Name: Isolatie en Cultuur van Pulmonary endotheelcellen van neonatale muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-14T17:35:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Leer pulmonale endotheelcellen isoleren en kweken uit longweefsel van neonatale muizen met behulp van magnetische kralen. Deze methode verbetert de zuiverheid en opbrengst voor vasculair onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd mede ondersteund door de Amerikaanse Heart Association verlenen 0950118G.to MC-W.

1. Voorbereiden van anti-PECAM-1 antilichaam-geconjugeerd magnetische korrels (Dynabeads) <ol><li> Bereid 0,1% BSA in PBS door het mengen van 50 mg BSA in 50 ml PBS met behulp van een vortex tot BSA oplost. Steriliseren in gefilterd door 0.22 urn spuitfilter. Bewaren bij 4 ° C. </li><li> In de TC kap, overdracht 200 ul van goed geresuspendeerd schapen anti-rat IgG Dynabeads in een 1,5 ml Eppendorf buis en was de kralen: Mount slang op MPC en laat zitten voor ongeveer 1 minuut tot de kralen te laten sediment. Supernatant aspireren, verwijdert u de tube van MPC en resuspendeer de kralen in 1 ml steriele 0,1% BSA / PBS. Pipet op en neer om kralen mengen. </li><li> Herhaal dit was nog drie keer, voor een totaal van vier wasbeurten. </li><li> Verwijder de slang van de MPC en resuspendeer de kralen in 500 pi van 0,1% BSA / PBS. </li><li> Voeg 10 ul rat anti-muis PECAM-1 (CD-31) antilichaam aan de buis. </li><li> Tumble nacht bij 4 ° C in de koude kamer of 2 uur bij kamertemperatuur. </li><li> Was de kralen met een steriele 0,1% BSA / PBS, zoals beschreven in stap 1.2 vier keer. </li><li> Verwijder de slang van de MPC en resuspendeer de kralen in 200 ul 0,1% BSA / PBS. Store anti-PECAM-1 antilichaam-geconjugeerd Dynabeads bij 4 ° C gedurende maximaal 1 maand. </li></ol> 2. Isoleren van de muis pulmonale endotheliale cellen van neonatale muizen Voordat u verdergaat met het weefsel zuivering protocol, is IACUC Comite de goedkeuring van de procedure vereist is. <ol><li> Bereid het volgende: <ul><li> 15 ml van 1 mg / ml C / D-oplossing in DMEM. Filter met 0,22 urn spuitfilter en warm tot 37 ° C. </li><li> 50 ml conische buis met 15 ml DMEM, op ​​te slaan op het ijs </li><li> Isolatie Media (IM) met 20% FBS en 1x penicilline / streptomycine in DMEM </li><li> 2% gelatine. Mix 2 g runder huid gelatine met 100 ml water dd, autoclaaf 15 minuten en bewaren bij 4 ° C. Warm tot 37 ° C tot vloeibaar te maken voor het coaten TC kolven. </li></ul></li><li> Verdoven drie 6-8 dagen oude pups met behulp van een IP-injectie van ketamine (100 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg). Controleer op de effectiviteit van de anesthesie en ontleden dieren een voor een, als volgt: Pin pups aan boord, de huid nat met 70% ethanol en verwijder de huid van de borst met een steriel dissectie schaar. Accijnzen de ribbenkast aan de longen bloot te leggen. </li><li> Aseptisch accijnzen individuele longkwabben, zorg dat u de bronchiën en zichtbare bindweefsel rond de longen ontleden. Combineer alle longen in ijskoud DMEM. Laten inslapen van de pups. </li><li> Werken in de TC kap, verwijder longkwabben van DMEM, plaats in een 100 mm TC schotel en zuig overtollige DMEM. </li><li> Met behulp van steriele schaar, fijn gehakt het weefsel door te snijden ~ 100 keer. Transfer naar 15 ml warm C / D-oplossing voor de enzymatische spijsvertering. Incubeer 45 minuten bij 37 ° C op een rotator. </li><li> In de TC kap, zuigen de verteerde weefsel suspensie in een 20 ml spuit met 14 g canule bevestigd en vermaal klonten in een enkele celsuspensie, minstens 12 keer. </li><li> Voorbij het weefsel suspensie door een 70 um cel zeef en spoel het filter met 15 ml IM om de spijsvertering te stoppen. </li><li> Pellet celsuspensie door centrifugeren bij 400x g gedurende 5 