Hoge-resolutie Fiber-optic Microendoscopy voor In situ Cellular Imaging

Traditioneel werden biologische en klinische studies die microscopische analyse op cellulair resolutieniveau vereisen, uitgevoerd door meerdere experimenten parallel te runnen, waarbij individuele monsters op opeenvolgende tijdstippen uit de studie werden verwijderd voor evaluatie via lichtmicroscopie, terwijl confocale, multifotonen- en tweede harmonische microscopie allemaal nuttige technieken zijn voor in situ beeldvorming. De benodigde infrastructuur is complex en duur, met scanning lasersystemen en complexe lichtbronnen. Hier demonstreren we hoe een hoge resolutie glasvezel micro-endoscoopsysteem in één dag kan worden gebouwd, met behulp van standaardcomponenten voor minder dan 5.000 Amerikaanse dollar.

Het platform biedt flexibiliteit op het gebied van beeldresolutie, gezichtsveld en werkgolflengte. Eerst wordt een eenvoudig frame voor een epifluorescentiemicroscoop geassembleerd om een lichtbron, optische filters, lenzen, een glasvezelbundel en een CCD-camera te huisvesten. Vervolgens worden de beeldvormende lenzen geïnstalleerd, die een vergroot beeld van de glasvezelbundel op de CCD-camera vormen.

Vervolgens wordt een LED-bron met verlichtingsoptiek geïnstalleerd om fluorescentie-excitatielicht aan het monster te leveren. Ten slotte worden met de geassembleerde micro-endoscoop in real-time details op cellulair niveau zichtbaar gemaakt van fluorescentielabelled monsters, waaronder in vitro culturen, in vivo diermodellen en menselijke proefpersonen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals confocale of multifotonmicroscopie, is dat deze voldoende eenvoudig en goedkoop is, zodat onderzoekers uit diverse vakgebieden deze snel kunnen implementeren en aanpassen aan hun specifieke behoeften.

De hier beschreven micro-endoscoop met hoge resolutie moet worden beschouwd als een basisconfiguratie, waarbij verschillende variaties in montage en toepassing mogelijk zijn. Houd bij het selecteren van componenten voor een specifieke toepassing rekening met de inherente relaties binnen de fluorescentiemicroscopie tussen fluorofoorconcentratie, fotobleking door verlichting, intensiteit, camerasensitiviteit, gain en belichtingstijd. Dit platform is ontworpen voor gebruik met pro flavine als fluorescent contrastmiddel, maar kan worden geconfigureerd om met andere fluorescerende kleurstoffen te werken.

Pro flavin is een heldere kernkleuring met respectievelijk een maximale absorptie- en emissiegolflengte van 445 nanometer en 515 nanometer. Bij het gebruik van andere contrastmiddelen moet de gebruiker de excitatie-, emissie- en dichroïsche filters correct selecteren om het micro-endoscoopsysteem samen te stellen. Begin door twee cage-staven van zes inch te verbinden met twee cage-staven van 1,5 inch om een paar staven van 7,5 inch lang te vormen. Schroef de staven in één zijde van de inklapspiegelunit en installeer vervolgens een spiegel met een diameter van één inch.

Schroef vervolgens vier staven van 0,5 inch in de tegenovergestelde zijde van de vouwspiegelunit. Schuif de cage-kubus via de twee onderste doorvoergeaten over de cage-staven van 7,5 inch. Schroef de staven van twee inch in de zijgevel van de cage-kubus.

Bevestig de camera aan een cage-plaat met behulp van een adapter van C-mount naar SM1. Bevestig de cage-plaat op de 0,5 inch cage-stangen, vlak met het oppervlak van de vouwspiegelunit. Kies een tubuslens met een diameter van één inch om een beeld van de glasvezelbundel op de camera te vormen.

De brandpuntsafstand van de lens moet zo worden gekozen dat de kern van het glasvezelbundel door ten minste twee pixels wordt bemonsterd. Plaats bij het afbeelden op de camera de lens in een lensbuis van drie inch lang en bevestig de lens met een borgring. Een haaksleutel is handig voor het vastdraaien van borgringen in lange lensbuizen.

Plaats het emissiefilter in de lensbuis van drie inch bovenop de eerste borgring en voeg een tweede ring toe om het filter op zijn plaats te fixeren. Zorg ervoor dat de oriëntatie van het filter voldoet aan de conventie die door de fabrikant van het filter is aangegeven. Schroef de lensbuis in de zijde van de cage-kubus die zich het dichtst bij de CCD-camera bevindt.

