Name: Hoge-resolutie Fiber-optic Microendoscopy voor In situ Cellular Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-11T22:01:00.000+00:00
Duration: 13 min 49 s
Description: Leer hoe je een kosteneffectieve fiber-optische micro-endoscoop bouwt voor real-time cellulaire beeldvorming in vitro, in vivo en bij mensen. Dit systeem biedt flexibiliteit in resolutie en gezichtsveld.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit onderzoek werd mede gefinancierd door de National Institutes of Health, verlenen R01 EB007594, het Ministerie van Defensie Breast Cancer Research Program, voorstel BCO74699P7, en de Susan G. Komen Foundation verlenen 26152/98188972.

1. Microendoscope Montage De hoge resolutie microendoscope hier beschreven (figuur 1a) moet worden beschouwd als een basisconfiguratie met een aantal variaties mogelijk in de montage en toepassing. We beschrijven in detail hier een belichaming van het platform dat is ontworpen voor gebruik met proflavine als een fluorescerende contrastmiddel. Proflavine is een helder nucleaire respectievelijk vlek met piek absorptie en emissie golflengtes van 445 nm en 515 nm. Het gebruik van andere contrastmiddelen vereisen de gebruiker excitatie, emissie-en dichroïde filters de juiste te kiezen. Verschillende elementen van de hoge-resolutie microendoscope generiek zijn en kunnen worden verkregen bij meerdere leveranciers. Bijvoorbeeld, optomechanische positionering componenten zijn verkrijgbaar bij Thorlabs, Newport, Linos onder anderen. Compacte CCD-camera's zijn verkrijgbaar bij bedrijven, waaronder Point Grey Research, Prosilica, en Retiga; cameragevoeligheid moet worden gekozen met inachtneming van de helderheid van de fluorofoor te gebruiken, evenals de gewenste frame rate. High-power light emitting diodes (LED's) kunnen worden verkregen bij Luxeon, Cree, en Nichia onder anderen. Fiber-optische bundels zijn verkrijgbaar bij Sumitomo, Fujikura en Schott. Bij de keuze van componenten voor een specifieke toepassing, dient de gebruiker rekening houden met de relaties die inherent zijn betrokken bij de fluorescentie microscopie tussen de fluorofoor concentratie, fotobleken, verlichting intensiteit, gevoeligheid, winst, en belichtingstijd. <ol><li> Sluit het 6 "kooi staven naar de 1,5" kooi staven, om een ​​paar van 7,5 vorm "lange staven. Schroef deze staven in een gezicht van de vouw spiegel unit. Schroef de 0,5" staven in de tegenoverliggende zijde. Schuif de kooi kubus op de kooi staven, via de twee onderste doorlopende gaten. Schroef de 2 "staven in de zijde van de kooi kubus (figuur 1b). </li><li> Bevestig de camera op een kooi plaat met behulp van een C-mount te SM1 adapter. Zet de kooi plaat op het 0,5 "kooi staven, gelijk met het gezicht van de vouw spiegel unit. </li><li> Plaats de "tube" lens in een 3 "lange lens tube en zet de lens met een borgring. De brandpuntsafstand van de lens moet worden gekozen, dat de kernen van de glasvezel-bundel worden bemonsterd door ten minste twee pixels wanneer ze worden geprojecteerd op de camera. Drop de emissie-filter in de buis op de top van de eerste borgring, en nog een ring aan het filter vast te zetten. Let op de filter oriëntatie conventie aangegeven door het filter fabrikant. Schroef de lens buis in de zijkant van de kooi kubus het dichtst bij de CCD camera. Merk op dat in figuur 1c, deze lens en het filter worden getoond zonder de drie "lens tube voor de duidelijkheid. </li><li> Sluit de camera aan een computer en bekijk het beeld op het scherm. Richt de kooi elke montage op een voorwerp in de verte en schuif de kooi kubus langs de rails totdat een beeld verschijnt in beeld. Vergrendelen de kooi kubus op deze locatie. (Dit is een eenvoudige methode om ervoor te zorgen dat de buis lens een scherp beeld te vormen in combinatie met de oneindigheid gecorrigeerde objectief). </li><li> Plaats de dichroïsche spiegel in de houder en plaats bij 45 ° in de kooi kubus. </li><li> Schroef de objectief lens, via een RMS SM1 thread adapter en een verstelbare lens buis, in het gezicht van de kooi kubus tegenover de buis lens houder. Een z-vertaler kan worden gebruikt in plaats van de verstelbare lens buis voor gemakkelijker focussen. Schroef een SMA connector in een kooi bord en monteer dit op de stangen, ongeveer op de werkafstand van de objectieflens. </li><li> Mount een LED op een kooi bord en schuif op het einde van de 2 "staven. Voeg een lens aan een 0.5" lens buis zodanig dat wanneer deze buis is geschroefd in de zijkant van de kooi kubus, het zal een beeld van de LED-formulier dat vult de achterkant diafragma van het objectief. Dit (Kohler verlichting) configuratie zorgt ervoor dat de proximale gezicht van de glasvezel-bundel gelijkmatig verlicht is. Voeg de excitatie filter om de 0,5 "-lens tube en veilig op zijn plaats met een borgring (figuur 1c). </li><li> Bevestig een SMA-connector om een ​​fiber-optische bundel. Schroef de SMA connectorized bundel in de SMA-contactdoos gemonteerd op de kooi staven. Direct het distale uiteinde van de bundel naar een breedband lichtbron (tl-verlichting is voldoende) en observeer het beeld van de bundel proximale gezicht op de CCD-camera. Pas de positie van de objectieflens door schroeven in of uit de kooi kubus tot de vezelbundel foto scherp wordt weergegeven. De afzonderlijke kernen dient duidelijk zichtbaar (figuur 2). </li></ol> 2. GRIN Lens Montage De ruimtelijke resolutie van de microendoscope kan worden verhoogd door het aanbrengen van een micro-lens of objectief montage aan de distale tip van de vezel bundel. Deze optieken zijn zodanig geconfigureerd dat in plaats van het plaatsen van de bundel tip direct op het weefsel, de tip is afgebeeld op het weefsel oppervlak met demagnification, waardoor de ruimtelijke bemonsteringsfrequentie opgelegd door de licht-guidING kernen van de vezel bundel. De mate van demagnification komt overeen met de toename van de ruimtelijke resolutie, en op hetzelfde moment, een evenredige daling van de field-of-view. Gradient index (GRIN) lens componenten zijn compatibel met glasvezel en zijn verkrijgbaar bij GrinTech, NSG, Schott, onder anderen, en kan direct worden verbonden met het distale uiteinde van een vezel bundel. <ol><li> Selecteer een GRIN lens met de gewenste vergroting en werkafstand voor uw toepassing. Zorg ervoor dat de diameter van de lens die van de vezel bundel u van plan bent om te werken met overschrijdt. Wij raden aan dat de vezel bundel en GRIN lens gemonteerd worden op aparte drie-assige manuele positionering stadia onder een laag vermogen microscoop of stereoscoop voor