Name: Profilering van de Pre-micro-RNAs en microRNAs met behulp van kwantitatieve real-time PCR (qPCR) arrays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-03T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Leer de opzet en analyse van pre-microRNA qPCR-arrays met geautomatiseerde en handmatige methoden. Deze procedure maakt snelle, betrouwbare screening van mRNA-expressieniveaus in grote datasets mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door NIH subsidie ​​DE018304, R01DE018281. KT wordt ondersteund door T32 GM07092-34 en door een subsidie ​​aan de Universiteit van North Carolina in Chapel Hill van Howard Hughes Medical Institute (HHMI) door de Med in Grad Initiative. PC wordt ondersteund door T32 CA009156.

De qPCR pre-miRNA profilering arrays kunnen worden opgezet als volledig geautomatiseerd met een Tecan Freedom Evo robot (A) of met de hand met de Matrix elektronische multichannel pipet (B). 1) Maak de master mix, primer platen en samples. <ol><li> Primer platen met 186 primerparen in 96-well formaat (totaal 2 platen) op 12:05 moeten worden opgeslagen bij -80 ° C. Dooi platen uit bij kamertemperatuur, vortex en centrifugeer kort voor gebruik. </li><li> Ter voorbereiding op de master-mix, ontdooien SYBR Green 2x PCR-mix bij kamertemperatuur. Elke reactie maakt gebruik van 8ul master mix met 2ul primer. De samenstelling van de master mix per reactie is 4UL SYBR mix, 3ul PCR kwaliteit water en 10-20 ng DNA-monster of cDNA. </li><li> Voor de installatie van elke 96-well plaat primer, zullen vier master mix buizen nodig zijn. Monsters kunnen worden uitgevoerd 4 monsters per plaat (singlicate), 2 monsters per plaat (duplicaat) of een enkele sample in viervoud. </li><li> Bereid Master Mix door het combineren van SYBR, water-en monster in elk van de 4-2 ml Eppendorf buizen. Elke buis moet voldoende master mix voor ongeveer 100 reacties, waardoor risico voor pipetteren afval. Vortex te mengen. </li></ol> A. Instellen van de pre-miRNA test met behulp van de Freedom Tecan Evo robot. <ol><li> Na initialisatie van de robot en laden van de Evoware programma, spoel drie keer met 30mls elk systeem vrij van luchtbellen die interfereren met pipetteren nauwkeurigheid. </li><li> Het instellen van de robot platform om het volgende omvatten: <ul><li> Gelabeld 384-wells plaat </li><li> 96-well plaat primer (1) </li><li> Mastermengsels </li><li> Een buis met 2% bleekwater </li><li> Een gevulde systeem vloeistofcontainer </li><li> Lege afvalcontainer </li></ul></li><li> Begin geautomatiseerde robot gerund door te kiezen voor "Run" twee keer. </li><li> Aan het einde van het programma, verwijder 384-wells plaat en afdichting met LightCycler 480 afdichting folie en centrifuge kort. Plaats verzegelde 384-wells plaat in positie 1 van het hotel. </li><li> Ga naar 2.2 stap en voor primer plaat 2 te herhalen met een nieuwe meester mixen en een nieuwe 384-wells plaat. <ol><li> Plaats verzegeld plaat in positie 2 van het hotel. </li></ol></li><li> Open nieuwe Evoware programma voor het laden van LightCycler van het hotel en kies twee keer "Run". <ol><li> Freedom Evo zal elke plaat automatisch laden in de LightCycler en voer de volgende SYBR-groen I / HRM fiets-programma: Pre (een cyclus): 50 ° gedurende 5 minuten bij ramp snelheid van 4,8 ° / sec 95 ° gedurende 5 minuten bij ramp snelheid van 4,8 ° / sec Amp (45 cycli): 95 ° gedurende 15 sec bij ramp snelheid van 4,8 ° / sec 62 ° gedurende 30 seconden op oprit snelheid van 2,5 ° / sec (Single data-acquisitie tijdens deze stap) Smeltcurve: 95 ° gedurende 5 sec bij ramp snelheid van 4,8 ° / sec 60 ° gedurende 1 minuut bij ramp snelheid van 2,5 ° / sec 95 ° continue op oprit snelheid van 0,11 ° / sec met 5 overnames per ° C Cool: 50 ° gedurende 30 seconden op helling van 25 ° / sec </li></ol></li></ol> B. Instellen van de pre-miRNA test met behulp van de Matrix elektronische meerkanaalspipet: <ol><li> Plaats de inhoud van de master mix buis 1 in een reservoir. </li><li> Stel de elektronische pipet 16ul van de master mix te zuigen met een 2-8ul afzien stappen, gevolgd door een zuivering stap. </li><li> Voor master mix 1, afzien 8ul in elke andere goed van de 384-wells plaat (ingesteld op 384-wells tip afstand), te beginnen met goed A1. (Dat wil zeggen putten A1, C1, E1, etc.) Voor de tweede 8ul afzien, ga dan naar kolom 3 (dat wil zeggen putten A3, C3, E3, etc.), dan purge boven een afvalcontainer en gooi tips. </li><li> Volg dit patroon voor de