Deze positie wordt hier ook getoond. Let op dat in het diagram deze lens en het filter worden weergegeven zonder de lensbuis van drie inch. Voor de duidelijkheid verbindt u de camera met een computer en bekijkt u het beeld op het scherm.

Richt de kooikassembling op een object in de verte en schuif de kooikubus langs de rails totdat een scherp beeld van het object verschijnt. Gebruik een schroevendraaier om de vier schroeven aan de zijkanten van de kooikubus aan te draaien. Deze schroeven klemmen de rails vast wanneer ze worden aangedraaid, waardoor de kubus in positie wordt gehouden.

Dit zorgt ervoor dat de tubuslenzen, in combinatie met het oneindig gecorrigeerde objectief, een gefocust beeld van de vezelbundel op de camera vormen. Plaats vervolgens de dichroïsche spiegel in de houder en positioneer deze onder een hoek van 45 graden in de cage cube. Schroef het objectief via een RMS naar SM1 schroefdraadadapter en een verstelbare lenstube in de zijde van de cage cube tegenover de houder van de tubuslenzen.

Schroef daarna een SMA-connector in een cage-plaat en bevestig deze op de stangen op ongeveer de werkafstand van de objectieflens. Voeg de basisplaat en de einddop toe aan de open zijden van de cage-kubus. Monteer vervolgens een LED op een cage-plaat en schuif deze op het uiteinde van de stangen van twee inch.

Plaats een lens in een lensbuis van 0,5 inch, zodanig dat wanneer deze buis in de zijkant van de kooi-kubus wordt geschroefd, er een beeld van de LED wordt gevormd dat de achteropening van het objectief vult. Voeg daarnaast het excitatiefilter toe aan de lensbuis. In dit stadium kan een LED-driver met behulp van epoxy worden gebruikt om de intensiteit van het verlichtingslicht te regelen.

Bevestig een SMA-connector voor een 1030 micron vezel aan de 720 micron fiber optic bundle voor het gezichtsveld. Raadpleeg voor details over de aansluiting van glasvezelconnectoren T Thor labs, onderdeelnummer FN nine six. A guide to connectorization and polishing of optical fibers.

Schroef de bundel met SMA-connectorogen in de op de kooistaven gemonteerde SMA-houder. Richt het distale uiteinde van de bundel op een breedbandlichtbron; fluorescerende verlichting is hiervoor voldoende. Observeer vervolgens het beeld van het proximale vlak van de bundel op de CCD-camera. Stel tot slot de positie van de objectieflens in door deze in of uit de kooi-kubus te schroeven.

Totdat het beeld van het vezelbundel in focus verschijnt, moet de individuele oorzaak duidelijk zichtbaar zijn. De ruimtelijke resolutie van de micro-endoscoop kan worden verhoogd door een microlens of lensassemblage aan de distale tip van de vezelbundel te bevestigen. Deze optica zijn zo geconfigureerd dat de tip met een bepaalde vergroting op het weefseloppervlak wordt afgebeeld, in plaats van de bundeltip direct op het weefsel te plaatsen.

Hierdoor wordt de ruimtelijke bemonsteringsfrequentie verhoogd die wordt opgelegd door de lichtgeleiding van het vezelbundel. De mate van dem-vergroting komt overeen met de toename in ruimtelijke resolutie en tegelijkertijd met een proportionele afname van het gezichtsveld. Selecteer een grin-lens met de gewenste vergroting en werkafstand voor uw toepassing.

Zorg ervoor dat de diameter van de lens overeenkomt met die van het vezelbundel waarmee u wilt werken. Monteer de vezelbundel en de grin-lens op afzonderlijke handmatige positioneerplatforms met drie assen onder een microscoop met lage vergroting of een stereoscoop voor een nauwkeurige uitlijning.

Plaats vervolgens een druppel optische lijm op het oppervlak van de lens of de bundel. Breng de twee componenten met behulp van de handmatige positioneers in contact. Stel de interface bloot aan UV-licht gedurende de door de fabrikant aanbevolen dosis om de lijm te uitharden.