nauwkeurige afstemming voorafgaand aan de binding. </li><li> Plaats een druppel van optische lijm (bijv. Norland UV uithardende lijm) op zowel de lens of bundel gezicht. Breng de twee componenten in contact komen met behulp van de handleiding klepstandstellers. Expose de interface aan UV-licht voor de dosis aanbevolen door de fabrikant. </li><li> Ter bescherming van de GRIN lens en de gebonden-interface, een korte lengte van aluminium capillaire buis (Small Parts Inc) kan worden gebruikt om het gewricht omsluiten. Schuif de slang over de gezamenlijke en vast te zetten met epoxy. Krimpkous kan gebruikt worden om de montage te voltooien. </li></ol> 3. Microendoscope Imaging <ol><li> Breng het contrastmiddel aan de cellen of weefsel af te beelden. Met proflavine (0,01% w / v in PBS), kan in vitro beeldvorming van cellen in cultuur worden uitgevoerd door korte incubatie (&lt;1 minuut) en grondig te kunnen spoelen. Beeldvorming van ex vivo weefselmonsters of in vivo weefsels is mogelijk na lokale toediening van de kleurstof. Opname van proflavine onder deze omstandigheden is gevonden om in de buurt-onmiddellijk, met beeldvorming mogelijk is binnen een paar seconden en duren enkele minuten. </li><li> Plaats de optische vezels bundel in het licht contact met het monster af te beelden. Wanneer beeldvorming cellen in cultuur of ex vivo weefselmonsters, is het raadzaam het distale uiteinde van de vezel bundel in een veilige armatuur met handmatige positionering podia XYZ assen voor stabiliteit tijdens de beeldvorming. </li></ol> 4. Representatieve resultaten: Bij correcte montage, zal de microendoscope opereren als een epi-fluorescentie microscoop, doorgegeven door middel van een coherent fiber-optische bundel. Voor optimale beeldresultaten, moet aandacht worden besteed om ervoor te zorgen dat de drie belangrijke voorwaarden wordt voldaan: <ol><li> De proximale gezicht van de vezel bundel moet worden afgebeeld op de CCD-camera zonder defocus, met het oog op de volledige resolutie van het systeem. Figuur 2a, b, c tonen een deel van een vezel bundel afgebeeld met een slechte focus, lichte defocus, en een goede focus, respectievelijk. De optimale focus is gevonden door het aanpassen van de axiale positie van het objectief ten opzichte van de bundel gezicht. </li><li> De proximale gezicht van de vezel bundel moet gelijkmatig worden verlicht over de volledige diameter (field-of-view). Zoals beschreven in het protocol Tekst (1.7), wordt dit bereikt door het configureren van de verlichting optiek voor Kohler verlichting. Figuur 2d toont een afbeelding verworven wanneer een uniform tl-monster is verlicht in de gewenste configuratie, met figuur 2e waaruit de bijbehorende resultaat onder kritische verlichting. In het laatste geval is de structuur van de LED belicht worden op de vezel bundel gezicht, waardoor het uiterlijk van dit ongewenste patroon gelegd op de ware monster structuur. </li><li> Zowel de proximale en distale gezichten van de vezel bundel moet schoon en vrij van krassen en chips. Figuur 2f toont de aanwezigheid van puin aan de bundel gezicht, met schade in de vorm van een kleine chip om 5 uur op de vezel omtrek. Vuil kan worden verwijderd uit de bundel gezichten door het schoonmaken op dezelfde manier als de conventionele glasvezel connectoren, met lens papier en isopropanol, of standaard glasvezel reinigen van gereedschappen. Als een van beide het einde van de vezel bundel is bekrast of afgestoken, of als de bundel breekt over de lengte, het gezicht kan worden gepolijst vlak door standaard handleiding, of mechanisch polijsten technieken. Wij raden aan 12 tot 15 micrometer kabbelende papier voor een eerste grove polish, met een uiteindelijke polish op 0.5-1.0 um papier. </li></ol> Figuur 3a toont beeldvorming van 1.483 cellen in vitro, na labeling met proflavine en licht de plaatsing van de kale vezelbundel op het monster. Figuur 3b toont de verbetering van de ruimtelijke resolutie en de vermindering in het veld-of-view geleverd door een 2,5 x GRIN lens gebonden aan de bundel tip. Film 1 toont in vivo beeldvorming van het uiervet pad in een muismodel. Hier was een vezelbundel met 0,5 mm buitendiameter (330 um field-of-view) geleid door een 21-gauge naald en geavanceerde in het weefsel. Vetcellen zijn duidelijk zichtbaar, met beweging als gevolg van de hartcyclus duidelijk in deze overname op 15frames per seconde. Figuur 3c toont beeldvorming van het mondslijmvlies in een gezonde menselijke vrijwilligers, dit keer met een grotere vezelbundel met 1,5 mm buitendiameter (1,4 mm field-of-view). In de getoonde alle voorbeelden werd proflavine gebruikt als een nucleaire etikettering fluorescerende contrastmiddel. <img src="/files/ftp_upload/2306/2306fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Montage van de hoge-resolutie microendoscope (HRME). (A) Schematische weergave van de HRME systeem. (B) Montage van de belangrijkste opto draagstructuur. (C) toevoeging van optische elementen, verlichting LED en CCD-camera. (D) Foto van de HRME systeem, verpakt in een 10 "x 8" x 2,5 "behuizing. <img src="/files/ftp_upload/2306/2306fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Instellen van de HRME. Voorbeelden van beeldvorming met de glasvezel-bundel in (een) slechte focus, (b) dicht bij een goede focus, (c) ideaal focus. In (d), is een uniform fluorescerend richten op distale de bundel tip belicht onder Kohler (uniform) verlichting. (E) een uniforme fluorescerende doel afgebeeld onder kritische verlichting, met de bron-structuur zichtbaar op het object. (F) Losse weefsels en cellen kunnen vasthouden aan de vezel bundel gezicht, die ook gevoelig is voor kleine beschadigingen in haar periferie. <img src="/files/ftp_upload/2306/2306fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Beeldvorming met de HRME. (A) 1.483 cellen in vitro, afgebeeld met een kale vezel bundel (IGN-08/30) na labeling met proflavine 0,01% (w / v). (B) Dezelfde 1483 celkweek, zoals aangegeven in (a), afgebeeld met een vezel bundel met 2.5x GRIN lens bevestigd. (C) Afbeelding van normale menselijke mondslijmvlies in vivo, na lokale toediening van proflavine 0,01% (w / v). Film 1. Imaging het uiervet pad van een muis via het inbrengen van een 450 um buitendiameter vezelbundel binnen het lumen van een 21-gauge naald voorbij in het weefsel. Proflavine 0,01% (w / v) werd geleverd aan de beeldvorming site via dezelfde naald voorafgaand aan het inbrengen van de imaging vezel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2306/5-11-1%202306_Pierce_movie1.avi">Klik hier om video te bekijken</a>