resterende vijf cycli totdat u bij goed A23. </li><li> Herhaal dit voor master mix 2, (te beginnen met goed A2, C2, E2, etc.); master mix 3 (vanaf zowel B1, D1, F1, etc.); master mix 4 (vanaf B2, D2, F2, enz. .). </li><li> Voor aliquotting van de primer plaat, zet elektronische pipet op 2ul aspireren en afzien 2ul met een zuivering stap na. Doseer 2ul van primers uit kolom 1 van de 96-well plaat primer (AH) in de 384-wells plaat, putten A1, C1, E1, etc. Purge meer dan een afvalcontainer en gooi tips. Herhaal dit voor putten A2, C2, E2, B1, D1, F1, en B2, D2, F2, etc. </li><li> Herhaal dit voor de rijen 2-12 van 96-well primers, bewegen meer dan om de 2 kolommen voor elke primer kolom, tot de volledige 384-wells plaat is aliquotted. </li><li> Seal-platen met een LightCycler afdichting folie en centrifuge kort. </li><li> Plaats platen in een LightCycler 480 en fietsen de platen op basis van de volgende instellingen met behulp van de SYBR Green I / HRM-detectie-indeling: Pre (een cyclus): 50 ° gedurende 5 minuten bij ramp snelheid van 4,8 ° / sec 95 ° gedurende 5 minuten bij ramp snelheid van 4,8 ° / sec Amp (45 cycli): 95 ° gedurende 15 sec bij ramp ratevan 4,8 ° / sec 62 ° gedurende 30 seconden op oprit snelheid van 2,5 ° / sec (Single data-acquisitie tijdens deze stap) Smeltcurve: 95 ° gedurende 5 sec bij ramp snelheid van 4,8 ° / sec 60 ° gedurende 1 minuut bij ramp snelheid van 2,5 ° / sec 95 ° continue op oprit snelheid van 0,11 ° / sec met 5 overnames per ° C Cool: 50 ° gedurende 30 seconden op helling van 25 ° / sec </li><li> Herhaal dit met behulp van primer plaat 2, aliquotting in een frisse 384-wells plaat met vers bereide mastermengsels. </li></ol> Geheimen van het succes: Een belangrijk kenmerk bij het ontwerpen van PCR arrays is dat alle 186 primerparen dezelfde annealing temperatuur hebben, zodat de plaat kan worden uitgevoerd op hetzelfde optimale PCR-run programma-instellingen. Elke nieuwe array moet worden gecontroleerd met behulp van drie controles vóór het runnen van monsters. Deze controles zijn: Een run van alle primers lopen met water of 0,1 x TE uit te sluiten primer besmetting. Een run van afwisselend water / TE en positieve controle, geen overdracht te verzekeren. 3 runs met dezelfde positieve controle, dat de reproduceerbaarheid tussen de runs te verzekeren. Mastermengsels moet vers worden bereid, en de platen moeten worden uitgevoerd binnen de 24 uur voor een optimaal resultaat Primer plaat folie dient langzaam te worden verwijderd om het risico van besmetting tussen putten te verminderen. Bij gebruik van een robot met vaste tips, 2% bleekwater wassen is nodig om de tips tussen elke pipetteren stap, gevolgd door een waterspoeling wassen. Dit voorkomt en elimineert overdracht, die anders zouden kunnen besmetten gegevens en leiden tot een overtuigend resultaat. Na een plaat lopen door de LightCycler, moet niet meer worden geopend in de PCR-setup kamer. Dit helpt voorkomen dat PCR-besmetting. Representatieve resultaten: qPCR resultaten worden meestal vertegenwoordigd door de CT-waarden zoals bepaald op basis van de LightCycler analyse software. Een succesvolle run bestaat meestal uit een reeks van CTS voor monsters, meestal tussen de 20-35 voor monsters die zijn positief. Het water monsters in een goede run zijn altijd bij een CT van&gt; 40 en de eventuele monsters of specifieke putten met een CT meer dan 37 worden beschouwd als negatief of niet gedetecteerd. Als algemene regel geldt, monsters waardoor een CT van &lt;10 is ook onbetrouwbaar en zijn uitgesloten van verdere analyse. Er zijn verschillende manieren om qPCR gegevens en het opnemen van interne controles te analyseren in onze test helpt bij de controle voor de variatie van het monster input. De pre-miR array bevat een U6 controle primer, die vaak wordt gebruikt als een referentie-gen naar CT waarden normaliseren van verschillende monsters. Deze genormaliseerde waarde wordt aangeduid als de delta CT-waarde (DCT). De resultaten worden vaak weergegeven als de ruwe CT, de DCT waarde of kunnen verder worden geanalyseerd om gestandaardiseerde waarden. In figuur 1, een analyse van de volledige pre-microRNA reeks van vier verschillende monsters van een tijdsverloop experiment is gepresenteerd in heat map-formaat. De relatieve expressie van iedere pre-microRNA is getoond en drie grote, verschillende clusters ontstaan. De meerderheid van de geanalyseerde pre-Mirs onderging kleine, onbelangrijke veranderingen zoals