Methoden voor experimentele manipulaties na Optic Nerve doorsnijding in het zoogdier CZS

Retinale ganglioncellen of RGC's zijn neuronen van het centrale zenuwstelsel die visuele informatie van het netvlies via de oogzenuw naar de hersenen transporteren. In de bijbehorende video werd een methode gedemonstreerd voor het exodontiseren of doorsnijden van de axonen van de gehele RGC-populatie als model voor apoptotische neurale celdood in het volwassen centrale zenuwstelsel. Hier wordt deze methode gekoppeld aan procedures die direct neurotrofe factoren, short interfering RNA's, plasmiden of virale vectoren die anti-ATO-eiwitten coderen, richten op beschadigde retinale ganglioncellen of het netvlies om het netvlies globaal te targeten.

Een apparaat voor intraoculaire injectie wordt geassembleerd en gebruikt om stoffen in de glasvochtkamer van het oog te injecteren om specifiek de retinale ganglioncellen te targeten. Er wordt ofwel Gelfoam geplaatst of een Hamilton-spuit gebruikt om stoffen in de oogzenuw te injecteren. Beelden van de zenuwstomp tonen aan dat de overleving van retinale ganglioncellen kan worden verhoogd door de toediening van anti-apoptotische factoren.

Met behulp van deze technieken kan deze methode worden gebruikt om eiwitten te identificeren die betrokken zijn bij apoptose van volwassen neuronen in het centrale zenuwstelsel. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie of diagnose van ziekten van het centrale zenuwstelsel, aangezien transectie van de oogzenuw een reproduceerbaar model is voor neuronale apoptose in het volwassen CZS. Over het algemeen hebben mensen die nieuw zijn met deze techniek moeite omdat ze de lens beschadigen bij het inbrengen van de glaspipet in de glasvochtkamer van het oog. Om het spuiten-systeem voor intraoculaire injecties voor te bereiden, begint u met het verwijderen van elke naald of RN-moer.

Bevestig een 10 µL RN gast tight 1701 Hamilton-spuit. Plaats de PFA-ferrule in de peak cup-ferrule van de compressiekoppeling. Steek vervolgens de volledige koppeling in het uiteinde van de spuit en draai de RN-moer er losjes overheen.

Steek één uiteinde van een 1/16 inch PEEK-buisje in de compressiekoppeling via de opening in de RN-moer. Zorg ervoor dat de PEEK-buis volledig is aangesloten. Draai de RN-moer aan om de ferrule samen te persen, waardoor de PEEK-buis wordt afgedicht.

Herhaal dit proces aan beide uiteinden van de dubbele RN-glaskoppeling. Bevestig het vrije uiteinde van de piekbuis aan één uiteinde van de dubbele RN-glaskoppeling door de RN-moer aan te draaien. De glazen micropipet vormt de naald en het vat voor het injectiesysteem.

Plaats de glazen pipet in het vrije uiteinde van de dubbele RN-glazen koppeling. Draai de RN-moer vast om de pipet te fixeren. Maak onder een dissectiemicroscoop een punt met de juiste diameter door een uitgetrokken micropipet onder een hoek vast te houden en de punt langs de matte zijde van een objectglas te wrijven om een breuk te veroorzaken.

Idealiter moet de uiteindige punt licht afgeschuind zijn. Vul vervolgens, met behulp van een primingkit van de Hamilton Syringe Company, de spuit, de peak tubing-linker, de dubbele RN-glaskoppeling en de glazen micropipet met minerale olie voor gebruik. Vervang bij het hydraulische injectiesysteem de naald door een Hamilton 9 0 0 3 0 naald.

Plaats vervolgens een rubberen septum over de Hamilton 9 0 0 3 0 naald om een afdichting te creëren tijdens het injecteren van de minerale olie. Steek de Hamilton 9 0 0 3 0 naald van de priming-spuit in de achterzijde van de cilinder van de 10 µL Hamilton-spuit van het injectiesysteem. Druk het septum stevig tegen het uiteinde van de spuit om een afdichting te vormen.