<ol><li>Pierce, M. C., Javier, D. J., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+contrast+agents+and+imaging+systems+for+detection+and+diagnosis+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Optical contrast agents and imaging systems for detection and diagnosis of cancer.</a> Int. J. Cancer. 123, 1979-1990 (2008).</li>
<li>Muldoon, T. J., Pierce, M. C., Nida, D. L., Williams, M. D., Gillenwater, A., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular-resolution+molecular+imaging+within+living+tissue+by+fiber+microendoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Subcellular-resolution molecular imaging within living tissue by fiber microendoscopy.</a> Opt. Express. 15, 16413-16423 (2007).</li>
<li>Muldoon, T. J., Anandasabapathy, S., Maru, D., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+imaging+in+Barrett%27s+esophagus%3A+a+novel%2C+low-cost+endoscopic+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Gastrointest.+Endosc%22%5BJournal%5D)">High-resolution imaging in Barrett's esophagus: a novel, low-cost endoscopic microscope.</a> Gastrointest. Endosc. 68, 737-744 (2008).</li>
<li>Muldoon, T. J., Thekkek, N., Roblyer, D., Maru, D., Harpaz, N., Potack, J., Anandasabapathy, S., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+quantitative+image+analysis+criteria+for+the+high-resolution+microendoscopic+detection+of+neoplasia+in+Barrett%27s+esophagus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Evaluation of quantitative image analysis criteria for the high-resolution microendoscopic detection of neoplasia in Barrett's esophagus.</a> J. Biomed. Opt. 15, 026027-026027 (2010).</li>
<li>Zhong, W., Celli, J. P., Rizvi, I., Mai, Z., Spring, B. Q., Yun, S. H., Hasan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+high-resolution+fluorescence+microendoscopy+for+ovarian+cancer+detection+and+treatment+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">In vivo high-resolution fluorescence microendoscopy for ovarian cancer detection and treatment monitoring.</a> Br. J. Cancer. 101, 2015-2022 (2009).</li>
<li>Dubaj, V., Mazzolini, A., Wood, A., Harris, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optic+fibre+bundle+contact+imaging+probe+employing+a+laser+scanning+confocal+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Optic fibre bundle contact imaging probe employing a laser scanning confocal microscope.</a> J. Microsc. 207, 108-117 (2002).</li>
<li>Dromard, T., Ravaine, V., Ravaine, S., Lévêque, J. -L., Sojic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+in+vivo+imaging+of+human+skin+corneocytes+by+means+of+an+optical+fiber+bundle%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Sci.+Inst%22%5BJournal%5D)">Remote in vivo imaging of human skin corneocytes by means of an optical fiber bundle.</a> Rev. Sci. Inst. 78, 053709-05 (2007).</li>
<li>Udovich, J. A., Kirkpatrick, N. D., Kano, A., Tanbakuchi, A., Utzinger, U., Gmitro, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+background+and+transmission+characteristics+of+fiber+optic+imaging+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Opt%22%5BJournal%5D)">Spectral background and transmission characteristics of fiber optic imaging bundles.</a> Appl. Opt. 47, 4560-4568 (2008).</li>
<li>Barretto, R. P. J., Messerschmidt, B., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+fluorescence+imaging+with+high-resolution+microlenses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo fluorescence imaging with high-resolution microlenses.</a> Nat. Methods. 6, 511-512 (2009).</li>
<li>Rouse, A. R., Kano, A., Udovich, J. A., Kroto, S. M., Gmitro, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+demonstration+of+a+miniature+catheter+for+a+confocal+microendoscope%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Opt%22%5BJournal%5D)">Design and demonstration of a miniature catheter for a confocal microendoscope.</a> Appl. Opt. 43, 5763-5771 (2004).</li>
<li>Kester, R. T., Christenson, T., Richards-Kortum, R., Tkaczyk, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+cost%2C+high+performance%2C+self-aligning+miniature+optical+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Opt%22%5BJournal%5D)">Low cost, high performance, self-aligning miniature optical systems.</a> Appl. Opt. 48, 3375-3384 (2009).</li>
</ol>

