Kim, J. A., Kruhlak, M., Dotiwala, F., Nussenzweig, A., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochromatin+is+refractory+to+gamma-H2AX+modification+in+yeast+and+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Heterochromatin is refractory to gamma-H2AX modification in yeast and mammals.</a> J Cell Biol. 178 (2), 209-218 (2007).</li>
<li>Cowell, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gammaH2AX+foci+form+preferentially+in+euchromatin+after+ionising-radiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">gammaH2AX foci form preferentially in euchromatin after ionising-radiation.</a> PLoS One. 2 (10), e1057-e1057 (2007).</li>
<li>Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., &amp, I. liakis, G, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-H2AX+in+recognition+and+signaling+of+DNA+double-strand+breaks+in+the+context+of+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Gamma-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin.</a> Nucleic Acids Res. 36 (17), 5678-5694 (2008).</li>
<li>Vasireddy, R. S., Karagiannis, T. C., El-Osta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gamma-radiation-induced+gammaH2AX+formation+occurs+preferentially+in+actively+transcribing+euchromatic+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">gamma-radiation-induced gammaH2AX formation occurs preferentially in actively transcribing euchromatic loci.</a> Cell Mol Life Sci. 67 (2), 291-294 (2010).</li>
<li>Goodarzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATM+signaling+facilitates+repair+of+DNA+double-strand+breaks+associated+with+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">ATM signaling facilitates repair of DNA double-strand breaks associated with heterochromatin.</a> Mol Cell. 31 (2), 167-177 (2008).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Roswell Park Memorial Institute -1640 (RPMI-1640)</td><td>Groeimedium</td><td>Invitrogen</td><td>22400071</td><td>RPMI-1640, pH 7,4 medium aangevuld met 10% (v/v) foetaal kalfserum, 2mM L-glutamine, 20&amp;#x03BC;g/ml gentamicine, 20mM (HEPES) N-2-hydroxyethylpiperazine-N&amp;rsquo;-2-ethaansulfonzuur</td></tr><tr><td>Foetaal kalfserum (FBS)</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Bovien serumalbumine (BSA)</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>BSA (1%) wordt gebruikt om aspecifieke antilichaambinding te blokkeren. Primaire en secundaire antilichamen worden verdund in BSA.</td></tr><tr><td>PBS (zonder Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; en Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;)</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>17-517Q</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblauw</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6146</td><td>Gebruikt om onderscheid te maken tussen levende en dode cellen.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Triton X-100 (0,1%) gebruikt om cellen te permeabiliseren.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td>Paraformaldehyde (4%) gebruikt om cellen te fixeren.</td></tr><tr><td>Muis monoklonaal anti-fosfo histone-H2AX antilichaam</td><td>Primair antilichaam</td><td>EMD Millipore</td><td>16193</td><td>Verdunning van primair antilichaam (1:500), in 1% BSA.</td></tr><tr><td>Histon H3 (mono-methyl K4)</td><td>Primair antilichaam</td><td>Abcam</td><td>AB8895</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 geit anti-muis IgG (H+L)</td><td>Secundair antilichaam</td><td>Invitrogen</td><td>11029</td><td>Verdunning van secundair antilichaam (1:500), in 1% BSA.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 geit anti-konijn IgG (H+L)</td><td>Secundair antilichaam</td><td>Invitrogen</td><td>11035</td><td></td></tr><tr><td>TOPRO3</td><td>DNA-kleurstof</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td>TOPRO3 is een DNA-kleurstof met een Abs/Em van 642/661 nm. DAPI kan worden gebruikt indien de confocale microscoop is uitgerust met een 405 nm laser.</td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Anti-fade oplossing</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td>Dit op glycerol gebaseerde instreekmedium moet worden gebruikt met een olie-immersie-lens die overeenkomt met de brekingsindex.</td></tr><tr><td>Polylysine-objectglazen</td><td></td><td>Menzel-Glaser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dekglasplaatjes (22x50mm)</td><td>Dekglasplaatjes</td><td>Menzel-Glaser</td><td>CS2250100</td><td></td></tr><tr><td>Weefselkweekfles, geventileerde dop</td><td>Kweekfles</td><td>BD Biosciences</td><td>353112</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Cytospin 4</td><td></td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytofunnels</td><td></td><td>Shandon, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filterkaarten</td><td></td><td>Shandon, Inc.</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>Coplin-pot, glas</td><td></td><td>Grale Scientific P/L</td><td>1771-OG</td><td></td></tr><tr><td>Kleuringsbak</td><td></td><td>Grale Scientific P/L</td><td>V1991.99</td><td></td></tr><tr><td>PAP-pen</td><td></td><td>Zymed Laboratories, Inc.</td><td>008877</td><td></td></tr><tr><td>Gammacell 1000 Elite irradiator</td><td>Gamma-irradiator</td><td>Nordion International Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 510 Meta Confocal</td><td>Confocale microscoop</td><td></td><td></td><td>Uitgerust met 3 lasers: 488 nm, 543 nm en 633 nm.</td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>Software voor beeldanalyse</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

