Name: Optic Nerve transsectie: Een model van de volwassen Neuron Apoptosis in het centrale zenuwstelsel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Leer optic nerve transectie voor het bestuderen van neuronale apoptose in het volwassen centrale zenuwstelsel. Dit reproduceerbare model onderzoekt retinale ganglioncellen en helpt bij het ontwikkelen van neuroprotectieve strategieën.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

PDK wordt ondersteund door een CIHR exploitatiesubsidie ​​(MOP 86523)

1. Chirurgische techniek <ol><li> Experimenten moeten worden uitgevoerd met aseptische techniek en na het gebruik van dieren protocollen van uw specifieke instelling. Instrumenten en materialen (oplossingen te testen stoffen, tracers, naalden, etc.) in contact komen met levend weefsel moet steriel zijn voor infecties en negatieve effecten te voorkomen dat op het dierenwelzijn en de mogelijke negatieve effecten op de studie. </li></ol> 2. Anesthesie <ol><li> Ratten zullen worden verdoofd met behulp van een veterinair isofluraan vaporizer systeem. Gebruik maken van medische kwaliteit zuurstof met een snelheid van 0,8 L / min aan de isofluraan gas verdampen. Plaats het dier in de bijgevoegde anesthesie box en kies in een isofluraan concentratie van 4% tot de ademhaling is vertraagd en het dier is rustig. </li><li> Vervolgens schakelt de gastoevoer naar de gasmasker bevestiging voor de stereotaxische frame en plaats het dier in de stereotaxische apparaat. Draai de isofluraan concentratie tot 2% en monitoren anesthesie. Grotere dieren (&gt; 300 g) kunnen een hogere concentratie van isofluraan. Anesthesie moet gevolgd worden tijdens operatie en isofluraan de dosering aangepast. Diepte en de snelheid van de ademhaling moet voortdurend worden geëvalueerd, en teen knijpen evaluatie (om de 5 min) voor de afwezigheid van diepe pijn te worden uitgevoerd. </li><li> Zodra de operatie is voltooid, schakelt u de isofluraan en laat het dier om te ademen zuurstof gedurende enkele minuten voor verwijdering uit de stereotaxische apparaat. De lichaamstemperatuur moet worden gehandhaafd door het bedekken van het dier met een chirurgische deken en / of met behulp van een regelbare verwarming deken tijdens de operatie. </li></ol> 3. Chirurgische aanpak <ol><li> Maak de vacht op de top van het hoofd met 70% ethanol om de vacht makkelijker te snijden. Verwijder het bont van tussen de ogen met behulp van een klipper of scherpe schaar. Reinig de incisie gebied drie keer met afwisselende programma's van jodium detergent oplossing (Proviodine, Betadine, etc), gevolgd door 70% ethanol. Handhaaf het hoornvlies vochtig gedurende de operatie door het toepassen van oogheelkundige oogzalf (Tears Naturale PM) aan het hoornvlies. Verdeel de zalf over het oppervlak van het hoornvlies door het handmatig openen en sluiten van de oogleden. </li><li> Met behulp van een blad nr. 11, maakt een incisie langs de middellijn van het hoofd van ongeveer 0,5 cm in de voorkant van de ogen tot 1 cm achter de ogen. Trek de klep van de huid over het oog met behulp van pincet en voorzichtig te plagen weg het onderliggende bindweefsel met de achterkant van de scalpel. Vervolgens trekken de klep van de huid lateraal en naar beneden en houd deze op zijn plaats met een chirurgische oprolmechanisme dat kan worden geplakt is aan de basis van de stereotaxische instrument. </li><li> Maak een incisie langs de superieure rand van de orbitale bot, terwijl trekken aan de overliggende fascia met scherpe tang. Dit zal zich terugtrekken van de fascia bovenliggende de baan van het oog. De rand van de orbitale bot kan duidelijk worden afgebakend door gebruik te maken tang naar beneden druk op de fascia overliggende de baan. Met behulp van een cauterisatie-apparaat of een scalpel, achteruit gaan met de incisie naar de achterkant grens van de baan van het oog. Gebruik het bot van de superieure baan als gids voor de incisie. Volgende blijven de incisie naar voren in de richting van de voorste grens van de baan. De incisie van de superieure baan kan het beste gebeuren met behulp van een kleine cauterisatie-apparaat om te bloeden te voorkomen dat de onderliggende vaten die communiceren met de veneuze sinussen. </li><li> Als bloeden optreedt een aantal stappen kunnen worden genomen. In de eerste plaats toe te passen druk met behulp van steriele chirurgische swabs of wattenstaafjes. Als bloeden blijft van toepassing koude, steriele fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS) om het gebied met behulp van een druppelaar, en onderhouden van de druk. Kleine bloeden stopt na enkele seconden met deze procedure. Als bloeden aanhoudt, gelden tractie aan het weefsel met de chirurgische wattenstaafje of wattenstaafje om de bron van bloeden te identificeren en snel cauterize de besmette schip. Nadat het bloeden is opgenomen, gebruik koud steriel PBS tot de chirurgische gebied van bloed schoon te maken. De chirurgische gebied moet regelmatig worden schoongemaakt op deze manier om beter structuren te visualiseren in de baan van het oog. </li><li> Nadat de incisie is schoongemaakt, een tang en de achterkant van de scalpel om het bindweefsel schoon aan de achterkant van het oog dat de orbitale inhoud ligt over. De achterkant van de nummer 11 scalpel werkt goed als de tip is prima. Dit opent diepere delen van de orbitale holte voorzien