MP en DY hebben niets te onthullen. RRK bezit een patent met betrekking tot microendoscopic beeldvorming platforms.

De hoge-resolutie microendoscopy techniek die hier beschreven biedt onderzoekers in de basis biomedisch en klinisch onderzoek gebieden met een flexibel, robuust, en kosten-effectieve methode voor het visualiseren van cellulaire detail in situ. We hebben beschreven een protocol voor het monteren van de imaging-systeem en toonde het gebruik ervan in celkweek in vitro en in dierlijke en menselijke weefsels in vivo. Terwijl de beeldvorming hier gepresenteerde resultaten gebruikt proflavine als een fluorescerende contrastmiddel, hebben andere groepen aangetoond versies van het systeem met LED-verlichting golflengten en filters voor gekozen om excitatie / emissie spectra van andere kleurstoffen 5-7 wedstrijd. Resolutie en field-of-view worden in eerste instantie bepaald door de core-to-core afstand en beeldvorming diameter van de glasvezel-bundel. We hebben gebruik gemaakt bundels met ongeveer 4 micrometer core-kern afstand, en de beeldvorming diameters van 330 micrometer (film 1), 720 micrometer (Figuur 2, Figuur 3a, b), en 1400 um (figuur 3c). De kleinere bundels kunnen worden doorgegeven via smaller gauge naalden en zijn aanzienlijk flexibeler dan de grotere vezels. Wij en anderen 8 hebben, in sommige gevallen, merkte de verschijning van autofluorescentie-uitstoot van de vezel bundel zelf. Bij een poging om fluoroforen prikkelen op UV-golflengten, of emissie in het rode spectrale gebied te verzamelen, moet aandacht worden besteed aan het niveau van de vezelbundel autofluorescentie bij te dragen aan de totale gemeten signaal. Terwijl de meeste van de hoge-resolutie microendoscopy werk gemeld to-date heeft een kale vezelbundel gebruikt, kan extra vergroting worden geleverd door het gebruik van GRIN lenzen gebonden aan de distale tip. GRIN lenzen bieden een eenvoudige en economische manier om ruimtelijke resolutie te verhogen, hoewel hun gevoeligheid voor optische aberraties en beperkte NA is goed herkend. Als GRIN lens performance is onvoldoende voor een bepaalde toepassing, hybride GRIN / sferische lens doelstellingen 9 of mini-objectief 10-11 assemblies kunnen worden gebruikt. De hoge resolutie microendoscope hier beschreven in essentie werkt als een wide-field epi-fluorescentie microscoop, dus geen optische sectie (zoals bij confocale microscopie of niet-lineaire) is te verwachten. In onze ervaring, met behulp van 455 nm excitatie licht en actueel proflavine als een contrastmiddel, is licht in de eerste plaats afkomstig van een diepte die overeenkomt met een paar cellagen. Dit protocol moet in staat stellen de lezer om de hoge-resolutie microendoscope monteren op de werkbank, met een compacte footprint van 10 &quot;x 8&quot;. Indien gewenst kan het systeem worden ingesloten in een doos en de elektrische componenten (LED en camera) aangedreven door een accu (Figuur 1d). Veel compacte camera&#39;s kunnen worden gevoed door de IEEE-1394 (Firewire) en USB-poorten van de host-computer.

<table><tbody><tr><td>CCD-camera</td><td>Point Grey Research</td><td>GRAS-14S5M</td><td></td></tr><tr><td>LED</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>M455L2</td><td>Geselecteerd voor gebruik met proflavine &amp;#8211; andere fluoroforen kunnen andere onderdelen vereisen</td></tr><tr><td>Excitatiefilter</td><td>Semrock</td><td>452/45</td><td>Geselecteerd voor gebruik met proflavine &amp;#8211; andere fluoroforen kunnen andere onderdelen vereisen</td></tr><tr><td>Emissiefilter</td><td>Semrock</td><td>550/88</td><td>Geselecteerd voor gebruik met proflavine &amp;#8211; andere fluoroforen kunnen andere onderdelen vereisen</td></tr><tr><td>Dichroïsche spiegel</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>485 DCLP</td><td>Geselecteerd voor gebruik met proflavine &amp;#8211; andere fluoroforen kunnen andere onderdelen vereisen</td></tr><tr><td>Objectieflens</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>RMS 10X</td><td></td></tr><tr><td>Tubelens</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>AC-254-150-A1</td><td>Kies de brandpuntsafstand om de vereiste vergroting naar de CCD te bereiken</td></tr><tr><td>Condensorlens</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>ACL2520</td><td></td></tr><tr><td>Cage-cube-eenheid</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>C6W, B1C, B3C, B5C, SM1CP2</td><td></td></tr><tr><td>Cage-stangen en platen</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>ER05 (x4), ER1.5 (x2), ER2 (x2), ER6 (x2), CP02 (x3)</td><td></td></tr><tr><td>Vouwspiegeleenheid</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>KCB1, PF10-03-G01</td><td></td></tr><tr><td>Lenstubes</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>SM1L05, SM1L30, SM1V05 (of SM1Z)</td><td></td></tr><tr><td>Adapters / koppelingen</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>SM1A3, SM1A9, SM1T2 (x2)</td><td></td></tr><tr><td>SMA-connectoren</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>SM1SMA, 11040A</td><td></td></tr><tr><td>LED-driver</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>LEDD1B TPS001</td><td></td></tr><tr><td>Glasvezelbundel</td><td>Sumitomo Bakelite Co., Ltd.</td><td>IGN-08/30</td><td>Grotere of kleinere bundels zijn beschikbaar (Sumitomo / Fujikura)</td></tr></tbody></table>