verwacht (Figuur 1A). Er werden echter een klein deel van de pre-microRNA's aanzienlijk gedaald (figuur 1B) of enorm toegenomen (figuur 1C) het hele tijdsverloop experiment. Niveaus van expressie van iedere pre-microRNA werden genormaliseerd om de 0h meetpunt (voorbeeld 1) als een basisniveau. In sommige gevallen kunt u er rekening mee dat een deel van de geclusterde pre-microRNA's ook samen cluster in de heatmap analyse (ex: laat-7a, figuur 1B). Afhankelijk van het experiment, clusters kunnen ontstaan ​​die afhankelijk zijn van virale infectie, celtype specifieke uitdrukking is van pre-microRNA's of pre-Mirs die worden gereguleerd door een gemeenschappelijke molecuul of signaalweg. De pre-microRNA test die we ook hebben ontwikkeld bevat een aantal bekende virale pre-microRNA's en genen die gecodeerd worden door Kaposi-sarcoom Associated herpesvirus (KSHV) en Epstein Barr Virus (EBV) in aanvulling op de menselijke pre-Mirs. Deze kunnen gebruikt worden als positieve of negatieve controles, afhankelijk van de cellijn en virale de status van de gebruikte samples. In figuur 2 zijn de gemiddelde CT uit een KSHV-negatieve monster run in viervoud getoond. Belangrijk is dat KSHV LANA niet gedetecteerd in deze steekproef door de uiterst gevoelige qPCR array. Echter, U6 - onze interne controle en-7a te laten - werd een hoge mate tot expressie menselijke pre-microRNA, uitgedrukt in detecteerbare niveaus. Ten slotte, zoals verwacht, heeft de negatieve controle van de PCR-grade water niet toegeven een qPCR product. Een andere indicator voor een succesvolle qPCR run is een goede smeltcurve analyse, die inzicht kan geven in mogelijke besmetting in monsters. Om een ​​smelttemperatuur, wordt de plaat langzaam opgewarmd na de PCR is voltooid. Als de DNA-strengen gescheiden, is SYBR groen vrijgegeven, en fluorescentie signaal afneemt. De temperatuur waarbij deze drop komt is grafiek, en staat bekend als de smelttemperatuur van het monster. Afhankelijk van de DNA-sequentie, samples smelten bij verschillende temperaturen van elkaar en uit het water negatieve controle, die niet mogen hebben een smelttemperatuur omdat er geen DNA aanwezig is. De PCR-producten van elk primerpaar moeten smelten bij vergelijkbare temperaturen. Bijvoorbeeld, Figuur 3 toont een smeltcurve analyse voor twee verschillende primers met dezelfde monster in tweevoud. Het is duidelijk dat de smelttemperatuur is verschillend voor de twee primerparen, maar het monster aan het smelten is op exact dezelfde temperatuur voor elke repliceren. Tekenen van een slechte of mogelijk besmette monsters kan verschillende smelten pieken, wat suggereert dat de aanwezigheid van twee verschillende bronnen van input. <img src="/files/ftp_upload/2210/2210fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Pre-microRNA handtekeningen ontstaan ​​door profiling met behulp van een roman qPCR-gebaseerde array. De gemiddelde deltaCTU6 was berekend en gestandaardiseerde waarden werden geladen in ArrayMinerTM software, waardoor drie verschillende clusters weergegeven als heatmaps. (A) Pre-microRNA's met kleine veranderingen in de expressie worden weergegeven. Pre-microRNA's waarvan de niveaus waren significant verlaagd (B) of verhoogd (C) worden ook getoond. Blauw komt overeen met lagere niveaus van expressie, terwijl rood staat voor verhoogde expressie niveaus. <img src="/files/ftp_upload/2210/2210fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Opname van de interne controle in de qPCR-based pre-microRNA array. De ruwe CT waarden voor de 3 verschillende genen en een template geen controle worden weergegeven. U6 wordt gebruikt als een interne positieve controle tijdens het PCR-H2O fungeert als onze negatieve controle. Laat-7a-1-1 is een microRNA normaal gesproken uitgedrukt in veel verschillende soorten cellen, terwijl KSHV LANA kan gebruikt worden als een positief of negatieve controle, op basis van virale status van de cellijn of weefsel gebruikt. <img src="/files/ftp_upload/2210/2210fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Smeltpiek analyse van de pre-microRNA primers en het gebrek van het monster besmetting. Smeltcurves werden verkregen met behulp van de Tm bellen analyse in de LightCycler software. Twee verschillende primers (Primer A en B) voor hetzelfde monster in duplo worden weergegeven. De smelttemperatuur van elke primer is verschillend. Echter, de steekproef heeft slechts een piek, waaruit blijkt het ontbreken van een monster besmetting.