in een grotere chirurgische venster om te werken inch Gebruik Dumont # 7b scherpe gebogen-gekarteld pincet bij het werken in het oog als hun kromming en fijne tips zijn ideaal voor het manipuleren van structuren in de baan. Bovendien is de vertanding te helpen met aangrijpende structuren. </li><li> Verwijder vervolgens het bindweefsel dat de oogheelkundige afdeling van de nervus trigeminus, die zit de buurt van de middellijn omringt, en verwijder de zenuw met behulp van pincet. Deze stap is niet noodzakelijk, maar het verwijderen van de zenuw zorgt voor een groter venster van access aan de oogzenuw later. </li><li> Na verwijdering van de zenuw, een tang om het bloedvat beneden trekken en volledig cauterize het schip. Deze stap is ook niet nodig, maar cauterisatie van het schip maakt het mogelijk om naar voren worden verplaatst, waardoor een groter venster zodra de oogzenuw is bereikt. </li><li> Gebruik een scherpe tang of pincet die hebben hun tips gebogen naar binnen om zorgvuldig te kiezen en de dunne laag van bindweefsel te verwijderen over de extraoculaire spieren en traanklier. Trek de extra oculaire spieren van anterior naar posterior van de baan. Greep het proximale deel van de spier met een pincet en het gebruik van een tweede paar van gebogen gekartelde oog dressing een tang om naar buiten tractie toe te passen op de spier. Zorg ervoor dat het oog dressing pincet georiënteerd zijn in dezelfde richting als de spier bij het trekken om te voorkomen scheuren. Haal de meest anterior van de baan (Superior Oblique) op deze manier. De spier zal bevrijd van diep binnen de baan en de resterende lengte kan worden teruggetrokken om de ogen naar buiten te draaien. </li><li> Herhaal stap 3.8 met de volgende spier (Mediale Rectus), dat is gelegen tussen de lobben van de traanklier en Harderian Gland de buurt van de middellijn van het dorsale oppervlak van het oog. Band naar beneden het oprolmechanisme om tractie te behouden op de spieren. </li><li> Verwijder eventuele resterende bindweefsel over het oppervlak van de traanklier en omhoog tillen van de klier met behulp van pincet. Niet comprimeren of knijp in de klier. Om terug te trekken van de klier, slechts een enkel schip op de achterste paal moet worden verbrand. Til de achterste einde van de klier omhoog, en vervolgens cauterize het schip. </li><li> Volgende naar voren flap de traanklier aan het achterste deel van de baan open en ongehinderde toegang tot de spieren die de oogzenuw liggen boven toe te staan. Houd het gebied constant vochtig met steriele PBS, en drogen met chirurgische watten of wattenstaafjes. </li><li> Met behulp van scherpe tang opnieuw te verwijderen van de dunne bindweefsel dat de spieren van de achterste baan (Levator palpebrae superioris en Superior Rectus) omgeeft en scheiden de onderliggende bundels van de spier. Trek de spieren zelfstandig of in koor, met behulp van de gebogen gekartelde oog dressing pincet, nogmaals, trekken in lijn met de spiervezels. Bevestig de resterende spier lengtes tot het oprolmechanisme, samen met de spieren die zijn ingetrokken in stap 3.8 en 3.9 en band naar beneden het oprolmechanisme tractie toe te passen. Een totaal van vier spieren zal nu worden toegevoegd aan het oprolmechanisme. Dit zal draaien de ogen naar voren en naar buiten om het vet waarin omhulsel dat de oogzenuw omringt te onthullen. </li></ol> 4. Toegang tot de Optic Nerve <ol><li> Gebruik scherpe pincet (Fine tip Dumont) om omhoog te trekken op het bindweefsel dat de vettige omhulsel van de optische zenuw omgeeft. Maak een longitudinale gesneden met behulp van kleine Vannas voorjaar schaar. Vouw de cut als dat nodig is. Het vet opgenomen door het omhulsel beginnen te puilen uit zodra de snede wordt gemaakt. Volgende verwijder de flappen van bindweefsel door zorgvuldig te trekken naar boven vanaf de rand en het afsnijden van de halvemaanvormige kleppen van het weefsel. </li><li> Verwijder het vet bedekkende de oogzenuw door gebruik te maken tang te trekken op het vet, terwijl het snijden met de Vannas veer schaar. Houd het gebied schoon met steriele PBS en chirurgische swabs om de kleine hoeveelheden bloed die voortvloeien uit de verwijdering van het weefsel schoon te maken. </li><li> De oogzenuw is nu zichtbaar. Om de zenuw toegang, moet de meningeale schede die de zenuw omgeeft worden verwijderd zonder beschadiging van de oogheelkundige slagader die de binnenste netvlies feeds. Onderzoek van de vasculaire patroon van de meningeale schede met behulp van een tang om voorzichtig te draaien de schede. Zoek naar een gebied zonder bloedvaten, en op grond waarvan een longitudinale snede te worden gemaakt in de meningeale schede. </li><li> Met behulp van fijne punt Dumont tang, knijp de dura en trek naar boven. De buurt van de basis van de driehoekige wig van dura dat wordt gemaakt, gebruikt u de Vannas voorjaar schaar om een ​​kleine incisie in de schede te maken. Steek het onderste blad van de schaar in de incisie en snijd de schede parallel aan de richting van de oogzenuw, Pas op dat u het vaatstelsel schade met laterale bezuinigingen. Gebruik de tang en schaar om de dura draperen aan weerszijden van de oogzenuw. </li><li> De enige overgebleven bekleding van de zenuw is de arachnoidea membraan. Het is zeer dun en transparant. Om te bepalen of het membraan is nog steeds aanwezig zijn, gebruikt