Evaluatie van de ruimtelijke verdeling van γH2AX volgende ioniserende straling

Hallo, ik ben Raja Ti en ik doe mijn PhD aan het Baker IDI Heart and Diabetes Institute. Ik zal u meenemen door de stappen die betrokken zijn bij de 3D-illustratie van epigenetische modificaties die DNA-schade en chromatinecondensatie in een nieuwe hartcel markeren. DNA is gewonden rond nucleosomen.

Elk nucleosoom bestaat uit vier verschillende typen histonen: H2A, H2B, H3 en H4. De vorming van DNA-breuken wordt gemarkeerd door p-H2AX. Deze p-H2AX komt voornamelijk voor in chromatine dat is gemarkeerd door methylering van H3K4. We bekijken nu de 3D-illustratie van modificaties in uw cel, immunogelabeld met p-H2AX en gemethyleerd H3K4.

Laten we beginnen. We starten door een volume van de celsuspensie in 15 ml Falcon-buizen te plaatsen. Deze worden tweemaal gewassen met PB door centrifugatie bij 50 G en vervolgens geresuspendeerd.

Suspendeer in vers medium om het onmiddellijke effect van straling op cellulaire processen te observeren. Houd de cellen vijf tot 10 minuten voor en tijdens de bestraling op de ogen. Stel de cellen bloot aan gamma-straling of röntgenstraling. Verdeel na de bestraling drie milliliters van de celsuspensie over elk van de zes GU's.

Wellplaat voor piek gamma H2AX; incubeer cellen gedurende 30 minuten tot één uur bij 37 °C. We gebruiken de Cytospin om de niet-adherente cellen op glasplaatjes aan te brengen. Controleer bij het assembleren van de Cytospin-clip of de gehele filterkarton overeenkomt met de trechter.

Dispenseer 50 µL van deze cel-suspensie op elk cytospin-plaatje, plaats de cytospin-plaatjes in de cytospin-centrifuge en centrifugeer 5 minuten bij 500 RPM. Verwijder de cytospin-plaatjes en scheid de preparaten van de filterkaart. Laat de cellen niet te lang aan de lucht drogen, omdat dit de achtergrond bij de fluoresceïne-kleuring kan beïnvloeden.

Met behulp van vloeistofblokkeringspennen tekenen we cirkels rondom elk uitstrijkje, waarna we de cellen vijf minuten bij kamertemperatuur fixeren met 4% paraformaldehyde. In vergelijking met ethanol of olie werd een betere fixatie waargenomen met 4% paraformaldehyde. De objectglaasjes worden vervolgens vijf minuten bij kamertemperatuur gepermeabiliseerd met Triton X 100.

In vergelijking met twin 80 observeerden we een beter signaal in cellen met Triton X 100. Behandel de cellen drie keer met PP S3 gedurende vijf minuten per keer. Blokkeer de cellen in BSA van één persoon gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en herhaal dit drie keer in vergelijking met andere blokkeringsmiddelen en tijden.

BSA was het meest efficiënt in het minimaliseren van aspecifieke binding van primaire antilichamen; we hebben twee primaire antilichamen gebruikt, verdund 1 op 500 met 1% BSA, waarbij ongeveer 50 µL primair antilichaam per objectglas is gebruikt. Incubatie van het primaire antilichaam bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten vermindert de achtergrondkleuring in vergelijking met een overnachttemperatuur van 4 °C. Was de cellen drie keer met PBS gedurende vijf minuten.

Alexa floor 4 88, een goede anti-muis en Alexa floor 5 46 een anti-konijn. Secundaire antilichamen werden gebruikt om verschillende markers gelijktijdig aan te tonen. Gebruik antilichamen die zijn opgewekt in verschillende diersoorten.

Voeg ongeveer 50 µL van het verdunde secundaire antilichaam toe aan elke slide. Incubeer de cellen gedurende 90 minuten bij kamertemperatuur. Het wordt aanbevolen om de cellen in een vochtige kamer te incuberen om uitdroging van de cellen en het antilichaam te voorkomen. Was de slides 3 keer met PBS gedurende telkens vijf minuten.

Voeg 50 µL van een 1:500 verdunning van topo drie in PBS toe aan elke slide. Was de slides drie keer met PBS, telkens gedurende vijf minuten. Verwijder overtollig vocht van de slides en voeg Antifa-oplossing toe.

Het wordt aanbevolen om de cellen niet volledig te laten uitdrogen voordat de Antifa-oplossing wordt toegevoegd. Plaats een dekglas op het preparaatglas. Er moet zorg worden genomen om de vorming van luchtbellen te voorkomen.