Druk de zuiger langzaam in, zodat de minerale olie door de glazen elementen van het injectiesysteem stroomt en de glazen pipet vult. Duw alle olie door het injectiesysteem om eventuele luchtbellen langs het traject te verwijderen.

Als de vulspuit bijna leeg is, trek dan de naald langzaam terug terwijl er constant olie wordt gedoseerd. Om de vorming van luchtbellen te voorkomen, vult u de primingspuit opnieuw en injecteert u opnieuw. Wanneer het gehele systeem gevuld is met minerale olie, plaatst u de originele zuiger van de 10 microliter.

Druk de zuiger van de Hamilton-spuit volledig in om resterende minerale olie uit het systeem te verwijderen. Veeg de glazen micropipet en het uiteinde van de spuit schoon. Trek de zuiger met 70% ethanol terug tot de markering van twee microliter op de cilinder.

Het uiteinde van de glazen micropipet zal zich vullen met lucht, waardoor een bufferzone ontstaat tussen de minerale olie en de vloeistof die geïnjecteerd moet worden. Vul de pipetcilinder door het uiteinde van de micropipet in de gewenste oplossing te plaatsen en de zuiger van de Hamilton-spuit naar achteren te trekken. Voor het uitvoeren van de intraoculaire injectie wordt er maximaal vier tot vijf µL van de oplossing in het oog van een volwassen rat geïnjecteerd.

Begin met het omschakelen van de gasstroom naar de gasmaskeraansluiting van het stereotaxische frame. Plaats vervolgens een met isofluoraan genarceerde rat in het stereotaxische apparaat. Verlaag de isofluoraanconcentratie naar 2% en bewaak de anesthesie.

Bedek het dier met een chirurgische deken. Om de lichaamstemperatuur tijdens de gehele operatie op peil te houden, opent u de oogleden en brengt u één druppel anesthesie-oplossing aan op het oppervlak van het hoornvlies. Voor de injectie zijn twee personen nodig, waarbij één persoon de glazen pipet in de glasvochtkamer inbrengt en de positie van de pipet handhaaft.

En een andere om de zuiger van de spuit in te drukken, waarmee de gewenste oplossing wordt toegediend. Pak onder een chirurgische microscoop de glazen micropipet en de dubbele RN-glazen koppelaar vast, en spreid de oogleden in een V-vorm tegenover de injectieplaats. Met de vingers wordt het oog uit de oogkas getild. Voer de punt van de glazen micropipet voorzichtig in via een bloedvatvrij gebied en door de sclera onder een neerwaartse hoek.

Wanneer de pipet de sclera penetreert, zal een kleine 'pop' voelbaar zijn. De persoon die de spuit vasthoudt, moet nu vier microliters van de oplossing injecteren door de zuiger in te drukken tot de markering van twee microliters op de spuit. De injectie moet ongeveer één tot twee seconden duren.

De succesvol geïnjecteerde oplossing zal door de glasachtige kamer spoelen; houd de micropipet ongeveer vijf seconden stevig vast en trek deze vervolgens in dezelfde richting terug als waarin de naald werd ingebracht. Het conjunctiva zal weer over de kleine opening klappen, wat helpt bij het afsluiten van de punctie in de sclera. Zodra de operatie is voltooid, schakelt u de isofluoraan uit en laat u het dier enkele minuten zuurstof inademen. Breng een oogzalf aan op het oppervlak van het hoornvlies om uitdroging van het hoornvlies tijdens het herstel te voorkomen, verwijder vervolgens het dier uit het stereotactische apparaat en plaats het terug in de herstelkooi.

Om retinale ganglioncellen te manipuleren via retrograad transport na een exotomie: voer eerst een transectie van de nervus opticus uit volgens de instructies in de bijbehorende video over het protocol voor transectie van de nervus opticus, 2, 2 4, 1 tracers drugs. Plasmiden, siRNAs of virale vectoren kunnen worden aangebracht op de stomp van de nervus opticus.