scherpe tang aan het oppervlak van de zenuw bekneld raken. Het de arachnoidea aanwezig is, knijp het membraan en trek naar boven om een ​​driehoekige wig van het weefsel te creëren. Maak een kleine incisie met de punt van de schaar gelijk aan 4,4 Step. Vervolgens steekt u de onderste blad van de schaar en maak een longitudinale snede in de arachnoidea. Vervolgens gebruik je schaar en pincet om de arachnoidea draperen aan weerszijden van de oogzenuw. </li><li> Met behulp van een micro-surgische haak, verheffen de optische zenuw uit de meningeale schede. Voorbij het uiteinde van de haak rond de buitenste rand van de zenuw en zorg ervoor dat de haak blijft in contact met de zenuw, zodat u niet de vangst van de meningeale membranen met de haak en per ongeluk transect ze. Til de optische zenuw uit de meningeale schede en volledig transect de zenuw achter de punt wordt ondersteund door de haak. De doorsneden oogzenuw stronk zal nu een vrij uiteinde, zodat voor het verwijderen van de haak. </li><li> Als de RGC gaan retrogradely worden geëtiketteerd om overleven kwantificeren, plaats een klein stukje gelfoam gedrenkt in 3% Fluorogold (of een ander retrograde tracer) over de doorsneden oogzenuw stomp (zie <a href="https://www.jove.com/details.php?id=2261">Jove-protocol 2261</a> ). </li></ol> 5. Afsluiting en herstel <ol><li> Ontlast de tractie op de extra oculaire spieren en terug te keren het oog naar een neutrale positie. Terwijl u dit doet, zorg ervoor dat de gelfoam duwen naar beneden in de baan van het oog om ervoor te zorgen dat als het oog is terug op zijn plaats gedraaid, de gelfoam blijft rond de oogzenuw stomp. Breng de traanklier en extra oculaire spieren hun natuurlijke positie. </li><li> Zet de klep van de huid aan de middellijn en de hechting van de wond. Van toepassing zijn oogheelkundige oogzalf aan beide ogen. Schakel dan de isofluraan bron en laat het dier om te ademen zuurstof voor enkele minuten. Plaats het dier in een verwarmde kooi of een kooi onder een warmtelamp om te herstellen. Plaats geen beddengoed in het herstel kooi om de kans op aspireren beddengoed tijdens het herstel te elimineren. </li><li> Dieren dienen onafhankelijk van elkaar worden gehuisvest na de operatie. Postoperatieve analgetica moet worden toegediend volgens de richtlijnen van uw dier zorg autoriteiten, en dieren dienen zorgvuldig gecontroleerd te worden na de operatie. </li></ol> 6. Representatieve resultaten: Doorsnijding van de oogzenuw resulteert in het verlies van 90% van de gewonden RGC binnen 14 dagen postaxotomy 9-11. Het belangrijkste mechanisme van de RGC dood is apoptose 9, 12. De normale dichtheid van RGC is ongeveer 2500 cellen / mm 2. Epifluorescentie of confocale beeldvorming kan worden gebruikt om het label retrogradely RGC visualiseren na axotomy. RGC apoptose wordt vertraagd met ongeveer 4 dagen na de axotomy, het verlaten van een tijdvenster voor experimentele manipulaties. Op 1 dag na axotomy en retrograde etikettering met Fluorogold, RGC cellichamen in het ganglion cellaag van het netvlies en axon bundels in de zenuwvezellaag van het netvlies zijn duidelijk zichtbaar wanneer imaging een flatmounted voorbereiding (figuur 1a). Van 14 dagen na axotomy, hebben de meerderheid van de RGC stierf, en een paar overgebleven RGC worden afgewisseld tussen het netvlies microglia (afb. 1b). Bij het ​​RGC ondergaan apoptose, microglia fagocyteren de dode cellen en als gevolg daarvan worden transcellularly gelabeld met de fluorescerende tracer die werd gebruikt om het RGC 13, 14 label. Het uiterlijk van de tracer in de fagosomen van microglia verschilt van die in overleven RGC. Microglia bevatten de tracer in zeer geconcentreerd en zeer helder fagosomen die relatief groot en verspreid over hun cytoplasma (afb. 1c). RGC heeft een meer diffuus patroon van vlekken (figuur 1c) met kleine blaasjes die punctata zijn retrogradely zijn vervoerd naar hun axonen het indienen van de cel cytoplasma. Deze blaasjes zijn veel kleiner en hebben minder intense fluorescentie zodat men overgebleven RGC te onderscheiden van microglia. Bovendien, microglia hebben veel kleinere cellichamen en hebben de neiging om een ​​stervormige of amoeboid morfologie in tegenstelling tot RGC dat relatief groot en rond cellichamen te hebben. De dendritische bomen van RGC kan ook helpen onderscheiden ze van de korte felle processen van microglia, toen de kwantificering van overleving van de cel. Overleving van de cel kan worden gekwantificeerd in verschillende regio's van het netvlies en de dichtheid (cellen / mm 2) kan worden afgeleid uit het gebied van de overeenkomstige microfoto, omdat RGC zijn te vinden in een monolaag binnen het ganglion cel laag. <img src="/files/ftp_upload/2241/2241fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Epifluorescentie microfoto van Fluorogold gelabeld RGC na axotomy en toepassing van de tracer aan de oogzenuw stomp. (A) 1 dag na axotomy RGC en hun axon bundels zijn voorzien van de tracer in een fijn punctata manier. (B) Uiterlijk 14 dagen na axotomy, hebben 90% van de RGC overleden en helder gelabeld microglia die hebben gefagocyteerd dode cellen zijn ook voorzien van de tracer. (C) Hogere vergroting illustreert het verschil tussen de RGC en microglia (rood pijlpunten) op 14 dagen postaxotomy. Schaalbalk in A en B is 50 micrometer. Schaalbalk in C is 25 micrometer.