minuten. </li><li> Aspireren supernatant en resuspendeer pellet in 3 ml 0,1% BSA / PBS. </li><li> Overdracht celsuspensie tot 5 ml met ronde bodem polystyreen reageerbuis en voeg 22,5 pl anti-PECAM-1 antilichaam-geconjugeerd Dynabeads. Tumble bij kamertemperatuur gedurende 12 minuten. </li><li> Coat een T75 fles met 2 mL 2% gelatine en zuig overtollige gelatine. Laat gelatine op in de TC kap droog gedurende ongeveer 30 minuten voor plating cellen. </li><li> Na de incubatie kraal is voltooid (stap 2,10), split celsuspensie even in drie Eppendorf buizen en monteren op het MPC. </li><li> Wanneer de kralen hebben gesedimenteerd het gebruik van de MPC (~ 1 min), het verzamelen van supernatant, tube van MPC te verwijderen, wassen kralen met ~ 1 ml 0,1% BSA / PBS, en dan opnieuw kunnen mounten op het MPC. </li><li> Herhaal dit was vier maal (totaal vijf wasbeurten) </li><li> Resuspendeer kralen in 1 ml van VascuLife met EnGS-Mv Life Factoren Kit en 1x penicilline / streptomycine (VL) per buis, mengen goed. </li><li> Plaat op een pre-gecoate T75 kolf en brengen het totale volume in elke kolf tot 10 ml met VL. </li><li> Wijzig de media de volgende dag, laat een volledige dag van groei, en wijzigt u vervolgens de helft van de media om de andere dag. Wanneer de cellen worden&gt; 70-80% samenvloeiende of meer (meestal na 3-4 dagen van cultuur), kunnen ze worden gesorteerd met anti-ICAM-2 Dynabeads. </li></ol> 3. Voorbereiden van anti-ICAM-2 antilichaam-geconjugeerd Dynabeads <ol><li> Anti-ICAM-2 antilichaam-geconjugeerd Dynabeads worden gebruikt om verder te zuiveren cellen die zijn geselecteerd met anti-PECAM-1 antilichaam-geconjugeerde Dynabeads en gekweekt tot de samenvloeiing. Deze procedure wordt uitgevoerd zoals beschreven voor anti-PECAM-1 antilichaam-geconjugeerd Dynabeads (1, boven), behalve dat anti-muis ICAM-2 (CD-102) antilichaam wordt gebruikt in plaats van anti-PECAM-1 antilichaam. </li><li> Anti-ICAM-2 antilichaam-geconjugeerd Dynabeads kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurendetot 1 maand. </li></ol> 4. Sorteren Mouse Lung endotheelcellen met anti-ICAM-2 Dynabeads <ol><li> Vacht T75 weefselkweek kolf met 2% gelatine. </li><li> Aspireren de media uit de samenvloeiing T75 fles met cellen en wassen met 8 ml PBS. </li><li> Aspireren PBS, voeg 2 ml 0,05% trypsine / EDTA en laat cellen los (ongeveer 5 minuten). Klop lichtjes op kolven op de steun los. </li><li> Wanneer de cellen zijn vrijstaand, voeg 2 ml IM tot trypsine en schraap cellen remmen om de resterende hechtende cellen los te maken. Overdracht celsuspensie om een ​​15 ml buis en spin down gedurende 5 min bij 400x g. </li><li> Aspireren van de media en resuspendeer celpellet in 2 ml 0,1% BSA / PBS. </li><li> Transfer naar een 5 ml polystyreen ronde bodem buis en voeg 10 ul anti-ICAM-2 Dynabeads. Tumble gedurende 12 minuten bij RT. </li><li> Splitsen celsuspensie in twee 1,5 ml Eppendorf buizen en monteren op MPC. </li><li> Aspireren supernatant na kralen hebben gehouden voor een minuut. Verwijder de buizen van MPC en resuspendeer elk buisje in 1 ml 0,1% BSA / PBS. Monteer op de MPC. </li><li> Herhaal dit was vier keer (in totaal vijf wasbeurten). </li><li> Resuspendeer elk buisje met 1 ml VL en het uitvoeren van een celgetal. </li><li> Plaat-cellen bij 250-350K cellen per T25 fles en / of 750K-1 miljoen cellen per T75 fles. </li><li> Breng het volume op 5 ml VL in T25 flessen, en 10 ml in T75 kolven. </li><li> Verandering media om de andere dag. Cellen kunnen worden gebruikt voor experimenten als cultuur bereikt ongeveer 80% confluentie, meestal in 2-3 dagen. </li></ol> 5. Representatieve resultaten Typisch, na 6-7 dagen na de eerste voorbereiding van de cellen, zijn wij in staat om te verkrijgen over 1,2 tot 1,5 x 10 6 pulmonale endotheelcellen uit drie 6-8 dagen oude