Er zijn twee hoofdmethode om deze procedure uit te voeren, namelijk met behulp van gelfoam of via directe injectie in de oogzenuw. Indien de gelfoam-methode wordt gebruikt, moet worden gewaarborgd dat de retinale ganglioncellen vooraf zijn gelabeld door één week vóór de taxonomie retrograde tracers in de colliculus superior te injecteren. Onmiddellijk nadat de oogzenuw is doorgesneden, wordt een klein stukje gelfoam gedrenkt in de experimentele oplossing op de doorsneden stomp van de oogzenuw geplaatst, waarna de inhoud van de oogkas wordt teruggeplaatst op de oorspronkelijke positie.

Wanneer het oog terug wordt gebracht naar een neutrale positie, gebruik dan een pincet om het stuk gelfoam in de oogkas te duwen, waarbij moet worden gewaarborgd dat het over het uiteinde van de nervus opticus blijft liggen. De injectietechniek is effectiever voor het toedienen van stoffen die toegang moeten krijgen tot het cytoplasma van het axon om via cytoplasmatische stroming retrograde transport te ondergaan. Een luchtdichte Hamilton-spuit van 10 µL wordt gebruikt om de gewenste oplossing in de doorgesneden nervus opticus te injecteren. Een naald met een korte schuine punt is wenselijk.

Vul de spuit met 10 µL van de te injecteren oplossing. Meestal gaat het om irna-plasmiden of virale vectoren. Grijp de rand van de oogzenuw vast met fijne Dumont-pincetten. Steek de punt van de naald in de oogzenuw, parallel aan de zenuw.

Zodra de schuine zijde (bevel) niet meer zichtbaar is, is de ingebrachte naald aan alle zijden omhuld door de zenuw. Nadat de naald is ingebracht, worden de zijkanten van de zenuw voorzichtig samengedrukt met de fijne pincet en wordt een kwart van de oplossing geïnjecteerd terwijl de spuit wordt gedraaid. Draai een kwartslag met de klok mee of tegen de klok in.

Herhaal deze stappen totdat de naald een volledige rotatie heeft gemaakt en de volledige inhoud van de spuit is geïnjecteerd. Verwijder de punt van de spuit uit de zenuw. Laat eventuele geïnjecteerde vloeistof die vanuit de zenuw terugstroomt in de orbita achter, aangezien dit een aanvullend reservoir vormt voor opname door de uiteinden van de axonen.

Breng de inhoud van de oogkas terug naar de oorspronkelijke positie, sluit de wond en laat het dier herstellen. Dieren moeten na de operatie afzonderlijk worden gehuisvest. Postoperatieve pijnstillers moeten worden toegediend volgens de richtlijnen van uw instelling voor dierenzorg.

Dieren en beheerder moeten na de operatie zorgvuldig worden gemonitord. Zoals in deze video wordt gedemonstreerd, kunnen RGC's direct worden getarget door peptiden, geneesmiddelen, vectoren, plasmiden of siRNA's toe te dienen aan de doorgesneden stomp van de nervus opticus. In dit representatieve voorbeeld werd retrograde labeling met fluoro gold uitgevoerd en werden SI three gelabelde peptiden onmiddellijk in de nervus opticus geïnjecteerd.

Vervolgens werd live imaging van het netvlies uitgevoerd om te voorkomen dat de peptiden tijdens de fixatie uit het weefsel zouden lekken; zoals hier te zien is, werden SI three-gelabelde peptiden die in de oogzenuw waren geïnjecteerd, retrogradement getransporteerd terug naar de RGC-soma in het netvlies. In dit voorbeeld werden SI three-gelabelde siRNAs in de stomp van de oogzenuw geïnjecteerd. Direct na de axotomie werd opnieuw live imaging van het netvlies uitgevoerd; SI three-gelabelde siRNAs die in de oogzenuw waren geïnjecteerd, werden retrogradement getransporteerd door RG CS, zoals blijkt uit hun colocalisatie.

Zodra de techniek van retrograde labeling met fluorgold onder de knie is, kan deze in enkele seconden worden uitgevoerd als dit correct gebeurt. Tijdens deze procedure is het belangrijk om voorzichtig te zijn om beschadiging aan de lens te voorkomen. Vergeet niet dat het werken met virale deeltjes uiterst gevaarlijk kan zijn; de institutionele richtlijnen voor het werken met biologische risico's moeten tijdens het uitvoeren van deze procedure altijd worden nageleefd.