hoge-resolutie fiber-optic microendoscopy voor in situ cellular imaging

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Veel biologische en klinische studies vereisen de longitudinale studie en analyse van de morfologie en functie met cellulair niveau resolutie. Traditioneel zijn meerdere experimenten parallel lopen, met de individuele monsters uit de studie op opeenvolgende tijdstippen voor de evaluatie met lichtmicroscopie. Verschillende intravitale technieken zijn ontwikkeld, met confocale, multiphoton, en ten tweede harmonische microscopie al tonen hun vermogen om te worden gebruikt voor beeldvorming in situ 1. Met deze systemen, maar de benodigde infrastructuur is complex en duur, waarbij scanning laser systemen en complexe lichtbronnen. Hier presenteren wij een protocol voor het ontwerp en de assemblage van een hoge-resolutie microendoscope die kunnen worden gebouwd in een dag met behulp van off-the-shelf componenten voor minder dan US $ 5.000. Het platform biedt flexibiliteit in termen van beeldresolutie, veld-of-view, en operationele golflengte, en beschrijven we hoe deze parameters kunnen eenvoudig worden aangepast aan de specifieke behoeften van de eindgebruiker te voldoen. Wij en anderen hebben onderzocht het gebruik van de hoge-resolutie microendoscope (HRME) in in-vitro celkweek 2-5, in weggesneden 6 en leven dierlijke weefsels 2,5, en in menselijke weefsels in vivo 2,7. Gebruikers hebben melding gemaakt van het gebruik van verschillende fluorescerende contrastmiddelen, waaronder proflavine 2-4, benzoporfyrine-afgeleide monoacid ring A (BPD-MA) 5, en fluoroscein 6,7, die alle ontvangen vol is, of onderzoek goedkeuring van de FDA voor gebruik bij de mens. Hoge-resolutie microendoscopy, in de vorm hier beschreven, kan beroep doen op een breed scala aan onderzoekers die werkzaam zijn in de basis-en klinische wetenschappen. De techniek biedt een effectieve en economische aanpak die de traditionele benchtop microscopie een aanvulling op, doordat de gebruiker met hoge resolutie, longitudinale beeldvorming in situ uit te voeren.

In veel biologische en klinische situaties is het voordelig om cellulaire processen te bestuderen als ze zich ontwikkelen in hun eigen micro-omgeving. Hier beschrijven we de montage en het gebruik van een low-cost fiber-optische microscoop, die real-time beeldvorming kan bieden in celkweek, dierproeven en klinische studies de patiënt.

Hoge-resolutie Fiber-optic Microendoscopy voor In situ Cellular Imaging

Veel biologische en klinische studies vereisen een longitudinale studie en analyse van morfologie en functie met resolutie op cellulair niveau.