<ol><li>Bahr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+or+let+die+-+retinal+ganglion+cell+death+and+survival+during+development+and+in+the+lesioned+adult+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Live or let die - retinal ganglion cell death and survival during development and in the lesioned adult CNS.</a> Trends Neurosci. 23, 483-4890 (2000).</li>
<li>Isenmann, S., Kretz, A., Cellerino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinants+of+retinal+ganglion+cell+development%2C+survival%2C+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular determinants of retinal ganglion cell development, survival, and regeneration.</a> Prog Retin Eye Res. 22, 483-543 (2003).</li>
<li>Koeberle, P. D., Bahr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+guidance+cues+for+regenerating+axons%3A+where+have+they+gone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Growth and guidance cues for regenerating axons: where have they gone.</a> J Neurobiol. 59, 162-180 (2004).</li>
<li>Weishaupt, J. H., Bahr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degeneration+of+axotomized+retinal+ganglion+cells+as+a+model+for+neuronal+apoptosis+in+the+central+nervous+system+-+molecular+death+and+survival+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Restor.+Neurol.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Degeneration of axotomized retinal ganglion cells as a model for neuronal apoptosis in the central nervous system - molecular death and survival pathways.</a> Restor. Neurol. Neurosci. 19, 1-2 (2001).</li>
<li>Valenzuela, G. arcia, E, S. C. S. harma <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+retinal+ganglion+cells+from+axotomy-induced+apoptosis+through+TRK+oncogene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Rescue of retinal ganglion cells from axotomy-induced apoptosis through TRK oncogene transfer.</a> Neuroreport. 9, 3165-3170 (1998).</li>
<li>Kugler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+of+axotomized+retinal+ganglion+cells+by+adenoviral+vector+administration+at+the+optic+nerve+stump%3A+an+in+vivo+model+system+for+the+inhibition+of+neuronal+apoptotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Transduction of axotomized retinal ganglion cells by adenoviral vector administration at the optic nerve stump: an in vivo model system for the inhibition of neuronal apoptotic cell death.</a> Gene Ther. 6, 1759-1767 (1999).</li>
<li>Lingor, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+apoptosis+mediators+by+RNAi+inhibits+axotomy-induced+retinal+ganglion+cell+death+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of apoptosis mediators by RNAi inhibits axotomy-induced retinal ganglion cell death in vivo.</a> Brain. 128, 550-558 (2005).</li>
<li>Koeberle, P. D., Gauldie, J., Ball, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+adenoviral-mediated+gene+transfer+of+interleukin-10%2C+interleukin-4%2C+and+transforming+growth+factor-beta+on+the+survival+of+axotomized+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Effects of adenoviral-mediated gene transfer of interleukin-10, interleukin-4, and transforming growth factor-beta on the survival of axotomized retinal ganglion cells.</a> Neuroscience. 125, 903-920 (2004).</li>
<li>Berkelaar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axotomy+results+in+delayed+death+and+apoptosis+of+retinal+ganglion+cells+in+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Axotomy results in delayed death and apoptosis of retinal ganglion cells in adult rats.</a> J Neurosci. 14, 4368-4374 (1994).</li>
<li>Villegas-Perez, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influences+of+peripheral+nerve+grafts+on+the+survival+and+regrowth+of+axotomized+retinal+ganglion+cells+in+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Influences of peripheral nerve grafts on the survival and regrowth of axotomized retinal ganglion cells in adult rats.</a> J Neurosci. 8, 265-280 (1988).</li>
<li>Villegas-Perez, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+protracted+phases+of+retinal+ganglion+cell+loss+follow+axotomy+in+the+optic+nerve+of+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Rapid and protracted phases of retinal ganglion cell loss follow axotomy in the optic nerve of adult rats.</a> J Neurobiol. 24, 23-36 (1993).</li>
<li>Quigley, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+ganglion+cell+death+in+experimental+glaucoma+and+after+axotomy+occurs+by+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retinal ganglion cell death in experimental glaucoma and after axotomy occurs by apoptosis.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 36, 774-786 (1995).</li>
<li>Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+transcellular+carbocyanine-labelling+of+rat+retinal+microglia+during+injury-induced+neuronal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Specific transcellular carbocyanine-labelling of rat retinal microglia during injury-induced neuronal degeneration.</a> Neurosci Lett. 127, 108-1012 (1991).</li>
<li>Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+transcellular+staining+of+microglia+in+the+adult+rat+after+traumatic+degeneration+of+carbocyanine-filled+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Specific transcellular staining of microglia in the adult rat after traumatic degeneration of carbocyanine-filled retinal ganglion cells.</a> Exp Eye Res. 55, 101-117 (1992).</li>
</ol>

