Methoden voor experimentele manipulaties na Optic Nerve doorsnijding in het zoogdier CZS
May 12th, 2011
Optic Nerve doorsnijding is een veel gebruikt model van de volwassen CNS verwonding. Dit model is ideaal voor het uitvoeren van een aantal experimentele manipulaties die het netvlies doel wereldwijd of direct de doelstelling van de gewonden neuronale populatie van retinale ganglioncellen.
Retinaal ganglioncellen of RG-cellen zijn neuronen van het centrale zenuwstelsel die visuele informatie via de oogzenuw van het netvlies naar de hersenen overbrengen. In de bijbehorende video werd een methode gedemonstreerd voor ex sodomisatie of het doorknippen van de axonen van de volledige RGC-populatie als een model van apoptotische neurale celdood in het centrale zenuwstelsel van volwassenen. Hier wordt deze methode gekoppeld aan procedures die direct neurotrofe factoren, korte interfererende RNA's, plasmiden of virale vectoren aanbrengen die anti ATO-eiwitten coderen op gewonde retinaal ganglioncellen of het netvlies om het netvlies globaal te targeten.
Een intraoculaire injectie-apparatuur wordt geassembleerd en gebruikt om stoffen in de glaskamer van het oog te injecteren om specifiek retinaal ganglioncellen te targeten. Hetzij wordt Gelfoam geplaatst of een Hamilton-spuit gebruikt om stoffen in de oogzenuw te injecteren. Stump-beeldvorming resultaten geven aan dat de overleving van retinaal ganglioncellen kan worden verhoogd door de levering van anti-apoptotische factoren.
Met behulp van deze technieken kan deze methode worden gebruikt om eiwitten te identificeren die betrokken zijn bij apoptose van volwassen neuronen in het centrale zenuwstelsel. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot therapie of diagnose van ziekten van het centrale zenuwstelsel omdat oogzenuwdoorsnijding een reproduceerbaar model is voor neuronale apoptose in het volwassen CZS Over het algemeen worstelen degenen die nieuw zijn in deze techniek omdat ze de lens beschadigen bij het inbrengen van de glazen pipet in de glaskamer van het oog. Om het spuitsysteem voor intraoculaire injecties voor te bereiden, begint u door eventuele naald of RN-moer te verwijderen.
Aanwezig op een 10 microliter rn gast tight 1701 Hamilton-spuit. Plaats de PFA feral in de piekcup feral van de compressiefitting. Plaats vervolgens de complete fitting in het uiteinde van de spuit en schroef de RN-moer losjes over de bovenkant.
Plaats een uiteinde van een 16e inch piekbuis in de compressiefitting via de opening in de RN-moer. Zorg ervoor dat de piekbuis volledig is geplaatst. Draai de RN-moer vast om de feral te comprimeren, waardoor de piekbuis wordt afgedicht.
Herhaal dit proces aan beide uiteinden van de dubbele RN-glaskoppeling. Bevestig het vrije uiteinde van de piekbuis aan het ene uiteinde van de dubbele RN-glaskoppeling door de RN-moer vast te draaien. De glazen micropipet zal de naald en het vat vormen voor het injectiesysteem.
Plaats de glazen pipet in het vrije uiteinde van de dubbele RN-glaskoppeling. Draai de RN-moer vast om de pipet op zijn plaats te fixeren. Maak onder een dissectiemicroscoop een tip met de juiste diameter door een getrokken micropipet onder een hoek te houden en de tip langs het glazen beslag van een glasplaatje te wrijven om een breuk te creëren.
Idealiter zou de uiteindelijke tip lichtjes moeten worden afgeschuind. Gebruik vervolgens een primend setje van Hamilton Syringe Company gevuld met een spuit, piekbuisverbinding, dubbele RN-glaskoppeling en de glazen micropipet met minerale olie voor gebruik. Vervang met het hydraulische injectiesysteem de naald door een Hamilton 9 0 0 3 0 naald.
Plaats vervolgens een rubberen septum over de Hamilton 9 0 0 3 0 naald om een afdichting te bieden tijdens het injecteren van de minerale olie. Plaats de Hamilton 9 0 0 3 0 naald van de primend spuit in de achterkant van de vat van de 10 microliter Hamilton-spuit van het injectiesysteem. Druk het septum stevig tegen het uiteinde van de spuit om een afdichting te creëren.
Verlaag langzaam de zuiger, minerale olie zal door de glazen elementen van het injectiesysteem gaan. Het vullen van de glazen pipet. Duw al het olie door het injectiesysteem om eventuele luchtbellen langs de tractus te verwijderen.
Als de vulspuit geen minerale olie meer heeft, trekt u de naald langzaam terug terwijl u constant olie afgeeft. Om luchtbellen te voorkomen, vult u de primend spuit opnieuw en injecteert u opnieuw. Wanneer het hele systeem gevuld is met minerale olie, plaatst u de originele zuiger van de 10 microliter.
Hamilton-spuit drukt de zuiger volledig in om extra minerale olie uit het systeem te verwijderen. Veeg de glazen micropipet en het uiteinde van de spuit schoon. Met 70% ethanol trekt u de zuiger terug naar de twee microliter markering op de vat.
Het uiteinde van de glazen micropipet zal met lucht vullen, wat een bufferzone biedt tussen de minerale olie en de vloeistof die moet worden geïnjecteerd. Vul de pipetvat door het uiteinde van de micropipet in de gewenste oplossing te plaatsen en de zuiger van de Hamilton-spuit terug te trekken. Er wordt niet meer dan vier tot vijf microliters oplossing in een volwassen rattenoog geïnjecteerd om de intraoculaire injectie uit te voeren.