Traditioneel worden biologische en klinische studies die microscopische analyse op cellulair resolutieniveau vereisen, uitgevoerd door meerdere experimenten parallel te draaien, waarbij individuele monsters op opeenvolgende tijdstippen uit de studie worden verwijderd voor evaluatie via lichtmicroscopie, terwijl confocale, multifoton- en tweede-harmonische microscopie allemaal nuttige technieken zijn voor in situ beeldvorming. De benodigde infrastructuur is complex en duur, met scanning lasersystemen en complexe lichtbronnen. Hier demonstreren wij hoe men in één dag een hoge-resolutie glasvezel micro-endoscoopsysteem kan bouwen, met behulp van standaardcomponenten voor minder dan 5.000 US dollars.Het platform biedt flexibiliteit wat betreft beeldresolutie, gezichtsveld en werkgolflengte. Eerst wordt een eenvoudig frame voor een epifluorescentiemicroscoop geassembleerd om plaats te bieden aan een lichtbron, optische filters, lenzen, een glasvezelbundel en een CCD-camera. Vervolgens worden de beeldlenzen geïnstalleerd, die een vergroot beeld van de glasvezelbundel op de CCD-camera vormen.Vervolgens wordt een LED-bron geïnstalleerd met verlichtingsoptiek om fluorescentie-excitatielicht aan het monster te leveren. Ten slotte maakt real-time beeldvorming met de geassembleerde micro-endoscoop details op cellulair niveau zichtbaar van fluorescentie-gelabelde monsters, waaronder in vitro culturen, in vivo diermodellen en menselijke subjecten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals confocale of multiphoton-microscopie is dat deze voldoende eenvoudig en goedkoop is, zodat onderzoekers in diverse vakgebieden deze snel kunnen implementeren en aanpassen aan hun specifieke behoeften.De hier beschreven micro-endoscoop met hoge resolutie moet worden beschouwd als een basisconfiguratie, waarbij verschillende variaties in assemblage en toepassing mogelijk zijn. Houd bij het selecteren van componenten voor een specifieke toepassing rekening met de inherente relaties binnen de fluorescentiemicroscopie tussen fluorofoorconcentratie, fotobleking door illuminatie, intensiteit, camerasensitiviteit, gain en belichtingstijd. Dit platform is ontworpen voor gebruik met proflavine als fluorescent contrastmiddel, maar kan worden geconfigureerd om met andere fluorescerende kleurstoffen te werken.Pro flavin is een heldere kernkleuring met respectievelijk een piekabsorptie- en emissiegolflengte van 445 nanometer en 515 nanometer. Bij het gebruik van andere contrastmiddelen dient de gebruiker de excitatie-, emissie- en dichroïsche filters correct te selecteren om het micro-endoscoopsysteem samen te stellen. Begin met het verbinden van twee cage-staven van zes inch met twee cage-staven van 1,5 inch om een paar staven van 7,5 inch lang te vormen. Schroef de staven in één zijde van de vouwspiegelunit en installeer vervolgens een spiegel met een diameter van één inch.Schroef vervolgens vier staven van 0,5 inch in de tegenoverliggende zijde van de vouwspiegelunit. Schuif de kooi-kubus over de kooistaven van 7,5 inch via de twee onderste doorvoergaatjes. Schroef de staven van twee inch in de zijvlakte van de kooi-kubus.Bevestig de camera aan een kooiplaat met behulp van een C-mount naar SM1-adapter. Bevestig de kooiplaat op de 0,5 inch kooistangen, vlak met het oppervlak van de inklapspiegelunit. Selecteer een tubuslens met een diameter van één inch om een beeld van de glasvezelbundel op de camera te vormen.De brandpuntsafstand van de lens moet zo worden gekozen dat de kern van het glasvezelbundel door ten minste twee pixels wordt bemonsterd. Voor de beeldvorming op de camera wordt de lens in een lensbuis van drie inch lengte geplaatst en met een borgring vastgezet. Een haaksleutel is handig voor het aandraaien van borgringen in lange lensbuizen.Plaats het emissiefilter in de lensbuis van drie inch bovenop de eerste borgring en voeg een tweede ring toe om het filter op zijn plaats te fixeren. Controleer of de oriëntatie van het filter overeenkomt met de conventie die door de fabrikant van het filter is aangegeven. Schroef de lensbuis in de zijde van de cage-kubus die het dichtst bij de CCD-camera ligt.Deze positie wordt hier ook weergegeven. Let op dat in het diagram deze lens en filter worden getoond zonder lensbuis van drie inch. Sluit voor de duidelijkheid de camera aan op een computer en bekijk het beeld op het scherm.Richt de kooiassemblage op een object in de verte en schuif de kooikubus langs de rails totdat een scherp beeld van het object verschijnt. Gebruik een schroevendraaier om de vier schroeven aan de zijkanten van de kooikubus aan te draaien. Deze schroeven klemmen de rails vast wanneer ze worden aangedraaid, waardoor de kubus in positie wordt gehouden.Dit zorgt ervoor dat de tubuslenzen, in combinatie met het objectief met oneindig gecorrigeerde focus, een scherp beeld van de vezelbundel op de camera vormen. Plaats vervolgens de dichroïsche spiegel in de houder en positioneer deze onder een hoek van 45 graden in de cage-kubus. Schroef het objectief via een RMS-naar-SM1-draadadapter en een instelbare lenstube in de zijde van de cage-kubus tegenover de houder van de tubuslenzen.Schroef daarna een SMA-connector in een cage-plaat en monteer deze op de stangen op ongeveer de werkafstand van het objectief. Bevestig de basisplaat en de eindkap aan de open zijden van de cage-kubus. Monteer vervolgens een LED op een cage-plaat en schuif deze op het uiteinde van de stangen van twee inch.Plaats een lens in een lensbuis van 0,5 inch, zodanig dat wanneer deze buis in de zijkant van de cage-kubus wordt geschroefd, er een beeld van de LED wordt gevormd dat de achterste apertuur van het objectief vult. Voeg daarnaast het excitatiefilter toe aan de lensbuis. In dit stadium kan een LED-driver worden gebruikt om de intensiteit van het verlichtingslicht met behulp van epoxy te regelen.Bevestig een SMA-connector voor een 1030 micron vezel aan de 720 micron field of view glasvezelbundel. Voor details over de connectorisatie van glasvezels, raadpleeg T Thor labs, onderdeelnummer FN negen zes. Een handleiding voor de connectorisatie en het polijsten van optische vezels.Schroef