pups. Cellen tonen typische "kinderkopjes" morfologie onder lichte microscopie en show VE-cadherine (CD144) kleuring bij cel-cel-juncties, die kenmerkend is voor de endotheelcellen (Figuur 1). Meerderheid van de MLECs express VE-cadherine en VEGFR2 zoals wordt aangetoond door FACS-analyse (figuur 2). Meestal gebruiken we ze voor experimenten binnen twee weken na de eerste MLEC isolatie. <img src="/files/ftp_upload/2316/2316fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Microscopische analyse van confluerende MLEC monolaag. (A) Lichtmicroscopie afbeelding toont kasseien morfologie van de gekweekte cellen typisch voor de endotheelcellen. Uniforme ronde structuren gelegen in het perinucleaire gebied van vele cellen zijn de magnetische korrels gebruikt voor MLEC isolatie. (B) endotheliale-specifieke VE-cadherine is gelokaliseerd in de cel-cel verbindingen zoals weergegeven met behulp van confocale microscopie. Bar is vertegenwoordiger van 20μm. <img src="/files/ftp_upload/2316/2316fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2 FACS-analyse van gekweekte MLECs gemerkt met antilichamen die specifiek zijn voor het endotheel-specifieke merkers:. VE-cadherine (CD144) of VEGFR2, zoals aangeklaagd, gevolgd door phycoerythrine-geconjugeerd secundair antilichaam, bevestigt endotheliale identiteit van geïsoleerde MLECs. Rode lijn geeft isotype-specifieke controle, groene lijn geeft aan anti-VE-cadherine of anti-VEGFR2 - specifiek-IgG.

<ol><li>Maruyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+endothelial+cell+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Z+Zellforsch+Mikrosk.+Anat%22%5BJournal%5D)">The human endothelial cell in tissue culture.</a> Z Zellforsch Mikrosk. Anat. 60, 69-79 (1963).</li>
<li>Lim, Y. C., Luscinskas, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+murine+heart+and+lung+endothelial+cells+for+in+vitro+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of murine heart and lung endothelial cells for in vitro model systems.</a> Methods Mol Biol. 341, 141-154 (2006).</li>
<li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+heterogeneity+of+the+endothelium%3A+I.+Structure%2C+function%2C+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Phenotypic heterogeneity of the endothelium: I. Structure, function, and mechanisms.</a> Circ Res. 100, 158-173 (2007).</li>
<li>Fehrenbach, M. L., Cao, G., Williams, J. T., Finklestein, J. M., Delisser, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+lung+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine lung endothelial cells.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 296, L1096-L1103 (2009).</li>
<li>Miebach, S., Grau, S., Hummel, V., Rieckmann, P., Tonn, J. C., Goldbrunner, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+microvascular+endothelial+cells+from+gliomas+of+different+WHO+grades%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurooncol%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of microvascular endothelial cells from gliomas of different WHO grades.</a> J. Neurooncol. 76, 39-48 (2006).</li>
<li>Demeule, M., Labelle, M., Régina, A., Berthelet, F., Béliveau, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+endothelial+cells+from+brain%2C+lung%2C+and+kidney%3A+expression+of+the+multidrug+resistance+P-glycoprotein+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Isolation of endothelial cells from brain, lung, and kidney: expression of the multidrug resistance P-glycoprotein isoforms.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 281, 827-834 (2001).</li>
<li>Kajimoto, K., Hossen, N., Hida, K., Ohga, N., Akita, H., Hyodo, M., Hida, Y., Harashima, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+microvascular+endothelial+cells+from+murine+inguinal+and+epididymal+adipose+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of microvascular endothelial cells from murine inguinal and epididymal adipose tissues.</a> J. Immunol. Methods. 357, 43-50 (2010).</li>