Begin met het schakelen van de gasstroom naar de gasmaskerbijlage voor het stereotactische frame. Plaats vervolgens een met isoflurine verdovingsmiddel gedode rat in het stereotactische apparaat. Zet de isoflurineconcentratie naar beneden op 2% en controleer de anesthesie.
Bedek het dier met een chirurgische deken. Om de lichaamstemperatuur gedurende de operatie te handhaven, opent u de oogleden en plaatst u een druppel acan-anesthesieoplossing. Op het oppervlak van het hoornvlies vereist injectie twee personen, een om de glazen pipet in de glaskamer te plaatsen en de pipetpositie te handhaven.
En een andere om de zuiger op de spuit in te drukken, die de gewenste oplossing levert. Grijp onder een chirurgische microscoop de glazen micropipet en de dubbele RN-glaskoppeling, spreid de oogleden uit en vorm een V-vorm tegenover de injectieplaats. Met de vingers zal het oog uit de baan worden geheven. Voer voorzichtig de punt van de glazen micropipet in een gebied zonder bloedvaten door en door de sclera onder een neerwaartse hoek.
Wanneer de pipet de sclera doordringt, zal een kleine pop worden gevoeld. De persoon die de spuit vasthoudt, moet nu vier microliters oplossing injecteren door de zuiger in te dru
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel bespreekt het optische zenuwdoorsnijdingsmodel, dat veel wordt gebruikt om verwondingen van het centrale zenuwstelsel bij volwassenen te bestuderen. Het richt zich op experimentele manipulaties die gericht zijn op retinale ganglioncellen (RGC's) om apoptotische neurale celdood te begrijpen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Neurobiologie
Achtergrond
- Retinale ganglioncellen transporteren visuele informatie van het netvlies naar de hersenen.
- Optic zenuwdoorsnijding dient als een model voor het bestuderen van CZS-verwondingen.
- Het begrijpen van RGC-overleving is cruciaal voor het ontwikkelen van therapeutische strategieën.
- Experimentele manipulaties kunnen zich richten op neurotrofe factoren en andere agentia.
Doel van het onderzoek
- Om een methode te demonstreren voor het doorsnijden van axonen van RGC's.
- Om de effecten van anti-apoptotische factoren op RGC-overleving te onderzoeken.
- Om inzichten te bieden in mogelijke behandelingen voor CZS-verwondingen.
Gebruikte methoden
- Intraoculaire injectieapparatuur voor het afleveren van substanties in het oog.
- Gebruik van Gelfoam of Hamilton spuiten voor optic zenuwinjecties.
- Toepassing van neurotrofe factoren, korte interfererende RNA's en plasmiden.
- Stump imaging om RGC-overleving na behandeling te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- Gedemonstreerde methode voor RGC axon doorsnijden.
- Verhoogde overleving van RGC's met levering van anti-apoptotische factoren.
- Succesvolle targeting van neurotrofe factoren naar beschadigde cellen.
- Inzichten in de mechanismen van neurale celdood en overleving.
Conclusies
- Het optische zenuwdoorsnijdingsmodel is effectief voor het bestuderen van RGC's.
- Targeting van neurotrofe factoren kan RGC-overleving verbeteren.
- Dit onderzoek draagt bij aan het begrijpen van CZS-verwondingen en mogelijke therapieën.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
The optic nerve transection model provides a reproducible system for studying apoptotic neuronal cell death in the adult CNS, enabling target validation of neuroprotective pathways. By allowing precise delivery of therapeutic agents to retinal ganglion cells via intraocular or retrograde routes, the model supports mechanistic de-risking in early discovery. This approach enhances predictive confidence for CNS injury interventions by isolating RGC-specific responses without confounding glial or bystander effects.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of apoptotic pathways in a defined neuronal population to validate therapeutic targets.
- Operational Value: Provides a standardized axotomy model for consistent target engagement assessment across studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates preparation of validated RGC systems for screening neurotrophic factors, siRNAs, plasmids, or viral vectors.
- Operational Value: Supports assay standardization through reproducible drug delivery via vitreous chamber or optic nerve stump.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Offers disease-relevant RGC apoptosis kinetics (3-4 day delay) to time interventions against cell death pathways.
- Operational Value: Enables longitudinal assessment of target modulation through stump imaging and retrograde transport readouts.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling target validation and lead identification through direct manipulation of RGC survival pathways post-axotomy.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of apoptosis regulators by isolating RGC responses to injected agents.
- Screening: Delivers quantitative survival readouts via stump imaging to compare compound efficacy.
- Analytics: Generates measurable outcomes (e.g., RGC survival rates) to inform go/no-go decisions in target validation.
- Translational Research: Aligns with preclinical continuity by modeling human optic nerve injury mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for CNS target validation across neuroprotective modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by reducing mechanistic ambiguity in RGC apoptosis studies.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized intraocular injection and optic nerve stump procedures.
- Strategic Value: Improves portfolio triage by enabling early identification of ineffective neuroprotective candidates.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by providing preclinical evidence of target modulation in a relevant neuronal model.
Implementation Considerations
- Requires microsurgical expertise for optic nerve transection and vitreous chamber access.
- Depends on specialized instrumentation including Hamilton syringes, glass micropipettes, and stereotaxic frames.
- Necessitates cross-team standardization of injection volumes and survival assessment timing.
- Involves adaptation considerations for different agent types (e.g., viral vectors vs. siRNAs) based on delivery route efficiency.
- Includes practical limitations such as lens damage risk during vitreous injection and variability in retrograde transport efficiency.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:13
Introduction
1:44
Syringe Preparation for Intraocular Injections
4:48
Intraocular Injection Procedure: Targeting the Retina Globally
6:50
Selectively Targeting Retinal Ganglion Cells from the Optic Nerve Stump
9:28
RGC Targeting by Injection of the Transected Optic Nerve Stump
10:31
Conclusion