Er zijn vele variaties van deze chirurgische procedure en een aantal van de stappen in dit protocol zijn niet nodig. Het is alleen nodig om de spieren die de oogzenuw liggen boven om toegang te krijgen tot de zenuw trekken. Echter, dit resulteert in een zeer beperkte werkruimte rondom de zenuw waardoor de kritieke laatste stadia van doorsnijding moeilijker. In bepaalde situaties is het wenselijk om transfecteren de cellen van de oogzenuw stomp en de toegenomen toegang tot de ruimte geboden door het terugtrekken van alle...

<table><tbody><tr><td>Stereotaxisch frame</td><td>Stoelting Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gasmasker voor ratten</td><td>Stoelting Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anesthesiesysteem</td><td>VetEquip</td><td>901806</td><td></td></tr><tr><td>Isofluraan (&lt;sup&gt;Pr&lt;/sup&gt;AErrane)</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>DIN 02225875</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische microscoop</td><td>WPI, Zeiss, Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorogold -(hydroxystilbamidine bis(methansulfonaat)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39286</td><td></td></tr><tr><td>Gelfoam</td><td>Pharmacia Corporation (Pfizer)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tears Naturale P.M.</td><td>Alcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proviodine</td><td>Medline Industries</td><td>MDS093945H</td><td></td></tr><tr><td>Vannas-veerschaar</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Dumont-pincet met fijne punt</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Microchirurgische haak</td><td>Fine Science Tools</td><td>10062-12</td><td></td></tr><tr><td>Gekarteld oogverbandpincet</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>Scherp gebogen gekarteld Dumont #7b pincet</td><td>Fine Science Tools</td><td>11270-20</td><td></td></tr><tr><td>Cauterisator</td><td>Fine Science Tools</td><td>18010-00</td><td></td></tr></tbody></table>

optic nerve transsectie: een model van de volwassen neuron apoptosis in het centrale zenuwstelsel

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Retinale ganglioncellen (RGC) zijn CNS neuronen die uitvoer visuele informatie van het netvlies naar de hersenen, via de oogzenuw. De oogzenuw kan worden benaderd binnen de baan van het oog en volledig doorsneden (axotomized), het snijden van de axonen van de gehele bevolking RGC. Oogzenuw doorsnijding is een reproduceerbaar model van apoptotische neuronale celdood in de volwassen CZS 1-4. Dit model is vooral aantrekkelijk omdat het glasvocht kamer van het oog werkt als een capsule voor drug delivery aan het netvlies, waardoor experimentele manipulaties via intra-oculaire injectie. De verspreiding van chemische stoffen door het glasvocht vloeistof zorgt ervoor dat ze reageren op de hele RGC bevolking. Bovendien kan RGC selectief worden getransfecteerd door het toepassen van korte interfererende RNA (siRNA&#39;s), plasmiden, of virale vectoren om het afgesneden uiteinde van de oogzenuw 5-7 of injecteren van vectoren in hun doel, de superieure colliculus 8. Dit stelt onderzoekers in staat om apoptotische mechanismen in de gewenste neuronale populatie bestuderen zonder verstorende effecten op andere omstander neuronen of de omliggende glia. Een bijkomend voordeel is het gemak en de nauwkeurigheid waarmee de overleving van de cel kan worden gekwantificeerd na letsel. Het netvlies is een vlak, gelaagd weefsel en RGC zijn gelokaliseerd in de binnenste laag, het ganglion cel laag. Het voortbestaan ​​van RGC kan worden gevolgd na verloop van tijd door het toepassen van een fluorescerende tracer (3% Fluorogold) om het afgesneden uiteinde van de oogzenuw op het moment van axotomy, of door het injecteren van de tracer in de superieure colliculus (RGC doel) een week voorafgaand aan de axotomy. De tracer is retrogradely vervoerd, de etikettering de hele RGC bevolking. Omdat de ganglion cellaag is een monolaag (een cel dik), kan RGC dichtheden worden gekwantificeerd in flat gemonteerd weefsel, zonder de noodzaak voor stereology. Oogzenuw doorsnijding leidt tot de apoptotische dood van 90% van de gewonden RGC binnen 14 dagen postaxotomy 9-11. RGC apoptose heeft een karakteristieke tijd-cursus, waarbij celdood wordt vertraagd 3-4 dagen postaxotomy, waarna de cellen snel degenereren. Dit levert een tijdvenster voor experimentele manipulaties gericht tegen routes die betrokken zijn bij apoptose.

Optic Nerve doorsnijding is een veel gebruikt model van de volwassen CNS verwonding. Negentig procent van de retinale ganglioncellen (RGC), waarvan de axonen volledig doorsneden (axotomy) sterven binnen 14 dagen na axotomy. Dit model is lastig om experimentele manipulaties en zeer reproduceerbaar.

Optic Nerve transsectie: Een model van de volwassen Neuron Apoptosis in het centrale zenuwstelsel

Retinale ganglioncellen (RGC's) zijn neuronen in het centraal zenuwstelsel die visuele informatie vanuit het netvlies naar de hersenen transporteren via de nervus opticus.
De nervus opticus kan worden ...