<li>Breviario, F., Caveda, L., Corada, M., Martin-Padura, I., Navarro, P., Golay, J., Introna, M., Gulino, D., Lampugnani, M. G., Dejana, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+properties+of+human+vascular+endothelial+cadherin+%287B4%2Fcadherin-5%29%2C+an+endothelium-specific+cadherin%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional properties of human vascular endothelial cadherin (7B4/cadherin-5), an endothelium-specific cadherin.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 15, 1229-1239 (1995).</li>
<li>Zachary, I., Gliki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+transduction+mechanisms+mediating+biological+actions+of+the+vascular+endothelial+growth+factor+family%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Signaling transduction mechanisms mediating biological actions of the vascular endothelial growth factor family.</a> Cardiovasc Res. 49, 568-581 (2001).</li>
<li>Diglio, C. A., Grammas, P., Giacomelli, F., Wiener, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+heart-derived+endothelial+and+smooth+muscle+cell+cultures%3A+isolation%2C+cloning+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Cell%22%5BJournal%5D)">Rat heart-derived endothelial and smooth muscle cell cultures: isolation, cloning and characterization.</a> Tissue Cell. 20, 477-492 (1988).</li>
<li>Petzelbauer, P., Bender, J. R., Wilson, J., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+dermal+microvascular+endothelial+cell+antigen+expression+and+cytokine+responsiveness+in+situ+and+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of dermal microvascular endothelial cell antigen expression and cytokine responsiveness in situ and in cell culture.</a> J Immunol. 151, 5062-5072 (1993).</li>
<li>Chrzanowska-Wodnicka, M., Kraus, A. E., Gale, D., White, G. C. 2nd, Vansluys, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+angiogenesis%2C+endothelial+migration%2C+proliferation%2C+and+MAPK+signaling+in+Rap1b-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Defective angiogenesis, endothelial migration, proliferation, and MAPK signaling in Rap1b-deficient mice.</a> Blood. 111, 2647-2656 (2008).</li>
</ol>

Experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door Medical College of Wisconsin IACUC comite onder protocol AUA # 00001206 in te stellen.

Microvasculaire EC hebben bewezen een nuttig model in veel gebieden van de vasculaire biologie worden en worden geacht te zijn fysiologisch relevant zijn voor onderzoek (bv. angiogenese) dan uitgebreid bestudeerd HUVEC 3. Eerder is gemeld dat microvasculaire EC kan worden verkregen bij nier, hart, huid, netvlies, de hersenen, gliomen, vetweefsel en ook long-2, 4-7, 10, 11. Er is echter een consistente en betrouwbare methode voor het isoleren van microvasculaire EC nog nodig. De procedure hier wordt gepresenteerd is een wijziging van een eerder gepubliceerd protocol 2, het verschilt van de meeste gepubliceerde procedures in die zin dat gebruik maakt van pups in plaats van volwassen dieren. Dit is cruciaal voor de isolatie succes als cellen van jonge dieren hebben een hogere proliferatie potentieel en culturen uit hun weefsels hebben de neiging om groter aantal cellen opleveren. Een week oude dieren lijken te zijn optimaal, maar jonger muizen (4 dagen oud) kan ook worden gebruikt. Ook kan hoger of lager aantal pups worden gebruikt indien nodig, zoals we zijn succesvol geweest in het isoleren van MLECs van een pup. Echter, terwijl de schaal omhoog of omlaag de isolatie proces moet cel-plating dichtheid blijven ongewijzigd, aangezien dit ook is van cruciaal belang voor celproliferatie. De 