<ol><li>Bustin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MIQE+Guidelines%3A+Minimum+Information+for+Publication+of+Quantitative+Real-Time+PCR+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chem%22%5BJournal%5D)">The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments.</a> Clinical Chem. 55 (4), 611-622 (2009).</li>
<li>Frégeau, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Processing+of+Forensic+Casework+Samples+using+Robotic+Workstations+Equipped+with+Nondisposable+Tips+-+Contamination+Prevention%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Forensic+Sci%22%5BJournal%5D)">Automated Processing of Forensic Casework Samples using Robotic Workstations Equipped with Nondisposable Tips - Contamination Prevention.</a> J. Forensic Sci. 53 (3), 53-533 (2008).</li>
<li>O'hara, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-micro+RNA+Signatures+Delineate+Stages+of+Endothelial+Cell+Transformation+in+Kaposi+Sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Pre-micro RNA Signatures Delineate Stages of Endothelial Cell Transformation in Kaposi Sarcoma.</a> PLoS Pathog. 5 (4), e1000389-e1000389 (2009).</li>
</ol>

QPCR is een zeer gevoelige test die gebruikt kan worden om genexpressie niveaus te vergelijken tussen de monsters in een studie, alsook aan positiviteit te bepalen in het geval van virussen. Het voordeel van het gebruik van qPCR arrays is de mogelijkheid om vele primers (in ons geval, 186 primer paren) lopen voor elk monster in een korte periode van tijd. Met behulp van een robot pipetteren, zoals de Tecan Freedom Evo, de hoeveelheid tijd die nodig is om een ​​experiment up kan verder worden verlaagd ingesteld, en de na...

<table><tbody><tr><td>Freedom Evo 150</td><td>Tecan Group Ltd.</td><td>30017587</td><td></td></tr><tr><td>Matrix elektronische multichannelpipet</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>2001-MTX</td><td>(of elke vergelijkbare Thermo Scientific multichannelpipet die de bovengenoemde volumes kan pipetteren)</td></tr><tr><td>Matrix Integrity Filter Tips, steriel</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>7435</td><td>(of vergelijkbare tip voor de gebruikte multichannelpipet)</td></tr><tr><td>Lightcycler 480 SYBR Green 1 Master</td><td>Roche Group</td><td>04 707 516 001</td><td></td></tr><tr><td>Lightcycler 480 Instrument II</td><td>Roche Group</td><td>05015243001</td><td>384-wells versie</td></tr><tr><td>Lightcycler 480 Multiwell Plate 384, wit</td><td>Roche Group</td><td>04729749001</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 Sealing Foil</td><td>Roche Group</td><td>04729757001</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 Multiple Plate Analysis Software</td><td>Roche Group</td><td>05075122001</td><td></td></tr><tr><td>Eliminase Decontaminant</td><td>Decon Laboratories</td><td>04-355-31</td><td></td></tr></tbody></table>

profilering van de pre-micro-rna&#39;s en microrna&#39;s met behulp van kwantitatieve real-time pcr (qpcr) arrays