de bundel met SMA-connectorogen in de SMA-aansluiting die op de kooistangen is gemonteerd. Richt het distale uiteinde van de bundel op een breedbandlichtbron; fluorescent verlichting is hiervoor voldoende. Observeer vervolgens het beeld van het proximale vlak van de bundel op de CCD-camera. Pas tot slot de positie van de objectieflens aan door deze in of uit de kooikubus te schroeven.Totdat het beeld van het vezelbundel in focus verschijnt, moet de individuele oor duidelijk zichtbaar zijn. De ruimtelijke resolutie van het micro-endoscoop kan worden verhoogd door een microlens of lensassemblage aan de distale tip van de vezelbundel te bevestigen. Deze optica zijn zo geconfigureerd dat de tip, in plaats van de bundeltip direct op het weefsel te plaatsen, met een bepaalde vergroting op het weefseloppervlak wordt afgebeeld.Hierdoor wordt de ruimtelijke bemonsteringsfrequentie verhoogd, die wordt bepaald door de lichtgeleiding van het vezelbundel. De mate van dem-vergroting komt overeen met de toename in ruimtelijke resolutie en leidt tegelijkertijd tot een proportionele afname van het gezichtsveld. Selecteer een grin-lens met de gewenste vergroting en werkafstand voor uw toepassing.Zorg ervoor dat de diameter van de lens overeenkomt met die van de vezelbundel waarmee u gaat werken. Monteer de vezelbundel en de GRIN-lens op afzonderlijke handmatige positioneerplatforms met drie assen onder een microscoop met lage vergroting of een stereoscoop voor een nauwkeurige uitlijning.Plaats vervolgens een druppel optische lijm op het oppervlak van ofwel de lens of de vezelbundel. Breng de twee componenten met behulp van de handmatige positioneers in contact. Stel de interface bloot aan UV-licht gedurende de door de fabrikant aanbevolen dosis om de lijm te uitharden.Om de GRIN-lens en de gebonden interface te beschermen, dient een kort stuk aluminium capillairbuisje te worden gebruikt om de verbinding te omsluiten. Schuif de buis over de verbinding en zet deze vast met een druppel epoxy aan beide uiteinden van de buis; gebruik krimpkous om de assemblage af te ronden. Breng vóór de micro-endoscopische beeldvorming het contrastmiddel aan op de cellen of het weefsel dat moet worden afgebeeld om cellen en culturen te visualiseren.Verwijder eerst het groeimedium met een pipet. Voeg vervolgens de proflavine-oplossing toe door deze voorzichtig in het putje te pipetteren. Na een korte incubatie van maximaal één minuut wordt de proflavine-oplossing met een pipet verwijderd en weggegooid.Spoel de cellen door verse PBS-oplossing aan de well toe te voegen en weer te verwijderen; monteer het distale uiteinde van het vezelbundel in een stevige fixture met handmatige positioneringsstadia op de x-, Y- en Z-as voor stabiliteit. Plaats de glasvezelbundel tijdens de beeldvorming, na het aanbrengen van de kleurstof op de cellen of het weefsel, in licht contact met het monster. Bekijk het beeld van de glasvezelbundel op het computerscherm, gebruikmakend van de software die door de camerafabrikant is geleverd of eventuele aangepaste software die u zelf wenst te ontwikkelen.Pas de belichtingstijd en de gain-instellingen van de camera aan om een beeld met een aanvaardbare helderheid te verkrijgen. Wanneer deze correct is geassembleerd, functioneert de micro-endoscoop als een epiflorescentiemicroscoop die wordt doorgegeven via een coherente glasvezelbundel. Voor optimale beelden moet erop worden gelet dat aan drie essentiële voorwaarden wordt voldaan.Ten eerste moet het proximale vlak van het vezelbundel worden afgebeeld op de CCD-camera zonder defocus om de volledige resolutie van het systeem te bereiken. Hier wordt een deel van een vezelbundel afgebeeld met een slechte focus, een lichte focus en een goede focus. De optimale focus wordt bepaald door de werkelijke positie van het objectief ten opzichte van het bundelvlak aan te passen.Ten tweede moet het proximale vlak van het vezelbundel over de volledige diameter uniform worden verlicht. Zoals eerder beschreven, wordt dit bereikt door de verlichtingsoptica te configureren voor cola-verlichting. De hier getoonde afbeelding is verkregen wanneer een uniform fluorescent monster wordt verlicht in deze voorkeursconfiguratie.Het overeenkomstige resultaat onder kritische verlichting wordt hier getoond. De structuur van de LED wordt afgebeeld op het oppervlak van het vezelbundel, wat resulteert in de verschijning van dit ongewenste patroon dat over de werkelijke monsterstructuur heen is gelegd. Ten derde is het belangrijk om ervoor te zorgen dat zowel de proximale als de distale zijden van het vezelbundel schoon zijn en vrij van krassen en beschadigingen.In dit voorbeeld is beeldvervuiling gehecht aan het bundelvlak en is er schade zichtbaar in de vorm van een kleine chip op vijf uur langs de omtrek van de vezel. Vervuiling kan van de bundelvlakken worden verwijderd door deze op dezelfde wijze te reinigen als conventionele glasvezelconnectoren, met behulp van lenspapier en isopropanol of standaard reinigingsinstrumenten voor glasvezels. 1483 cellen werden gelabeld met pro flavine en de onbeschermde vezelbundel werd voorzichtig op het monster geplaatst.In vitro beeldvorming wordt hier getoond waarbij een 2.5 x grin-lens aan de uiteinde van het bundel was bevestigd, wat resulteerde in een verbetering van de ruimtelijke resolutie en een vermindering van het gezichtsveld. In vivo beeldvorming, waarbij een vezelbundel met een buitendiameter van 0.5 millimeter door een 21 gauge naald werd geleid en in het vetweefsel van het melkklierweefsel van een muis werd ingebracht, werd uitgevoerd zoals te zien is in deze film; adipocyten zijn duidelijk zichtbaar met beweging als gevolg van de hartcyclus. In dit voorbeeld werd beeldvorming van het mondslijmvlies bij een gezonde menselijke vrijwilliger uitgevoerd met behulp van een grotere vezelbundel met een buitendiameter van 1.5 millimeter.In alle voorbeelden werd pro flavine gebruikt als fluorescent contrastmiddel voor kernmarkering. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in het ontwerpen en assembleren van een glasvezel-micro-endoscoop voor in vivo fluorescentie-imaging van cellen en weefsels.