evaluatie van de ruimtelijke verdeling van γh2ax volgende ioniserende straling

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

Een vroege moleculaire respons op DNA dubbel-breuken (DSB) is fosforylering van de Ser-139 residu in de terminal SQEY motief van de histon H2AX 1,2. Deze fosforylatie van H2AX wordt gemedieerd door de fosfatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) familie van eiwitten, ataxie telangiectasia gemuteerd (ATM), DNA-eiwit kinase katalytische subeenheid en ATM en RAD3-gerelateerde (ATR) 3. De gefosforyleerde vorm van H2AX, aangeduid als γH2AX, verspreidt naar aangrenzende regio&#39;s van chromatine van de site van de DSB, de vorming van discrete foei, die makkelijk kunnen worden gevisualiseerd door immunofluorecence microscopie 3. Analyse en kwantificering van γH2AX foci is op grote schaal gebruikt om de DSB vorming en reparatie, in het bijzonder in reactie op ioniserende straling en voor het evalueren van de effectiviteit van verschillende straling wijzigen verbindingen en cytotoxische verbindingen 4 te evalueren. Gezien de uitstekende specificiteit en gevoeligheid van deze de novo marker van DSB, heeft zij nieuwe inzichten in de processen van DNA-schade en herstel in het kader van chromatine. Bijvoorbeeld, in de biologie straling van de centrale paradigma is dat de kern-DNA is de kritische doelgroep met betrekking tot de stralingsgevoeligheid. Inderdaad, de algemene consensus in het veld grotendeels aan chromatine te zien als een homogene sjabloon voor DNA-schade en reparatie. Echter, met het gebruik van γH2AX als moleculaire marker van DSB&#39;s, een ongelijkheid in γ-straling-geïnduceerde γH2AX brandpunten vorming in euchromatin en heterochromatine waargenomen 5-7. Onlangs hebben we gebruik gemaakt van een panel van antilichamen tegen zowel mono-, di-of tri-gemethyleerd histon H3 op lysine 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3), die epigenetische sporen van constitutieve heterochromatine en transcriptionele zwijgen en lysine 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3 ), die nauw gecorreleerd actief transcriberen euchromatic regio&#39;s, de ruimtelijke verdeling van γH2AX onderzoeken volgende ioniserende straling 8. In overeenstemming met de heersende ideeën over chromatine biologie, onze bevindingen wezen op een nauwe correlatie tussen de γH2AX vorming en actieve transcriptie 9. Hier laten we zien onze immunofluorescentie methode voor de detectie en kwantificering van γH2AX foci in niet-hechtende cellen, met een bijzondere nadruk op co-lokalisatie met andere epigenetische merkers, beeldanalyse en 3D-modellering.

Microscopische analyse van γH2AX foei, welke vorm na de fosforylatie van H2AX op Ser-139 in reactie op DNA dubbelstrengs breuken, is uitgegroeid tot een onmisbaar instrument in straling biologie. Hier hebben we gebruik gemaakt van een antilichaam aan mono-gemethyleerde histon H3 op lysine 4 als een epigenetische marker van actief transcriberen euchromatin, om de ruimtelijke verdeling van de straling-geïnduceerde γH2AX formatie binnen de kern te evalueren.

Evaluatie van de ruimtelijke verdeling van γH2AX volgende ioniserende straling

Een vroege moleculaire respons op DNA-dubbelstrengsbreuken (DSB's) is de fosforylering van het Ser-139-residu binnen het terminale SQEY-motief van het histon ...