2-staps zuiveringsproces van MLECs met behulp van magnetische beads geconjugeerd eerste anti-PECAM-1 en dan de anti-ICAM-2-antilichamen is veel efficiënter op het verkrijgen van zuivere EG culturen dan de eerder beschreven single-stap zuivering procedures. Dit protocol elimineert de noodzaak om zeer bewerkelijke manuele technieken, gradiënt centrifugatie en minder efficiënt FACS sortering voor het weggooien van besmetting van cellen zoals fibroblasten, bloedcellen en gladde spiercellen te gebruiken. De resulterende MLEC bevolking kan worden gebruikt voor in vitro analyse van angiogene responsen, vasculaire permeabiliteit en leukocyten transmigratie, wondgenezing en biochemische analyse van signaalwegen. Indien gewenst kan MLECs worden uitgeplaat op verschillende ondergronden, zoals fibronectine of gelatine-gecoate dekglaasjes voor immunofluorescentie of electrode-arrays voor trans-endotheliale weerstand (TER) metingen. Behaalde resultaten kunnen direct worden vergeleken met de fenotypes waargenomen in vivo, wat vooral belangrijk is in het kader van het groeiende aantal knock-out en transgene muis lijnen. Succesvolle implementatie van deze methode voor in-vitro analyse van de cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan defecten waargenomen in vivo, is al gepresenteerd 12.

<table><tbody><tr><td>Veerschaar</td><td>Fine Science Tools</td><td>15032-13</td><td></td></tr><tr><td>pincet</td><td>Fine Science Tools</td><td>11223-20</td><td></td></tr><tr><td>14G canule</td><td>Fisher Scientific</td><td>1482516N</td><td></td></tr><tr><td>20 ml spuit</td><td>BD Biosciences</td><td>309661</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030-100G</td><td></td></tr><tr><td>anti-rat IgG Dynabeads</td><td>Invitrogen</td><td>110.35</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Particle Concentrator (MPC)</td><td>Invitrogen</td><td>123-21D</td><td></td></tr><tr><td>anti-muis PECAM-1 antilichaam (CD-31)</td><td>BD Biosciences</td><td>553369</td><td></td></tr><tr><td>anti-muis ICAM-2 antilichaam (CD-102) </td><td>BD Biosciences</td><td>553326</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase/Dispase (C/D)</td><td>Roche Group</td><td>11097113001</td><td>Een stockoplossing van 100mg/ml kan worden bereid en bewaard bij -20&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Runderhuidgelatine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#G9391-100G</td><td></td></tr><tr><td>Vasculife EnGS-Mv complete kit (VL)</td><td>Lifeline Cell Technology</td><td>LL0004</td><td></td></tr><tr><td>0,05% Trypsine/EDTA </td><td>Mediatech, Inc.</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>Celzeef 70 &amp;mu;m nylon</td><td>Falcon BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>weefselkweekfles 75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Techno Plastic Products</td><td>90076</td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie en cultuur van pulmonary endotheelcellen van neonatale muizen

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endotheelcellen een nuttige onderzoeksmodel in veel gebieden van de vasculaire biologie. Sinds zijn eerste isolatie 1, hebben menselijke navelstreng endotheel cellen (HUVEC) laten zien dat handig zijn, gemakkelijk te verkrijgen en cultuur, en dus zijn de meest bestudeerde endotheelcellen. Echter, voor onderzoek gericht op processen, zoals angiogenese, doorlaatbaarheid of vele anderen, microvasculaire endotheelcellen (EC) is een veel meer fysiologisch relevante model 2-studie. Bovendien, EC geïsoleerd van knock-out muizen bieden een nuttig instrument voor de analyse van eiwitfunctie ex vivo. Verschillende benaderingen te isoleren en de cultuur microvasculaire EC van verschillende herkomst is gemeld dat de datum 3-7, maar consistent isolatie en de cultuur van pure