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Kwantitatieve real-time PCR (QPCR) heeft ontpopt als een nauwkeurig en waardevol instrument in de profilering van genexpressie niveaus. Een van de vele voordelen is een lagere detectiegrens in vergelijking met andere methoden van gen expressie profilering tijdens het gebruik van kleinere hoeveelheden input voor elke test. Geautomatiseerde qPCR setup is verbeterd op dit gebied door toe te staan ​​voor een grotere reproduceerbaarheid. De handige en snelle setup zorgt voor high-throughput experimenten, waardoor de profilering van vele verschillende genen tegelijkertijd in elk experiment. Deze methode in combinatie met interne controle plaat vermindert ook de experimentele variabelen bij andere technieken. We hebben recent ontwikkelde een qPCR test voor profilering van pre-microRNA&#39;s (pre-miRNAs) met behulp van een set van 186 primer paren. MicroRNA hebben zich ontwikkeld tot een nieuwe klasse van kleine, niet-coderende RNA&#39;s met de mogelijkheid om vele doelen mRNA regelen bij de post-transcriptionele niveau. Deze kleine RNA&#39;s worden eerst getranscribeerd door RNA polymerase II als een primaire miRNA (pri-miRNA) transcriptie, die vervolgens wordt gesplitst in de voorloper miRNA (pre-miRNA). Pre-miRNAs worden geëxporteerd naar het cytoplasma waar Dicer knipt de hairpin loop te geven volwassen miRNAs. Verhogingen van miRNA niveaus kunnen worden waargenomen op zowel de voorloper en volwassen miRNA niveaus en profilering van beide vormen kan nuttig zijn. Er zijn verschillende commercieel verkrijgbare assays voor de rijpere miRNAs, maar de hoge kosten kunnen afschrikken onderzoekers van deze profilering techniek. Hier bespreken we een rendabele, betrouwbare, SYBR-based qPCR methode van profiling pre-miRNAs. Veranderingen in de pre-miRNA het niveau vaak een weerspiegeling van volwassen miRNA veranderingen en kan een nuttige indicator van de volwassen miRNA expressie. Kan echter gelijktijdig profilering van zowel pre-miRNAs en volwassen miRNAs worden optimaal als ze kunnen nonredundant informatie bijdragen en geven inzicht in de verwerking van microRNA. Bovendien kan de techniek hier beschreven worden uitgebreid met de profilering van andere bibliotheek sets voor specifieke studierichtingen of ziekteverwekkers omvatten.

We zullen aantonen de opzet en analyse van pre-microRNA 96-wells-arrays voor QPCR het gebruik van een robot als door de hand met een Thermo Scientific Matrix multichannel pipet.

Profilering van de Pre-micro-RNA&#39;s en microRNA&#39;s met behulp van kwantitatieve real-time PCR (qPCR) arrays

Kwantitatieve real-time PCR (qPCR) is ontstaan als een nauwkeurige en waardevolle tool voor het profileren van genexpressieniveaus. Een van de vele voordelen is een lagere ...