Retinale ganglioncellen of RG C's zijn neuronen van het centrale zenuwstelsel die visuele informatie van het netvlies naar de hersenen overbrengen via de oogzenuw Optic nerve. Transectie is een reproduceerbaar model van apoptotische neuronale celdood in het volwassen centrale zenuwstelsel. Hier wordt de transectie van de oogzenuw uitgevoerd door de superieure oogkas te openen, om zo toegang te verkrijgen tot de structuren die over de oogzenuw liggen.De traanklier en de extraoculaire spieren worden teruggetrokken en de meningeale omhulsels van de oogzenuw worden geopend. De oogzenuw wordt vervolgens uit de meningeale omhulsels getild en doorgesneden. Uiteindelijk sterft 90% van de beschadigde retinale ganglioncellen, waarvan de axonen de oogzenuw vormen, binnen twee weken na het letsel door geprogrammeerde celdood.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere hersenbeschadigingsmodellen is dat de doorsnijding van de oogzenuw reproducebaarder is en de beschadigde neuronen eenvoudiger kunnen worden getarget door experimentele manipulaties. De implicaties van deze techniek reiken tot therapieën voor letsel en ziekten van het centrale zenuwstelsel, aangezien het neurale netvlies deel uitmaakt van het centrale zenuwstelsel van volwassenen. Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Philippe Donofrio en Mark Magus aan promovendi uit mijn laboratorium.Begin deze procedure door een rat in de anesthesiebox te plaatsen en een isofluraanconcentratie van 4% in te stellen. Zodra de ademhaling van het dier vertraagd is, schakelt u de gasstroom over naar de gasmaskeraansluiting van het stereotaxische frame en plaatst u het dier in het stereotaxische apparaat. Zet vervolgens de isofluraanconcentratie terug naar 2%. Plaats de neuskegel en monitor de anesthesie. Bevochtig de vacht bovenop de kop met 70% ethanol om de vacht makkelijker te kunnen wegsnijden.Verwijder vervolgens met een tondeuse de vacht tussen de ogen met behulp van steriele gazen kompressen. Reinig het incisiegebied met drie opeenvolgende toepassingen van Betadine, gevolgd door 70% ethanol. Breng daarna een oogzalf aan op het hoornvlies om uitdroging tijdens de operatie te voorkomen en verspreid de zalf over het oppervlak door de oogleden te openen en te sluiten.Maak met een mesje nr. 11 een incisie langs de middellijn van de kop, van ongeveer 0,5 centimeter vóór de ogen tot één centimeter achter de ogen. Trek met een pincet de huidflap over het oog terug. Gebruik de rug van het scalpel om het onderliggende bindweefsel voorzichtig weg te scheiden en de bovenliggende huid los te maken.Trek vervolgens de huidflap zijwaarts en naar beneden en houd deze op zijn plaats met een chirurgische retractor. Plak de retractor vast aan de basis van het stereotaxische instrument en maak, terwijl u de bovenliggende fascia met een scherpe pincet naar boven trekt, een incisie langs de superieure rand van het oogkastbeen. Hiermee wordt de fascia over de oogkas verwijderd.Gebruik een pincet om op de fascia boven de oogkas te drukken en bakken met een klein cauterisatie-apparaat duidelijk de rand van het orbitale bot af. Het gebruik van het cauterisatie-apparaat voorkomt bloedingen uit de onderliggende vaten die communiceren met de veneuze sinussen. Gebruik koud steriel PBS om elk bloed uit het operatiegebied te verwijderen.Het operatiegebied dient op deze wijze periodiek te worden gereinigd om een betere visualisatie van de structuren in de oogkas mogelijk te maken. Zodra de incisie is gereinigd, worden een pincet en de achterzijde van het scalpel gebruikt om het bindweefsel aan de achterzijde van het oog, dat over de inhoud van de oogkas ligt, te verwijderen. Hierdoor wordt de oogholte geopend, wat een groter chirurgisch werkveld oplevert.Gebruik vervolgens Dumont nummer zeven B scherp gebogen gecarveerde pincetten om het bindweefsel te verwijderen dat de oogtak van de nervus trigeminus omringt, welke zich nabij de middellijn bevindt, en verwijder de zenuw met een pincet. Hoewel deze stap niet noodzakelijk is, zorgt het verwijderen van de zenuw later voor een groter toegangsvenster tot de nervus opticus. Gebruik een pincet om het bloedvat eronder terug te trekken en cauteriseer het vat volledig.Deze stap is ook niet noodzakelijk, maar cauterisatie van het vat maakt het mogelijk dit anterieur te verplaatsen, waardoor er een groter venster ontstaat. Zodra de oogzenuw is bereikt, gebruikt u een pincet waarvan de punt naar binnen is gebogen om voorzichtig de dunne laag bindweefsel over de extraoculaire spieren en de traanklier weg te pellen en te verwijderen.Trek de extraoculaire spieren van het voorste naar het achterste gedeelte van de oogkas. Pak het proximale deel van de spier vast met een pincet en gebruik een tweede paar gebogen, gekartelde ooghechtpincetten, georiënteerd in dezelfde richting als de spier, om naar buiten toe tractie uit te oefenen. Verwijder de meest anterieure spier van de oogkas, de musculus obliquus superior.Verwijder, opnieuw met dezelfde techniek, de musculus rectus medialis die tussen de lobben van de traanklier ligt en de harde klier nabij de middellijn van het dorsale oppervlak van het oog. Verwijder met een pincet voorzichtig al het overgebleven bindweefsel over het oppervlak van de traanklier en til de klier omhoog. Druk de klier niet samen of knijp er niet in om deze terug te trekken.Til het posterieure uiteinde van de klier omhoog en cauteriseer vervolgens het vat bij de posterieure pool. Klap daarna de traanklier naar voren om het posterieure deel van de oogkas te openen, zodat er ongehinderde toegang is tot de spieren die over de oogzenuw liggen. Breng opnieuw steriele PBS aan om het gebied vochtig te houden en verwijder bloed met chirurgische watten met behulp van fijne pincetten.Verwijder opnieuw het dunne bindweefsel dat de spieren van de posterieure orbit omringt en scheid de onderliggende spierbundels met de gebogen gekartelde oogdressingspinset. Trek in de richting van de spiervezels om de spieren afzonderlijk of gezamenlijk terug te trekken. Bevestig tot slot de resterende lensspier samen met de teruggetrokken spieren aan de retractor en zet de retractor met tape vast om tractie uit te oefenen.Hiermee wordt het oog naar voren en naar buiten gedraaid om de vetbevattende schede rondom de nervus opticus bloot te leggen. Trek met een fijne