EC is nog steeds een groot technisch probleem in veel laboratoria. Hier bieden wij een stap-voor-stap protocol op een betrouwbare en relatief eenvoudige methode van isoleren en kweken van muizen long endotheelcellen (MLECs). In deze benadering, longweefsel verkregen van 6 - tot 8-dagen oude pups eerste is in stukken gesneden, gedigereerd met collagenase / dispase (C / D)-oplossing en verspreid mechanisch in de single-celsuspensie. MLECS worden gezuiverd van de celsuspensie met behulp van positieve selectie met anti-PECAM-1 antilichaam geconjugeerd aan Dynabeads met behulp van een Magnetic Particle Concentrator (MPC). Dergelijke gezuiverde cellen worden gekweekt op gelatine gecoate weefselkweek (TC) gerechten totdat ze confluent. Op dat moment worden de cellen verder worden gezuiverd met behulp van Dynabeads gekoppeld aan anti-ICAM-2 antilichaam. MLECs verkregen met dit protocol vertonen een geplaveide fenotype, zoals gevisualiseerd door fase-contrast lichtmicroscopie, en hun endotheel fenotype is bevestigd met behulp van FACS-analyse met anti-VE-cadherine 8 en anti-VEGFR2 9 antilichamen en immunofluorescentie kleuring van VE-cadherine. In onze handen, deze twee-staps procedure isolatie consistente en betrouwbare wijze levert een zuivere populatie van MLECs, die kan worden verder gekweekt. Deze methode zal onderzoekers in staat om te profiteren van het groeiend aantal knock-out en transgene muizen om direct in vivo studies correleren met de resultaten van in vitro experimenten uitgevoerd op geïsoleerde MLECs en zo moleculaire mechanismen van vasculaire fenotypes waargenomen in vivo zichtbaar te helpen.

We beschrijven hier een protocol voor het kweken van muizen pulmonale endotheelcellen. Deze methode bestaat uit mechanische en enzymatische longweefsel dissociatie evenals een 2-staps zuiveringsproces met behulp van anti-PECAM-1 en anti-ICAM-2 antilichamen geconjugeerd aan magnetische korrels, die een pure endotheelcellen bevolking van voornamelijk microvasculaire oorsprong produceert.

Isolatie en Cultuur van Pulmonary endotheelcellen van neonatale muizen

Endotheelcellen bieden een nuttig onderzoeksmodel in vele gebieden van de vasculaire biologie. Sinds de eerste isolatie 1, zijn menselijke navelstrengvene-endotheelcellen ...

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren en kweken van pulmonale endotheelcellen uit pasgeboren muizen. Dit wordt bereikt door eerst een homogene cel-suspensie te maken van vers geoogste longen. Vervolgens wordt het weefsel fijngehakt en onderworpen aan enzymatische digestie, waarna de endotheelcellen worden verrijkt met behulp van magnetische beads geconjugeerd met anti P chem one antilichamen.CETA-cultuur zuivert de endotheelcelpopulatie. Vervolgens worden met anti-ICAM2-antilichaam geconjugeerde magnetische kralen gebruikt om deze cellen te isoleren en te vermeerderen in een met gelatine gecoate kolf. De resulterende primaire pulmonale endotheelcellen zijn grotendeels van microvasculaire oorsprong en brengen specifieke endotheelcelmarkers tot expressie, zoals TIERIN en VEGF R2.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals irna-genonderdrukking, is dat het mogelijk maakt om transgene muizen te gebruiken om genetisch gemodificeerde endotheelcellen te verkrijgen. Bovendien zijn endotheelcellen verkregen met deze techniek grotendeels van microvasculaire oorsprong en kunnen ze daarom relevanter zijn voor bepaalde gebieden binnen het vasculair onderzoek. Endotheelcellen die met deze methode worden verkregen, kunnen helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de vasculaire biologie, zoals die met betrekking tot de moleculaire mechanismen van angiogenese en vasculaire permeabiliteit.Een visuele demonstratie van deze techniek is essentieel, aangezien de stappen voor het