Het algemene doel van deze procedure is om een snelle en betrouwbare geautomatiseerde opzet van qPCR-gebaseerde arrays mogelijk te maken. Dit wordt bereikt door eerst de primer-sets voor de array voor te bereiden en de sample mastermixen op te stellen die gescreend moeten worden. Vervolgens wordt er ofwel een geautomatiseerde robotische PCR-opstelling of een matrix elektronisch pipetsysteem gebruikt om de sample mastermix en primer-sets nauwkeurig in elke put van een 384-well plaat over te brengen.Zodra deze zijn voorbereid, worden de PCR-reacties in de 384-wells uitgevoerd met het PCR-programma van de LightCycler 480. De laatste stap van de procedure is het analyseren van de qPCR-gegevens en het bepalen van de relatieve expressieniveaus voor elk getest primerpaar, waarbij elk paar gericht is op een specifiek mRNA. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die veranderingen in de expressie van grote sets mRNA's laten zien.Speciaal ontwikkelde arrays kunnen daarom via qPCR-gebaseerde profilering gericht zijn op volledige pre-microRNA-profielen, specifieke pathways of moleculen die essentieel zijn voor virale infecties. Hallo, ik ben Dirk DMA van de afdeling Microbiologie en Immunologie aan de University of North Carolina at Chapel Hill. Vandaag laten we u zien hoe u real-time qPCR opzet en we zullen u twee methoden tonen.Eén met een handmatige pipette en één met een robot. We gebruiken deze technologie om pre-microRNA's en mature microRNA's in menselijke tumoren te meten. De demonstratie vandaag zal worden verzorgd door Pauline Chu en Kristen bu.Laten we beginnen. Om deze procedure te starten, haal je de primerplaten op die 186 primerparen bevatten in een 96-well formaat bij 0,5 picaMoles, bewaard bij -20 °C.Nadat de platen op kamertemperatuur zijn ontdooid, worden ze kort gevortext en gecentrifugeerd. Ontdooi daarnaast de Cyber Green Two Times PCR-mix op kamertemperatuur; voor de opstelling van elke 96-wells primerplaat zijn vier mastermix-buisjes nodig. Bereid de mastermix voor door per reactie 4 µL Cyber Green-mix, 3 µL PCR-water en 10 tot 20 ng monster-DNA of cDNA te combineren in elk van de vier 2 mL Eppendorf-buisjes.Elke buis moet voldoende mastermix bevatten voor ongeveer 100 reacties, waarbij rekening is gehouden met een overschot voor pipetteerverlies. Vortex de buizen om te mengen. Begin met de opstelling van de precursor micro RNA-assay met behulp van de freedom Tecan EVO-robot, inclusief de initialisatie van de robot en het laden van het EVO-wearprogramma.Spoel de robot vervolgens drie keer met 30 milliliters systeemvloeistof om het systeem te ontdoen van luchtbellen die de nauwkeurigheid van het pipetteren kunnen beïnvloeden. Stel daarna het robotplatform zo in dat er een 384-wells plaat en een 96-wells primerplaat aanwezig zijn. De mastermixen, een trog met 2%bleach, een gevulde systeemvloeistofcontainer en een lege afvalcontainer.Start de geautomatiseerde robotrun door aan het einde van het programma tweemaal op run te klikken. Verwijder de 384-well plaat en verzegel deze met LightCycler 480 sealing foil. Centrifugeer vervolgens de plaat.Plaats de verzegelde 384-wellplaat kortweg in positie één van het hotel. Herhaal dit proces vervolgens voor primerplaat twee met nieuwe mastermixen en een nieuwe 384-wellplaat. Plaats de resulterende verzegelde 384-wellplaat in positie twee van het hotel.Open een nieuw EVO wear-programma om de light cycler vanuit het hotel te laden en stel de cyclusparameters in. Selecteer vervolgens twee keer 'run'. Freedom Evo zal automatisch elke plaat in de light cycler laden en het cyber green one HRM-cyclusprogramma uitvoeren.Zodra dit voltooid is, dienen de resultaten te worden beoordeeld en geanalyseerd zoals beschreven in het schriftelijke protocol, als alternatief voor het gebruik van de robot. Een elektronische multichannel pipet voor platen kan worden gebruikt om de inhoud van de buis met de mastermix in een reservoir te plaatsen.Stel de elektronische pipet zo in dat er 16 µL mastermix wordt opgezogen, gevolgd door twee afgiftestappen van eight µL en een spoelstap. Nadat de pipet is ingesteld, worden 16 µL mastermix opgezogen