Dumont-pincet het bindweefsel dat de vetrijke schede van de nervus opticus bedekt omhoog en maak met kleine veneuze veerschaaren een longitudinale incisie.Vergroot de incisie indien nodig. Het vet in de schede zal naar buiten beginnen te puilen. Trek vervolgens voorzichtig aan de rand en snijd de halvemaanvormige weefselflappen weg, terwijl u een pincet gebruikt om het vet naar buiten te trekken.Verwijder het vetweefsel bovenop de oogzenuw met de Venice-veerschaar. Maak met steriele PBS en chirurgische watten de kleine hoeveelheden bloed schoon die vrijkomen bij het verwijderen van het weefsel. De oogzenuw is nu zichtbaar om toegang tot de oogzenuw te verkrijgen.De meningeale schede die de zenuw omhult, moet worden verwijderd zonder de arteria ophthalmica, die de binnenste retina voedt, te beschadigen. Draai de schede voorzichtig met een pincet en onderzoek het vasculaire patroon van de meningeale schede met een Dumont-pincet met fijne punten. Knijp in de dura en trek deze omhoog, waardoor er een driehoekige wig bij de basis van de wig ontstaat.Gebruik de schaar om een kleine longitudinale incisie in het meningeale omhulsel te maken. Let er hierbij op dat de vaten niet beschadigd raken. Steek het onderste blad van de schaar in de incisie en knip het omhulsel parallel aan de richting van de nervus opticus.Gebruik de pincet en schaar om de dura naar beide zijden van de oogzenuw te draperen. De enige resterende bedekking van de zenuw is het dunne, transparante arachnoïdale membraan. Om vast te stellen of het membraan nog aanwezig is, gebruikt u een fijne pincet om het oppervlak van de zenuw samen te knijpen en van het oppervlak af te trekken. Als de meningeale vliezen nog aanwezig zijn, zullen deze zichtbaar zijn.Als de arachnoidea aanwezig is, knijp dan in het membraan en trek dit omhoog. Maak een kleine incisie met de punt van de schaar om een driehoekig weefselsegment te creëren. Voer vervolgens het onderste blad van de schaar in en maak een longitudinale snede in de arachnoidea.Gebruik vervolgens een schaar en een pincet om de arachnoidea naar beide zijden van de nervus opticus te draperen. Til de nervus opticus met een microschirurgische haak uit de meningeale schede. Plaats de punt van de haak rond de buitenrand van de zenuw en zorg ervoor dat de haak in contact blijft met de zenuw.Voorkom dat de meningeale membranen met de haak worden gegrepen en per ongeluk worden doorgesneden. Til de nervus opticus voorzichtig uit de meningeale schede en snijd de zenuw volledig door achter het punt dat door de haak wordt ondersteund. De doorgesneden stomp van de nervus opticus heeft nu een vrij uiteinde.Verwijder de haak als de RG-cellen retrograad gelabeld zullen worden. Om de overleving te kwantificeren, plaatst u een klein stukje gel-schuim, gedrenkt in 3% fluoro gold of een andere retrogradaire tracer, over de doorgesneden stomp van de nervus opticus. Verlicht de tractie op de extraoculaire spieren en druk op het superieure oogoppervlak richting de middellijn om het oog terug te brengen naar een neutrale positie.Duw tegelijkertijd de gel-tampon naar beneden in de oogkas. Dit zorgt ervoor dat het oog terug op zijn plaats wordt gedraaid en dat het gelfoam rond de oogzenuwstomp blijft. Plaats de traanklier en de extraoculaire spieren terug in hun natuurlijke positie, breng de huidflap terug naar de middellijn en hecht de wond.Breng oogzalf aan in beide ogen. Zodra de operatie is voltooid, schakelt u de isofluraan uit en laat u het dier enkele minuten zuurstof inademen. Verwijder het dier uit het stereotaxische apparaat.Plaats het dier in een kooi onder een warmtelamp om te herstellen, om te voorkomen dat de rat tijdens het herstel bedding aspireert. Zorg ervoor dat er geen bedding in de herstelkooi aanwezig is. Dien postoperatieve analgetica toe.Monitor het dier na de operatie zorgvuldig volgens de institutionele richtlijnen. Transectie van de nervus opticus resulteert in het verlies van 90% van de beschadigde RGC binnen 14 dagen na de taxotomie. Het belangrijkste mechanisme van RGC-dood is apoptose.De normale dichtheid van RG C's is ongeveer 2.500 cellen per vierkante millimeter. Epi-fluorescentie- of confocale beeldvorming kan worden gebruikt om retrograad gelabelde RG C's te visualiseren. Na de taxotomie.Apoptose van RGC's wordt met ongeveer vier dagen uitgesteld na een optic nerve transection (ONX), waardoor er een tijdvenster ontstaat voor experimentele manipulaties één dag na de ONX en retrograde labeling met Flora Gold; RGC-cellichamen in de ganglioncellaag van het netvlies en axonale resten in de zenuwvezellaag van het netvlies zijn duidelijk zichtbaar. Bij beeldvorming van een flat-mount preparaat 14 dagen na ONX zijn de meeste RGC's gestorven en zijn enkele overgebleven RGC's verspreid tussen retinale microglia. Wanneer RGC's apoptose ondergaan, fagocyteren microglia de dode cellen en worden ze als gevolg hiervan cellulair gelabeld met de fluorescerende tracer die werd gebruikt om de RGC's te labelen, hier aangegeven door de rode pijlpunten.Het uiterlijk van de tracer in de fagosomen van microglia verschilt van dat in overlevende rgc. Microglia bevatten de tracer in sterk geconcentreerde, extreem heldere fagosomen die relatief groot zijn en verspreid liggen door hun cytoplasma. RG CS vertonen een diffuser kleuringspatroon met kleine punctate blaasjes die retrograden zijn getransporteerd via hun axonen, waardoor het cellcytoplasma wordt gevuld.Deze blaasjes, aangegeven door de witte pijlen, zijn veel kleiner en vertonen een minder intense fluorescentie, waardoor overlevende RGC's van microglia kunnen worden onderscheiden. Bovendien hebben microglia veel kleinere cellichamen en vertonen ze vaak een ST- of AME-bordmorfologie, in tegenstelling tot RGC's die relatief grote en afgeronde cellichamen hebben. Eenmaal gemaskeerd kan deze techniek succesvol in 15 minuten worden voltooid mits correct uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om beschadiging aan de bloedvoorziening van het netvlies te voorkomen, omdat het netvlies zal degenereren als de vaten worden aangetast na deze procedure.Andere methoden, zoals intraoculaire injecties of injecties in de doorgesneden oogzenuwstomp, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals wat de mechanismen zijn die betrokken zijn bij apoptose van retinale ganglioncellen.