high-resolution-fiber-optic-microendoscopy-for-situ-cellular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

De complete bouw van een aangepaste, real-time confocale scanning imaging-systeem is beschreven. Dit systeem, dat gemakkelijk kan worden gebruikt voor video-rate microscopie en microendoscopy, zorgt voor een scala aan imaging-geometrieën en toepassingen die niet toegankelijk zijn met behulp van standaard commerciële confocale systemen, tegen een fractie van de kosten.

Video-rate Scanning confocale microscopie en Microendoscopy

Hoge-resolutie intravitale beeldvorming met verbeterd contrast tot 120 urn diepte lymfklieren van volwassen muizen wordt bereikt door ruimtelijk moduleren van de excitatie patroon van een multi-focale twee-foton microscoop. In 100 micrometer diepte gemeten we resoluties van 487 nm (lateraal) en 551 nm (axiaal), waardoor verstrooiing en diffractie grenzen omzeilen.

Hoogst vastbesloten Intravitale Striped-verlichting Microscopie van Germinal Centers

Vierdimensionale (4D) beeldvorming wordt gebruikt om het gedrag en interacties tussen twee soorten endosomen in levende gewervelde zenuwuiteinden bestuderen. Beweging van deze kleine structuren wordt gekenmerkt in drie dimensies, waardoor de bevestiging van evenementen zoals endosome fusie en de exocytose.

Visualisatie van endosoom Dynamiek in woon zenuwuiteinden met vier-dimensionale Fluorescentie Imaging

Klein dier beeldvormende technieken laten seriële diagnostische onderzoeken en therapeutische interventies in vivo. Onlangs heeft de reikwijdte van de toepassingen aanzienlijk verbreed en omvat momenteel de beoordeling van het colon tumor ontwikkeling, wondgenezing en de monitoring van de ontsteking. Dit protocol illustreert deze diverse mogelijke toepassingen van muizen endoscopie.

Muizen Endoscopie voor In Vivo Multimodal Imaging van Carcinogenese en Evaluatie van intestinale wondgenezing en ontsteking

De assemblage en het gebruik van een multimodaal microendoscoop wordt beschreven, die oppervlakkige weefseldatagegevens kan co-registreren met fysiologische weefselparameters, waaronder hemoglobineconcentratie, melanineconcentratie en zuurstofverzadiging. Deze techniek kan nuttig zijn voor het evalueren van weefselstructuur en perfusie, en kan worden geoptimaliseerd voor individuele behoeften van de onderzoeker.

Multimodale beeldvorming en spectroscopie Fiber-bundel microendoscopy Platform voor niet-invasieve,<em&gt; In Vivo</em&gt; Tissue Analyse

We presenteren een protocol voor het bestuderen van de verdeling van mitochondriën en endoplasmisch reticulum in hele cellen na genetische modificatie met behulp van correlatief licht en volume elektronenmicroscopie met inbegrip van ascorbaat peroxidase 2 en mierikswortelperoxidase kleuring, serie snijden van cellen met en zonder het doel gen in dezelfde sectie, en seriële beeldvorming via elektronenmicroscopie.

Mitochondriën en Endoplasmisch reticulum beeldvorming door Correlatief licht en volume elektronenmicroscopie

We presenteren een protocol voor het gebruik van fiberoptische confocale lasermicro-endoscopie (CLM) om de spatio-temporele verdeling van liposomen in het oog na subconjunctivale injectie niet-invasief te bestuderen.

Spatio-temporale in vivo beeldvorming van oculaire medicijnafgiftesystemen met behulp van fiberoptische confocale lasermicro-endoscopie

Superresolutiemicroscopie kan een gedetailleerd inzicht geven in de organisatie van componenten binnen het synaptonemale complex bij meiose. Hier demonstreren we een protocol om individuele eiwitten van het Caenorhabditis elegans synaptonemale complex op te lossen.

Superresolutiemicroscopie van het synaptonemale complex binnen de Caenorhabditis elegans kiembaan

We presenteren een gedetailleerd protocol voor Epon post-embedding correlatieve licht- en elektronenmicroscopie met behulp van een fluorescerend eiwit genaamd mScarlet. Deze methode kan de fluorescentie en de ultrastructuur tegelijkertijd behouden. Deze techniek is geschikt voor een breed scala aan biologische toepassingen.

Epon Post Inbedding van correlatieve licht- en elektronenmicroscopie

Dit protocol beschrijft de fabricage van een implanteerbaar geïntegreerd beeldvormingsvenster met behulp van 3D-laserprinten. Het raam bestaat uit een systeem van microlenzen gekoppeld aan micro-scaffolds. De methode omvat twee-fotonpolymerisatie (2PP) van de biocompatibele fotoresist SZ2080 in een continue sequentie, waardoor de productie-efficiëntie en de afstemming tussen de verschillende componenten worden geoptimaliseerd.

Microfabricage van implanteerbare optica geïntegreerd in een microgestructureerd beeldvormingsvenster voor geavanceerde in vivo beeldvorming

We introduceerden een nieuwe beeldvormingstechniek genaamd Optical Multilayer Interference Tomography (OMLIT), die onbevooroordeelde beeldvorming van alle cellen in hersenmonsters op mesoschaal mogelijk maakt en naadloos kan worden geïntegreerd in de beeldvormingsworkflow van tape-gebaseerde seriële scanning-elektronenmicroscopie op hetzelfde monster.

Een scanning elektronenmicroscopie-compatibele optische beeldvormingsmethode voor mesoscopische all-cel hersenmapping

Leer hoe je een kosteneffectieve fiber-optische micro-endoscoop bouwt voor real-time cellulaire beeldvorming in vitro, in vivo en bij mensen. Dit systeem biedt flexibiliteit in resolutie en gezichtsveld.

Hoge-resolutie Fiber-optic Microendoscopy voor In situ Cellular Imaging

Meer video's verkennen