Hallo, ik ben Raja Ti en ik promoveer aan het Baker IDI Heart and Diabetes Institute. Ik zal u door de stappen leiden die betrokken zijn bij de 3D-illustratie van epigenetische modificaties die DNA-schade en chromatinecondensatie in een nieuwe hartcel markeren. DNA is gewikkeld rond nucleosomen.Elk nucleosoom bestaat uit vier verschillende typen histonen: H2A, H2B, H3 en H4. De vorming van DNA-breuken wordt gemarkeerd door fosforylering van H2AX. Deze fosforylering van H2AX vindt voornamelijk plaats in chromatine dat is gemarkeerd door methylering van H3K4. We bekijken nu de 3D-illustratie van modificaties in een cel met immunolabeling voor gefosforyleerd H2AX en gemethyleerd H3K4.Laten we beginnen. We starten door een hoeveelheid van de cel-suspensie in 15 ml Falcon-buizen te plaatsen. Deze worden twee keer gewassen met PBS door centrifugatie bij 50 g en vervolgens opnieuw geresuspendeerd.Resuspendeer in vers medium om het onmiddellijke effect van straling op cellulaire processen te observeren. Houd de cellen vijf tot 10 minuten voor en tijdens de bestraling op de ogen. Stel de cellen bloot aan gamma-straling of röntgenstraling. Dispenseer na bestraling drie milliliters van de celsuspensie in elk van de zes GU's.Wellplaat voor piek gamma H2AX; incubeer de cellen tussen 30 minuten en één uur bij 37 °C. We gebruiken de Cytospin voor het plaatsen van de niet-adherente cellen op glasplaatjes. Let bij het monteren van de Cytospin-clip erop dat de gehele filterkarton samenvalt met de trechter.Breng 50 µL van deze cel-suspensie aan op elk cytospin-filter, plaats de cytospin-filters in de centrifuge en centrifugeer 5 minuten bij 500 RPM. Verwijder de cytospin-filters en scheid de objectglazen van de filterkaart. Laat de cellen niet te lang aan de lucht drogen, aangezien dit de achtergrond bij de fluoresceïne-kleuring kan beïnvloeden.Met behulp van vloeistofblokkerende pennen trekken we cirkels rond elke uitstrijk. Vervolgens fixeren we de cellen met 4% paraformaldehyde bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. In vergelijking met ethanol of methanol werd een betere fixatie waargenomen met 4% paraformaldehyde. De slides worden gewassen met PBS en de cellen worden gepermeabiliseerd met Triton X 100 bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten.Vergeleken met twin 80 observeerden we een beter signaal in cellen met Triton X 100. Bekijk de cellen drie keer met PP S3 gedurende vijf minuten per keer. Blokkeer de cellen in één procent BSA gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en herhaal dit drie keer in vergelijking met andere blokkeringsmiddelen en tijden.BSA was het meest effectief in het minimaliseren van aspecifieke binding van primaire antilichamen; we hebben twee primaire antilichamen gebruikt, verdund 1 op 500 met 1% BSA, met ongeveer 50 µL primair antilichaam per objectglas. Incubatie van het primaire antilichaam bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten vermindert de achtergrondkleuring in vergelijking met een incubatie gedurende de nacht bij 4 °C. Was de cellen drie keer met PBS gedurende vijf minuten.Alexa floor 4 88, goede anti-muis en Alexa floor 5 46 word anti-konijn. Secundaire antilichamen werden gebruikt om verschillende markers gelijktijdig te labelen. Gebruik antilichamen die zijn geproduceerd in verschillende diersoorten.Voeg ongeveer 50 µL van het verdunde secundaire antilichaam toe aan elk objectglas. Incubeer de cellen gedurende 90 minuten bij kamertemperatuur. Het wordt aanbevolen om de cellen in een vochtige kamer te incuberen om te voorkomen dat de cellen en het antilichaam uitdrogen. Was de objectglazen 3 keer gedurende vijf minuten met PBS.50 µL van een 1:500 verdunning van topo drie in PBS werd aan elke slide toegevoegd. Was de slides drie keer met PBS, telkens gedurende vijf minuten. Verwijder overtollig vocht van de slides en voeg de Antifa-oplossing toe.Het wordt aanbevolen om de cellen niet volledig te laten uitdrogen voordat de Antifa-oplossing wordt toegevoegd. Plaats een dekglas op het preparaatglas. Er moet zorg worden betracht om de vorming van luchtbellen te voorkomen.Laat de preparaten een nacht in een donkere, vochtige kamer liggen. Seal het preparaat met nagellak om uitdroging van de cellen te