oogsten, ligeren van het weefsel en het wassen van de aan de beads gebonden cellen moeilijk aan te leren zijn. Onjuiste uitvoering van deze techniek kan leiden tot contaminatie met niet-endotheliale cellen en een lage celopbrengst en -groei. Bereid voor dit dyna beads-protocol 50 milliliters 0,1% BSA in PBS voor en meng dit door te vortexen tot het BSA is opgelost; steriliseer de oplossing vervolgens door deze door een spuit met een 0,22 micron filter te leiden.Filter onder steriele omstandigheden in de weefselkweekkap. Resuspendeer sheep anti-rat IgG DynaBeads en breng 200 µL over in een 1,5 ml Eppendorf-buisje. Om de beads te wassen, plaatst u het buisje op de magnetische partikelconcentrator (MPC) en laat u de beads één minuut bezinken, waarna het supernatant wordt geaspireerd. Verwijder het buisje uit de MPC en resuspendeer de beads in 1 ml steriele 0,1% BSA-PBS.Herhaal deze wasbeurt nog drie keer na de vierde wasbeurt. Verwijder de buis uit de MPC en Resus. Suspendeer de beads in 500 µL 0,1% B-S-A-P-B-S.Voeg 10 µL rat anti-muis pcam one-antilichaam toe aan de buis en roteer deze twee uur lang bij kamertemperatuur, zoals eerder getoond. Was de beads vier keer met steriele 0,1% B-S-A-P-B-S. Verwijder de buis uit de MPC en resuspendeer.Bewaarde de beads in 200 µL 0,1% B-S-A-P-B-S. Deze preparatie van anti P chem one antilichaam-geconjugeerde dyna beads dient op vier graden Celsius te worden bewaard. Anestheseer drie pups van zes tot acht dagen oud om primaire cellen te verkrijgen.Controleer de effectiviteit van de anesthesie door in de staarten te knijpen met een pincet. Disseceer de dieren opeenvolgend. Zet eerst de pup vast op een plank en verwijder de huid van het borstgebied.Verwijder met dissectieschaar de borstkas om de longen bloot te leggen. Exciteer vervolgens aseptisch de afzonderlijke longkwabben. Let er hierbij op dat de bronchiën of zichtbaar bindweefsel rond de longen niet worden doorgesneden.Combineeer alle longen in ijskoude DMEM en euthanaseer vervolgens de pups. Ga nu naar de weefkweekkap. Verwijder de longkwabben uit de DMEM en plaats ze in een weefkweekschaal van 100 millimeter.Zuig het overtollige DMEM af en versnipper het weefsel met steriele scharen. Snijd uiteindelijk ongeveer honderd keer voor enzymatische digestie. Overbreng de weefselpreparaat naar 15 milliliters warme collagenase-oplossing en incubeer dit gedurende 45 minuten bij 37 °C op een rotator, waarbij een 20 milliliter spuit is verbonden met een 14 gauge canule. Tritureer klonters van het gedigesteerde weefsel tot een single-cell suspensie.Filter de celsuspensie nu door een 70 micrometer cell strainer en spoel de strainer met 15 milliliters Im om de digestiereactie te stoppen. Centrifugeer om de pulmonale cellen te oogsten bij 400 Gs gedurende vijf minuten en aspireer het supernatant weg. Resuspendeer vervolgens de celpellet in drie milliliters 0,1%B-S-A-P-B-S en breng dit over naar een polystyrene tube met een ronde bodem van vijf milliliter.Om de endotheelcellen te isoleren, worden 22,5 µL anti P chem one antilichaam-geconjugeerde dyna beads toegevoegd en gedurende 12 minuten bij kamertemperatuur getumbled. Bekleed ondertussen een T 75-fles met twee milliliter 2% gelatine. Aspireer het overtollige gelatineoplossing en laat dit ongeveer een half uur aan de lucht drogen in de weefselkweekkap. Zodra de incubatie met de beads is voltooid, wordt de celsuspensie gelijkmatig verdeeld over drie fendor-buisjes en geplaatst op de MPC.Was de dyna beads vijf keer met ongeveer één milliliter 0,1% B-S-A-P-B-S met behulp van het MPC-systeem. Resuspendeer de beads na de laatste wasbeurt in één milliliter VAs life per buis. Meng alle buizen goed door elkaar. Plateer de dyna bead celpreparatie in de vooraf gecodeerde T 75-fles en vul het totale volume in de fles aan tot 