Laat de preparaten een nacht rusten in een donkere, vochtige kamer. Seal het preparaat met nagellak om uitdroging van de cellen te voorkomen. Beelden verkregen met een confocale microscoop onthullen.

Voor een betere ruimtelijke resolutie werd een heliumlaser gebruikt voor de beeldverwerving. Een 63 olie-immersie objectief geniet de voorkeur boven lenzen met een hogere of lagere vergroting. Een zoomfactor van drie of vier zal een beeld met een betere resolutie opleveren.

Voor FO-metingen in veel cellen is het bij voorkeur een scansnelheid van acht en een beeldformaat van 1024 bij 1024 pixels per cel te gebruiken. Bij beeldvorming voor meerdere kanalen wordt een sequentiële line-scan acquisitie aanbevolen boven een frame-scan. Om bleken van het preparaat te voorkomen, worden de detectorgain en de amplifier offset aangepast om ruis en signaalsaturatie te verminderen.

Aangezien de grootte van Kama HX X four kleiner kan zijn dan 0,5 µm, wordt aanbevolen om beelden vast te leggen met een resolutie van ten minste 0,5 µm. Beelden met een stapgrootte langs de jet-as zijn vereist in een jet-seriepatroon met het mark-first en mark-lost patroon. Om de ruimtelijke relatie tussen verschillende eiwitten te illustreren, wordt aanbevolen een scansnelheid van zes te gebruiken met een beeldgrootte van 2048 x 2048 pixels met gebruik van metamor-first.

Ten tweede kan er worden geteld vanuit beelden die zijn verkregen op verschillende confocale microscopen. Open de gamma hgx-afbeeldingstags rechtstreeks vanuit het bestandmenu of door gebruik te maken van bill-nummers.Tags. Ga naar het procesmenu en kies Stack arithmatic.

Kies voor maximale projectie en selecteer de vlakken die moeten worden opgenomen. Klik vervolgens op oké. Kies nu voor top hat en selecteer de Gamma H2X-afbeelding als bronafbeelding en pas dit toe.

Het top hat-filter en het resulterende beeld zullen een binair beeld zijn met minder ruis en een verminderde variatie in de intensiteit van de brandpunten. Ga naar 'regio's', selecteer het gereedschap voor het tekenen van regio's en teken regio's rond de kernen. Ga naar het menu 'proces' en selecteer 'drempelwaarde afbeelding'.

Kies de inclusiedrempel en stel de lagere en hogere drempelwaarden in. Meestal zijn het de drempelwaarden die de vier getallen beïnvloeden. De optimale drempelwaarde is degene die de inclusie van de achtergrond minimaliseert en de inclusie van de foray maximaliseert.

Dit kan het beste worden bereikt door het aantal forays te tellen met behulp van verschillende drempelwaarden. Vergelijk vervolgens het aantal forays met de telling door middel van visuele inspectie. Selecteer de DPI-afbeelding, ga naar het menu 'regio's' en selecteer de optie 'regio's overdragen'.

Nu hebben we de corresponderende foray- en kernbeelden klaar voor het tellen. De meeste kernregio's zijn overgebracht naar top hat. Ga naar het menu Measure en selecteer Integrated Ary Analysis of IMA; selecteer 'Measure all regions' en klik op Measure om het FTE-aantal te verkrijgen.

Nu kunnen de FTE-aantallen van elke regio naar een spreadsheet worden geëxporteerd via de optie Log data. Open de eerder gemaakte jet-projectorbeelden voor elk kanaal. Ga naar display en selecteer color align.

Selecteer de respectievelijke bronafbeeldingen voor elk kanaal om een gecombineerde afbeelding voor alle drie de kanalen te maken. Er wordt een line-scananalyse uitgevoerd om de ruimtelijke positionering van verschillende markers in de nucleus te illustreren. Ga naar de opdracht in de meetwerkbalken en selecteer line-scananalyse en trek een lijn over de cel.

Dit creëert een grafiek die de fluorescentie-intensiteit van elk kanaal langs de lijn weergeeft en de afstand van verschillende markers ten opzichte van elkaar representeert. Om een 3D-beeld uit een stack te maken, gaat u naar het stack-menu en kiest u voor 3D-reconstructie. Selecteer als type 3D-reconstructie 'maximum'.

Kies het rotatieplan en bepaal de kalibratieafstand van de jet. Meestal klikt de gebruiker op oké om een 3D-reconstructie te maken. Hiermee is ons protocol voor immunofluorescentiekleuring en beeldanalyse voltooid.

Samenvattend is confocale immunofluorescentiemicroscopie een techniek voor de driedimensionale visualisatie van verschillende C-markers en gamma H2AX-foci in de celkern. Bedankt voor het kijken.