Om de GRIN-lens en de gelijmde interface te beschermen, wordt een kort stuk aluminium capillaire buis gebruikt om de verbinding te omsluiten. Schuif de buis over de verbinding en zet deze vast met een druppel epoxy aan beide uiteinden van de buis; gebruik krimpkous om de assemblage af te ronden. Breng voorafgaand aan de micro-endoscopische beeldvorming het contrastmiddel aan op de cellen of het weefsel dat moet worden afgebeeld om cellen en culturen te visualiseren.

Verwijder eerst het groeimedium met een pipet. Voeg vervolgens de proflavine-oplossing toe door deze voorzichtig in de put te pipetteren. Na een korte incubatie van maximaal één minuut wordt de proflavine-oplossing met een pipet verwijderd en weggegooid.

Spoel de cellen door verse PBS-oplossing aan de well toe te voegen en weer te verwijderen. Monteer het distale uiteinde van de vezelbundel in een stevige houder met handmatige positioneringsstages op de x-, Y- en Z-as voor stabiliteit. Plaats de glasvezelbundel tijdens de beeldvorming, na het aanbrengen van de kleurstof op de cellen of het weefsel, in licht contact met het monster. Bekijk het beeld van de glasvezelbundel op het computerscherm, gebruikmakend van de software die door de camerafabrikant is geleverd of eventuele eigen software die u eventueel ontwikkelt.

Pas de belichtingstijd en de gain-instellingen van de camera aan om een afbeelding met een aanvaardbare helderheid te verkrijgen. Wanneer het micro-endoscoop correct is gemonteerd, functioneert deze als een epiflorescentiemicroscoop die is doorgegeven via een coherente glasvezelbundel. Voor optimale beeldresultaten moet er aandacht worden besteed aan het waarborgen dat drie cruciale voorwaarden zijn vervuld.

Ten eerste moet het proximale vlak van het vezelbundel worden afgebeeld op de CCD-camera zonder defocus om de volledige resolutie van het systeem te bereiken. Hier wordt een gedeelte van een vezelbundel afgebeeld met een slechte focus, een matige focus en een goede focus. De optimale focus wordt bepaald door de werkelijke positie van de objectieflens ten opzichte van het vlak van de bundel aan te passen.

Ten tweede moet het proximale vlak van het vezelbundel over de volledige diameter uniform worden verlicht. Zoals eerder beschreven, wordt dit bereikt door de verlichtingsoptiek te configureren voor cola-verlichting. De hier getoonde afbeelding is verkregen wanneer een uniform fluorescent monster wordt verlicht in deze voorkeursconfiguratie.

Het overeenkomstige resultaat onder kritische verlichting wordt hier getoond. De structuur van de LED wordt afgebeeld op het oppervlak van de vezelbundel, wat resulteert in de verschijning van dit ongewenste patroon dat over de werkelijke monstertructuur is geplaatst. Ten derde is het belangrijk om ervoor te zorgen dat zowel de proximale als de distale zijden van de vezelbundel schoon zijn en vrij van krassen en beschadigingen.

In dit voorbeeld is er beeldruis gehecht aan het bundelvlak en is er schade in de vorm van een kleine chip op vijf uur zichtbaar aan de omtrek van de vezel. Ruis kan van de bundelvlakken worden verwijderd door te reinigen op dezelfde wijze als bij conventionele glasvezelconnectoren, met lenspapier en isopropanol of standaard reinigingsinstrumenten voor glasvezels. 1483 cellen werden gelabeld met pro flavine en de onbeschermde vezelbundel werd voorzichtig op het monster geplaatst.

In vitro beeldvorming wordt hier getoond waarbij een 2.5 x grin-lens aan de punt van de bundel is bevestigd, wat resulteerde in een verbeterde ruimtelijke resolutie en een vermindering van het gezichtsveld. In vivo beeldvorming, waarbij een vezelbundel met een buitendiameter van 0,5 millimeter door een 21 gauge naald werd gevoerd en in het borstvetweefsel van een muis werd gebracht, werd uitgevoerd zoals te zien is in deze video; adipocyten zijn duidelijk zichtbaar met bewegingen als gevolg van de hartcyclus. In dit voorbeeld werd beeldvorming van het mondslijmvlies bij een gezonde menselijke vrijwilliger uitgevoerd met behulp van een grotere vezelbundel met een buitendiameter van 1,5 millimeter.

In alle voorbeelden werd pro flavine gebruikt als fluorescent contrastmiddel voor nucleaire markering. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een vezeloptische micro-endoscoop ontwerpt en assembleert voor in C twee fluorescentie-imaging van cellen en weefsels.