Profilering van de Pre-micro-RNA's en microRNA's met behulp van kwantitatieve real-time PCR (qPCR) arrays

Het algemene doel van deze procedure is om een snelle en betrouwbare geautomatiseerde opzet van QPCR-gebaseerde arrays mogelijk te maken. Dit wordt bereikt door eerst de primersets voor de array voor te bereiden en de monster-mastermixen in te stellen die getest moeten worden. Vervolgens wordt een geautomatiseerde robot-PCR-opstelling of een matrix elektronische pipetsysteem gebruikt om nauwkeurig Eloqua-monstermastermix en primersets in elk putje van een 384-putjesplaat te brengen.

Eenmaal voorbereid, worden de 384-putjes PCR-reacties uitgevoerd met het light cycler four 80 cyber-gebaseerde PCR-programma. De laatste stap van de procedure is om de QPCR-gegevens te analyseren en relatieve expressieniveaus te bepalen voor elke geteste primerpaar, die elk een specifiek mRNA target. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die veranderingen in de expressie van grote sets mRNA's laten zien.

Specifiek ontwikkelde arrays kunnen daarom volledige pre micro RNA-profielen, specifieke paden of moleculen die cruciaal zijn voor virale infectie, targeten door middel van QPCR-gebaseerd profilering. Hallo, ik ben Dirk DMA van het Department of Microbiology and Immunology aan de University of North Carolina at Chapel Hill. Vandaag laten we u zien hoe u real-time QQPC rra instelt en we laten u twee methoden zien.

Eén, met behulp van een onregelmatige pipet en een met behulp van een robot. We gebruiken deze technologie om pre microRNA's en volwassen microRNA's in menselijke tumoren te meten. De demonstratie van vandaag zal worden gedaan door Pauline Chu en Kristen bu.

Dus laten we beginnen. Om deze procedure te starten, haal de primerplaten met 186 primerparen op in een 96. Well formaat bij 0,5 picaMoles opgeslagen bij minus 20 graden Celsius.

Nadat de platen op kamertemperatuur zijn ontdooid, roer en centrifugeer ze kort. Ontdooi ook cyber green twee keer tijdens PCR mix op kamertemperatuur voor de opstelling van elke 96-putjes primerplaat. Vier mastermixbuizen zullen nodig zijn. Bereid de mastermix voor door vier microliters van de cyber green mix, drie microliters van PCR-kwaliteit water en 10 tot 20 nanogram van monster DNA of CDNA per reactie in elk van de vier twee milliliter einorbuizen te combineren.

Elke buis moet genoeg mastermix bevatten voor ongeveer 100 reacties, waarbij er extra is voor pipetafval. Roer de einorbuizen om te mengen. Begin met de opstelling van de precursor micro RNA-test met behulp van de freedom Tecan EVO-robot met initialisatie van de robot en het laden van het EVO wear-programma.

Spoel vervolgens de robot drie keer met 30 milliliter systeemvloeistof om het systeem te ontdoen van luchtbellen die de pipetnauwkeurigheid zullen verstoren. Stel vervolgens het robotplatform in om een 384-putjesplaat en een 96-putjes primerplaat te bevatten. De mastermixen een trog bevattend 2%bleach, een gevuld systeem, vloeistofcontainer en een lege afvalcontainer.

Begin de geautomatiseerde robotrun door tweemaal uit te voeren aan het einde van het programma. Verwijder de 384-putjesplaat en verzegel met light cycler four 80 plafondfolie. Centrifugeer vervolgens de plaat.

Plaats de verzegelde 384-putjesplaat kort in positie een van het hotel. Herhaal vervolgens dit proces voor primerplaat twee met nieuwe mastermixen en een nieuwe 384-putjesplaat. Plaats de resulterende verzegelde 384-wereldplaat in positie twee van het hotel.

Open een nieuw EVO wear-programma voor het laden van de light cycler vanuit het hotel en stel de cyclusparameters in. Selecteer vervolgens tweemaal uitvoeren. Freedom Evo zal automatisch elke plaat in de light cycler laden en het cyber green one HRM cyclusprogramma uitvoeren.

Eenmaal voltooid. Bekijk en analyseer de resultaten zoals beschreven in het geschreven protocol als alternatief voor het gebruik van de robot. Een matrix elektronische multikanaalspipet kan worden gebruikt om de inhoud van de mastermixbuis één in een reservoir te plaatsen.

Stel de elektronische pipet in om 16 microliters mastermix aan te zuigen met twee acht microliters uitdeelstappen gevolgd door een spoelpas. Na het instellen van de pipet, zuig 16 microliters mastermix aan en begin te verdelen in een 384-wielplaat. Verdeel de eerste acht microliters in elke andere rij in kolom één met rijen A tot O, waarbij de volgende kolom leeg wordt gelaten.

Verdeel de tweede acht microliters in dezelfde rijen van kolom drie. Spoel vervolgens over een afvalcontainer en gooi de punten weg volgens dit patroon van het laten van alternatieve rijen en alternatieve kolommen. Verdeel over de plaat voor vijf meer cycli om mastermix twee te pipetten.

Gebruik dezelfde rijen als mastermix een, maar begin met kolom twee. Herhaal deze procedure voor mastermixen drie en vier, beginnend met kolommen één en twee respectievelijk, maar gebruik dit keer kolom B tot P.Her quotering van de primerplaat. Stel een elektronische pipet in om twee microliters aan te zuigen en twee microliters uit te delen met een spoelpas om te volgen.

Breng twee microliters primers over van kolom één rij A tot H van een 96-putjes primerplaat naar elke andere rijing kolom één van de 384-putjesplaat. Spoel over een afvalcontainer en gooi de punten weg. Herhaal dit patroon voor quatt-primer voor de drie resterende mastermixen van kolommen één en twee. Vervolgens dit proces voortzetten voor kolommen twee tot twaalf van de 96-putjes primerplaat door elke twee kolommen in de 384-putjesplaat te verplaatsen voor elke primerkolom.

Vervolgens verzegelen de platen met een light cycler plafond, folie en centrifugeren. Kort na centrifugatie. Plaats de platen in een light cycler four 80 en stel de platen cyclisch in met behulp van het cyber green one HRM detectieformaat.

Gebruik dezelfde cycluscondities als eerder, herhaal deze procedure met primerplaat twee Eloqua in een nieuwe 384-putjesplaat met vers bereide mastermixen. Precursor micro RNA-signaturen komen naar voren door profilering met behulp van een nieuwe QPCR-gebaseerde array. De gemiddelde delta CT als genormaliseerd naar U zes werd berekend en gestandaardiseerde waarden werden geladen in array.

Minieme software levert drie verschillende clusters op