voorkomen. Beelden verkregen met een confocale microscoop tonen.Voor een betere ruimtelijke resolutie werd een heliumlaser gebruikt voor de beeldacquisitie. Voor de objectieven werd gekozen voor 63x olie-immersie lenzen in plaats van lenzen met een hogere of lagere vergroting. Een zoomfactor van drie of vier zal een beeld met een betere resolutie opleveren.Voor FO-accounting van veel cellen is het bij voorkeur gebruik te maken van een scansnelheid van acht en een beeldformaat van 1024 bij 1024 pixels per cel. Bij beeldvorming voor meerdere kanalen wordt een sequentiële line-scan acquisitie aanbevolen ten opzichte van een frame-scan. Om bleking van het specimen te voorkomen, worden de detectorversterking (gain) en de amplifier offset aangepast om ruis en signaalverzadiging te verminderen.Aangezien de grootte van Kama HX X four kleiner kan zijn dan 0,5 micrometer, wordt aangeraden om beelden te verkrijgen met een resolutie van ten minste 0,5 micrometer. Beelden met een stapgrootte langs de jet-as zijn vereist in een jet-seriepatroon met gebruik van het 'mark first' en 'mark lost' patroon. Om de ruimtelijke relatie tussen verschillende eiwitten te illustreren, wordt aangeraden om een scansnelheid van zes te gebruiken met een beeldgrootte van 2048 en 248 pixels middels metamor first.Ten tweede kan er worden geteld vanaf beelden die zijn verkregen met diverse confocale microscopen. Open de gamma hgx-afbeeldingsbestanden ofwel direct via het bestandsmenu of door gebruik te maken van de referentienummers. Ga naar het procesmenu en kies Stack arithmatic.Kies maximum projectie en selecteer de vlakken die moeten worden opgenomen. Klik vervolgens op oké. Kies nu top hat en selecteer het Gamma H twee X-beeld als bronbeeld en pas dit toe.Het top hat-filter en de resulterende afbeelding zullen een binaire afbeelding zijn met minder ruis en een verminderde variatie in de intensiteit van de brandpunten. Ga naar regio's, selecteer de tool voor het tekenen van regio's en teken regio's rond de kernen. Ga naar het procesmenu en selecteer drempelwaarde afbeelding.Kies de inclusiedrempel en stel de lagere en hogere drempelwaarden in. Meestal zijn het de drempelwaarden die de vier getallen beïnvloeden. De optimale drempelwaarde is degene die de inclusie van de achtergrond minimaliseert en de inclusie van de foray maximaliseert.Dit kan het beste worden bereikt door het aantal forays te tellen met behulp van verschillende drempelwaarden. Vergelijk vervolgens het aantal forays met de telling met het blote oog. Selecteer de DPI-afbeelding, ga naar het menu regio's en selecteer de optie regio's overdragen.Nu hebben we de overeenkomstige foray- en kernbeelden gereed voor het tellen. De meeste kernregio's zijn overgebracht naar top hat. Ga naar het menu 'Measure' en selecteer 'integrated ary analysis' of 'IMA'. Selecteer 'Measure all regions' en klik op 'measure' om het FTE-aantal te verkrijgen.Nu kunnen de FTE-getallen van elke regio naar een spreadsheet worden geëxporteerd via de optie 'Log data'. Open de eerder gemaakte jet-projectorafbeeldingen voor elk kanaal. Ga naar 'display' en selecteer 'color align'.Selecteer de respectievelijke bronafbeeldingen voor elk kanaal om een samengestelde afbeelding voor alle drie de kanalen te maken. Er wordt een line scan-analyse uitgevoerd om de ruimtelijke positionering van verschillende markers in de kern te illustreren. Ga naar het commando in de meetwerkbalken en selecteer line scan-analyse en trek een lijn over de cel.Hiermee wordt een grafiek gemaakt die de fluorescentie-intensiteit van elk kanaal langs de lijn toont en de afstand tussen de verschillende markers ten opzichte van elkaar weergeeft. Om een 3D-beeld uit een stack te maken, gaat u naar het stack-menu en kiest u 3D reconstruction. Selecteer als type 3D-reconstructie maximum.Kies het rotatieplan en kies de kalibratieafstand van de jet. Gewoonlijk specificeert de gebruiker dit en klikt vervolgens op oké om een 3D-reconstructie te maken. Hiermee is ons protocol voor immunofluorescentiekleuring en beeldanalyse voltooid.Samenvattend is confocale immunofluorescentiemicroscopie een techniek voor de driedimensionale visualisatie van verschillende C-markers en gamma H2AX-foci in de celkern. Bedankt voor het kijken.