optic-nerve-transection-model-adult-neuron-apoptosis-central-nervous

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Optic Nerve doorsnijding is een veel gebruikt model van de volwassen CNS verwonding. Dit model is ideaal voor het uitvoeren van een aantal experimentele manipulaties die het netvlies doel wereldwijd of direct de doelstelling van de gewonden neuronale populatie van retinale ganglioncellen.

Methoden voor experimentele manipulaties na Optic Nerve doorsnijding in het zoogdier CZS

Dit protocol laat zien hoe retrogradely label retinale ganglioncellen, en hoe nadien tot een oogzenuw crush om retinale ganglion cel overleving en apoptose te analyseren. Het is een experimenteel ziekte model voor verschillende typen van optische neuropathie, zoals glaucoom.

Een Optic Nerve Crush letsel muismodel om retinale ganglion cel Survival Study

Source: Portela-Lomba, M., et. al. Coculture of Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia, as an In Vitro Model of Adult Axonal Regeneration. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates imaging and quantification of axonal regeneration in axotomized rat retinal ganglion neurons (RGNs) co-cultured with immortalized human olfactory ensheathing glia cells. RGNs are immunolabeled, with red somas and green axons. Images were captured using an epifluorescence microscope,...

Imaging and Quantification of Axonal Regeneration in Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons

Olfactorische ensheathing cellen (OECS) zijn neurale lijst cellen die de groei van de primaire olfactorische neuronen mogelijk te maken. Deze specifieke eigenschap kan worden gebruikt voor cellulaire transplantatie. We presenteren hier een model van cellulaire transplantatie gebaseerd op het gebruik van OECS in een laryngeal zenuwletsel model.

Transplantatie van olfactorische Ensheathing Cellen tot functioneel herstel Evalueer na perifere zenuwschade

Om mechanismen van demyelinisatie en neuronale apoptose in corticale laesies van inflammatoire demyeliniserende aandoeningen aan te pakken, worden verschillende diermodellen gebruikt. We beschrijven hier een ex vivo benadering door gebruik te maken van oligodendrocyten-specifieke CD8+ T-cellen op herfsneden, wat resulteert in oligodendrogliale en neuronale dood. Potentiële toepassingen en beperkingen van het model worden besproken.

Een Ex vivo Model van een Oligodendrocyte gericht T-Cell Attack in Acute Brain Slices

We presenteren een chirurgisch protocol dat beschrijft hoe een snij- of verpletteringsaxotomie op de aangezichtszenuw bij de muis moet worden uitgevoerd. De axotomie van de aangezichtszenuw kan worden gebruikt om de fysiologische reactie op zenuwbeschadiging te bestuderen en therapeutische technieken te testen.

Facial Nerve axotomie in Muizen: een model om motoneuron Response to Injury Study

Secundaire degeneratie van het netvlies peesknoopcellen (RGCs) komt vaak voor bij glaucoom. Deze studie beschrijft een innovatieve operationele aanpak voor gedeeltelijke oogzenuw transect. Het gebruik van deze ruimtebesparende operationele aanpak strekt zich uit de modellenreeks van de toepassing en kunt verkenning van secundaire schade mechanismen in RGCs op een nieuwe manier.

Gedeeltelijke oogzenuw transect bij ratten: een Model tot stand gebracht met een nieuwe operationele aanpak om te beoordelen van secundaire degeneratie van het netvlies peesknoopcellen

We presenteren een in vitro model om olfactorisch verwarmend glia (OEG) neuroregeneratief vermogen te beoordelen, na neuraal letsel. Het is gebaseerd op een cocultuur van axotomized volwassen retinale ganglion neuronen (RGN) op OEG monolagen en daaropvolgende studie van axonale regeneratie, door het analyseren van RGN axonale en somatodendritische markers.

Cocultuur van Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons met Olfactory Ensheathing Glia, als een In Vitro Model van Volwassen Axonale Regeneratie

Dit protocol beschrijft een op maat gemaakt luchtdruksysteem dat is ontworpen om verwondingen aan het centrale zenuwstelsel (CZS) van een gesloten systeem bij muizen te induceren, inclusief oculaire, hersen- en ruggenmergtrauma's. Het doel van dit protocol is om een kader te bieden voor onderzoekers om het systeem gemakkelijk aan te passen en uit te breiden voor hun unieke CZS-traumastudies.

Systeem voor focaal, gesloten systeem letsel aan het centrale zenuwstelsel

Dit artikel bevat gedetailleerde instructies voor het uitvoeren van oogzenuwverbrijzeling in een konijnenmodel met behulp van standaard oogheelkundige chirurgische technieken.

Een chirurgische benadering voor oogzenuwverbrijzeling in een konijnenmodel

Leer optic nerve transectie voor het bestuderen van neuronale apoptose in het volwassen centrale zenuwstelsel. Dit reproduceerbare model onderzoekt retinale ganglioncellen en helpt bij het ontwikkelen van neuroprotectieve strategieën.

Optic Nerve transsectie: Een model van de volwassen Neuron Apoptosis in het centrale zenuwstelsel

Meer video's verkennen