en wordt gestart met het dispenseren in een 384-wheelplaat. Doseer de eerste 8 µL in om en om rijen in kolom één, gebruikend rijen A tot O, waarbij de volgende kolom leeg blijft.Dispenseer de tweede acht µL in dezelfde rijen van kolom drie. Spoel vervolgens boven een afvalbak door en verwijder de tips volgens dit patroon waarbij om en om rijen en kolommen worden overgeslagen. Herhaal dit proces over de plaat voor vijf verdere cycli om master mix twee te pipetteren.Gebruik dezelfde rijen als voor mastermix één, maar begin bij kolom twee. Herhaal deze procedure voor mastermix drie en vier, beginnend bij respectievelijk kolom één en twee, maar gebruik ditmaal rij B tot P van de primerplaat. Stel een elektronische pipette in om 2 µL op te zuigen en 2 µL te dispenseren, gevolgd door een spoelstap.Breng twee µL primers over van kolom één, rij A tot H van een 96-well primerplaat naar om en om een rij in kolom één van de 384-well plaat; spoel boven een afvalbak door en gooi de tips weg. Herhaal dit patroon voor de quatt primer voor de drie resterende mastermixen in kolom één en twee. Zet dit proces vervolgens voort voor kolom twee tot 12 van de 96-well primerplaat, waarbij u voor elke primerkolom telkens twee kolommen overslaat in de 384-well plaat.Verzegel vervolgens de platen met een plafond voor de light cycler, folie en centrifugeer ze. Plaats de platen na het centrifugeren kort in een light cycler 480 en voer de cycli uit met behulp van het Cyber Green I HRM-detectieformaat.Herhaal deze procedure met dezelfde cycluseringsvoorwaarden als voorheen, gebruikmakend van primerplaat twee Eloqua in een nieuwe 384-wellplaat met vers bereide mastermixen. Precursor micro-RNA-signaturen komen naar voren door profilering met gebruik van een nieuwe QPCR-gebaseerde array. De gemiddelde delta CT, genormaliseerd ten opzichte van U zes, werd berekend en de gestandaardiseerde waarden werden in de array geladen.Software-analyse resulterend in drie verschillende clusters, weergegeven als heatmaps. De relatieve expressie van elk precursor micro RNA wordt getoond, waarbij rood en blauw respectievelijk een toename en afname in relatieve expressie vertegenwoordigen. De kleurintensiteit geeft de mate van expressieverandering aan.De meerderheid van de precursor microRNA's onderging kleine, onbetekenende veranderingen, zoals verwacht. Een klein deel van de precursor microRNA's vertoonde echter een significante toename gedurende het experimentele tijdverloop. Daarnaast nam het relatieve niveau van enkele precursor microRNA's drastisch af.In sommige gevallen clusteren ze ook samen in de heatmap-analyse. Afhankelijk van het experiment kunnen er clusters ontstaan die afhankelijk zijn van virale infectie, celtype-specifieke expressie van precursor microRNA's of precursor microRNA's die worden gereguleerd door een gemeenschappelijk molecuul of signaleringspad.De gemiddelde drempelcycli of ct-waarden van een negatief monster voor het Kaposi-sarcoma-geassocieerde herpesvirus, uitgevoerd in viervoud, worden getoond. Belangrijk is dat het Kaposi-sarcoma-geassocieerde herpesvirus latentie-geassocieerde nucleaire antigeen of KSHV Lana niet in dit monster werd gedetecteerd door de hooggevoelige QPCR-array. Beide interne controles, U6 en let-7a (een sterk tot expressie gebracht micro-RNA-precursor van de mens), werden echter tot detecteerbare niveaus tot expressie gebracht.Ten slotte, zoals verwacht, leverde de negatieve controle van PCR-water geen A-Q-P-C-R-product op. Een smeltcurve-analyse voor twee verschillende primers, waarbij hetzelfde monster-duplicaat is gebruikt, wordt getoond.Het is duidelijk dat de smelttemperatuur verschilt voor de twee primerparen, maar de sample smelt bij exact dezelfde temperatuur voor elk replicaat. Tekenen van een slechte of potentieel gecontamineerde sample kunnen meerdere smeltpieken zijn, wat kan wijzen op de aanwezigheid van twee verschillende inputbronnen. We hebben zojuist aangetoond hoe u real-time QPCR-experimenten opzet met behulp van een robot.Het is belangrijk dat u alle controles en zoveel mogelijk housekeeping-genen opneemt. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