evaluation-spatial-distribution-h2ax-following-ionizing

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Kwantificering van DNA dubbel-strengs strepen met behulp van γH2AX vorming als een moleculaire marker is uitgegroeid tot een onmisbaar instrument in straling biologie. Hier laten we zien het gebruik van een immunofluorescentie assay voor de kwantificering van γH2AX foci na blootstelling van cellen aan straling.

Kwantificering van γH2AX Foci in reactie op ioniserende straling

Kwantificering van DNA dubbelstrengs breuken aan de hand van γH2AX foci is uitgegroeid tot een instrument van onschatbare waarde, met name in de biologie straling, voor de evaluatie van weefsel stralingsgevoeligheid en de effecten van de straling wijzigen van verbindingen. Hier laten we zien het gebruik van een immunofluorescentie test voor kwantificatie van γH2AX foci in weefselmonsters.

Kwantificatie van γH2AX Foci in weefselmonsters

Een protocol om veranderingen in DNA-schadeniveaus en DNA-reparatievermogen te evalueren die kunnen worden geïnduceerd door chronische in vivo lage dosis bestraling in muis miltlymfocyten, door gemeten gefosforyleerd histon H2AX, een marker voor DNA-dubbelstrengsbreuken, met behulp van flowcytometrie wordt gepresenteerd.

Het meten van DNA-schade en herstel in Mouse Splenocyten Na Chronische<em&gt; In Vivo</em&gt; Blootstelling aan zeer lage doses van bèta en gamma-straling

Dit manuscript biedt een protocol voor de analyse van DNA dubbele-strand einden door immunofluorescentie microscopie van γH2AX en 53BP1.

Immunofluorescentie microscopie van γH2AX en 53BP1 voor het analyseren van de vorming en de reparatie van DNA dubbele-strand einden

Reparatie van dubbele streng DNA pauzes is een dynamisch proces, waarbij niet alleen de vorming van reparatie complexen in de pauzes, maar ook hun resolutie na de laesie is gericht. Hier, gebruiken we immunofluorescentie microscopie voor voorbijgaande en langdurige double-stranded pauzes als een instrument om te ontleden dit genoom onderhoud mechanisme.

Karakterisering van de DNA-herstelsynthese op Transiënten- en Long-lasting Double-streng DNA-einden door immunofluorescentie microscopie

De gepresenteerde methode combineert de kwantitatieve analyse van DNA Double-strand Breaks (DSBs), celcyclus verdeling en apoptosis om de celcycluspecifieke evaluatie van de inductie en reparatie van DSB mogelijk te maken, evenals de gevolgen van herstel fouten.

Celcyclus-specifieke meting van γH2AX en apoptosis na genotoxische stress door flow Cytometrie

Na DNA-schade activeren menselijke cellen essentiële hersteltrajecten om de integriteit van hun genoom te herstellen. Hier beschrijven we de methode van indirecte immunofluorescentie als een middel om DNA-hersteleiwitten te detecteren, hun ruimtelijke en temporele rekrutering te analyseren en de eiwitinteractie op de sites van DNA-schade te helpen ondervragen.

Visualisatie van DNA Repair Proteins Interaction door Immunofluorescentie

Dit artikel introduceert essentiële stappen van immunostaining en chromatine immunoprecipitatie. Deze protocollen worden vaak gebruikt om DNA-schadegerelateerde cellulaire processen te bestuderen en om de rekrutering van eiwitten die betrokken zijn bij DNA-reparatie te visualiseren en te kwantificeren.

Visualiseren en kwantificeren van endonuclease-gebaseerde site-specifieke DNA-schade

Dit protocol presenteert de diavoorbereiding en geautomatiseerde scoring van de γ-H2AX foci assay op perifere bloedlymfocyten. Om de methode en gevoeligheid van de test te illustreren, werden geïsoleerde lymfocyten in vitrobestraald . Deze geautomatiseerde methode van DNA DSB-detectie is nuttig voor snelle en high-throughput biologische dosimetrietoepassingen.

Een geautomatiseerde microscopische scoringsmethode voor de γ-H2AX foci assay in menselijke perifere bloedlymfocyten

Dit protocol presenteert een methode om de vorming en reparatie van DNA-dubbelstrengsbreuken te beoordelen door de gelijktijdige detectie van γH2AX- en 53BP1-foci in interfasekernen van met bleomycine behandelde menselijke perifere lymfocyten.

Dubbele immunofluorescentie van γH2AX en 53BP1 in humane perifere lymfocyten

Hier presenteren we een eenvoudig en snel protocol voor de detectie van eiwitinteractie op DNA-schadeplaatsen.

Nabijheidsligandtest om eiwitten te lokaliseren op plaatsen van DNA-schade

Leer de ruimtelijke verdeling van γH2AX foci na ioniserende straling analyseren met immunofluorescentie en 3D-reconstructie. Deze methode helpt onderzoekers DNA-schade en epigenetische veranderingen in celkernen te bestuderen.

Evaluatie van de ruimtelijke verdeling van γH2AX volgende ioniserende straling

Meer video's verkennen