profiling-pre-micro-rnas-micrornas-using-quantitative-real-time-pcr

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschrijven we een geoptimaliseerde multiplex reverse transcriptase kwantitatieve PCR (qRT-PCR)-protocol in combinatie met een microfluïdisch platform als een kost en tijd efficiënte high-throughput screening tool voor microRNA (miRNA) expressie niveaus, in het bijzonder bij het werken met beperkte hoeveelheden van het monster.

High Throughput MicroRNA Profiling: Geoptimaliseerd Multiplex qRT-PCR op nanoliter Schaalverdeling op de Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCS

Een eenvoudige procedure van het uitvoeren van op maat microRNA microarray experimenten beschreven. De stappen omvatten het isoleren van RNA, etikettering RNA en DNA, het hybridiseren van het monsters microarrays, het scannen van de microarrays, kwantificeren en analyseren van hybridisatie signalen.

Het uitvoeren van op maat MicroRNA microarray experimenten

Kwantitatieve Real Time polymerase chain reaction (qPCR) is een snelle en gevoelige methode om de expressie niveaus van verschillende microRNA (miRNA) moleculen te onderzoeken in tumor monsters. Met deze methode uitdrukking van honderden verschillende miRNA-moleculen kunnen worden versterkt, gekwantificeerd en geanalyseerd uit dezelfde cDNA sjabloon.

MicroRNA Detectie in prostaattumoren op Kwantitatieve Real-time PCR (qPCR)

De aanwezigheid van stabiele microRNA (miRNA) in exosomes heeft immense belangstelling gegenereerd als een nieuwe wijze van intercellulaire communicatie, voor hun potentiële nut als biomarkers en als een route voor therapeutische interventie. Hier laten we zien exosome zuivering van het bloed en de cultuur media, gevolgd door kwantitatieve PCR om miRNA's worden vervoerd identificeren.

Zuivering en microRNA Profilering van Exosomes Afgeleid van Blood en cultuur Media

We beschrijven een protocol van real time PCR om microRNA profileren in de cerebrospinale vloeistof (CSF). Met uitzondering van RNA-extractie protocollen kan de procedure worden uitgebreid tot RNA geëxtraheerd uit andere lichaamsvloeistoffen, gekweekte cellen of weefselmonsters.

Cerebrospinale vloeistof MicroRNA Profiling Met behulp van kwantitatieve real time PCR

Moleculaire signalering via zowel oestrogeen en microRNA's zijn cruciaal in de ontwikkeling en de groei van borstkanker. Oestrogeen activeert de oestrogeenreceptoren die transcriptiefactoren. Veel transcriptiefactoren kan de expressie van microRNA's te reguleren, en oestrogeen-gereguleerde microRNA kunnen worden geprofileerd met behulp van verschillende grootschalige technieken.

Profilering van oestrogeen-gereguleerde MicroRNA in borstkankercellen

Circulerende microRNAs zijn onlangs naar voren gekomen als veelbelovend en nieuwe biomarkers voor verschillende vormen van kanker en andere ziekten. Het doel van dit artikel is om drie verschillende probes gebaseerde real-time PCR-platforms en methoden die beschikbaar zijn om te kwantificeren en te bepalen de overvloed aan circulerende microRNAs zijn te bespreken.

Probe-gebaseerde real-time PCR Benaderingen voor kwantitatieve meting van microRNAs

Er wordt een gevoelige en nauwkeurige methode beschreven voor de kwantificering van celvrije microRNA's met behulp van een kleurstof-gebaseerde chemie en druppel digitale PCR-technologie.

Circulerende MicroRNA Kwantificering Met behulp van DNA-bindende Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Dit verslag beschrijft een protocol voor het meten van de absolute niveaus van plasma miRNA, kwantitatieve real-time omgekeerde transcriptie PCR gebruiken met of zonder voorafgaande versterking. Dit protocol biedt een beter begrip van de hoeveelheid plasma miRNAs en laat de kwalitatieve beoordeling van de bijbehorende gegevens uit verschillende studies of laboratoria.

Absolute kwantificering van Plasma MicroRNA niveaus bij Cynomolgus apen, met behulp van kwantitatieve Real-time omgekeerde transcriptie PCR

Hier beschrijven we een methode voor de beoordeling van de Long-expressie van miRNAs die zijn voorspeld te reguleren van inflammatoire genen met behulp van muizen blootgesteld aan ozon of gefilterde lucht in verschillende stadia van de oestrische cyclus.

Long microRNA profilering in de oestrische cyclus in ozon-blootgesteld muizen

Hier, wordt een kwantitatief real-time op de kettingreactie-gebaseerd protocol van de polymerase voorgesteld voor de bepaling van de inheemse micro-RNA inhoud (absoluut/verwant) van lipoprotein deeltjes. Bovendien is een methode voor het verhogen van het micro-RNA-niveau, evenals een methode voor het bepalen van de cellulaire opnamesnelheid van lipoprotein deeltjes, aangetoond.

Verrijking van native lipoprotein deeltjes met microRNA en daaropvolgende bepaling van hun absolute/relatieve microRNA inhoud en hun cellulaire overdrachtssnelheid

Leer de opzet en analyse van pre-microRNA qPCR-arrays met geautomatiseerde en handmatige methoden. Deze procedure maakt snelle, betrouwbare screening van mRNA-expressieniveaus in grote datasets mogelijk.

Profilering van de Pre-micro-RNA's en microRNA's met behulp van kwantitatieve real-time PCR (qPCR) arrays

Meer video's verkennen