10 milliliter met VAs life.Plaats de kolven nu in een incubator op 37 °C met 5% koolstofdioxide. Vervang de volgende dag het medium, laat de cellen één volledige dag groeien en vervang vervolgens om de dag de helft van het medium totdat de cellen voor meer dan 70 tot 80% confluent zijn. Om de primaire celcultuur verder te zuiveren, bereidt u antilichaam-geconjugeerde DynaBeads zoals eerder beschreven, maar ditmaal met gebruik van CD 1 0 2 en muse I chem 2 antilichamen.Coat daarnaast een T 75 weefselkweekfles met 2% gelatine, zoals eerder beschreven. Haal nu de T 75 fles met cellen uit de incubator. Aspireer het medium en was de primaire cellen met acht milliliter PBS.Voeg na de PBS twee milliliter 0,05% tripsine-EDTA toe en laat de cellen ongeveer vijf minuten detacheren. Tik lichtjes tegen de kolf om de celdetachering te bevorderen. Voeg twee milliliter IM toe om de tripsine te remmen en schraap eventuele resterende adhesieve cellen los.Breng de cel-suspensie over naar een buis van 15 milliliter. Oogst de cellen door centrifugatie gedurende vijf minuten bij 400 ×g, aspireer het medium af en resuspendeer de celpellet in twee milliliters 0,1% BSA in PBS. Breng dit over naar een polystyreen ronde bodem buis van vijf milliliter en voeg 10 µL anti-ICAM-2 Dynabeads toe. Laat dit 12 minuten rollen bij kamertemperatuur, verdeel de cel-suspensie over twee Eppendorf-buisjes van 1,5 milliliter en monteer deze op het MPC-systeem.Was de beads, zoals voorheen, in totaal vijf keer met één milliliter 0,1% B-S-A-P-B-S-A. Resuspendeer vervolgens elke buis in één milliliter VAs life en voer een celtelling uit. Plateer tot slot de cellen in een dichtheid van 800 tot 1000 K cellen per T 75-fles in 10 milliliter VAs life. Plaats de flessen in een celkweekincubator.Vervang het medium om de dag totdat de culturen een confluentie van ongeveer 80% bereiken. De gezuiverde endotheelcellen uit de longen van muizen zijn nu klaar voor gebruik in experimenten. Gewoonlijk levert een celpreparaat van drie pups van zes tot acht dagen oud 1,2 tot 1,5 x 10⁶ pulmonale endotheelcellen op na een week in cultuur.Zoals verwacht vertonen deze primaire endotheelcellen een kasseistructuur-morfologie onder lichtmicroscopie en laten ze ook een coherente VE-kleuring zien bij de cel-celverbindingen. Met dit protocol tot gevolg tot expressie van VE-coherent en VEGF R twee in de meerderheid van de endotheelcellen uit de longen van muizen, zoals aangetoond door fax-analyse. De rode lijn geeft de isotype-specifieke controle aan en de groene lijn geeft anti-VE- of anti-VEGF R twee-specifiek IgG aan.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om alleen het doelweefsel te oogsten, overmatige digestie van de cellen te vermijden en de aan de beads gebonden cellen grondig te wassen. Endotheelcellen zijn verkregen. Deze procedure kan worden gebruikt voor functionele assays binnen de vasculaire biologie om responsen te analyseren die relevant zijn voor angiogenese en vasculaire permeabiliteit.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u primaire muisendotheelcellen kunt isoleren met behulp van DynaBeads gebonden aan chem one-antilichamen en chem two-antilichamen, en hoe u zuivere endotheelcelculturen kunt verkrijgen.

isolation-culture-pulmonary-endothelial-cells-from-neonatal

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze methode wordt beschreven hoe isoleren en onsterfelijk microvasculaire endotheelcellen van muizenhersenen. We beschrijven een stap-voor-stap protocol vanaf het homogeniseren van het hersenweefsel, digestie stappen zaaien en immortalisatie van de cellen. Meestal duurt het ongeveer vijf weken voor het verkrijgen van een homogene, vereeuwigd microvasculaire endotheliale cellijn.

Genereren van een geïmmortaliseerde Murine Brain microvasculaire endotheliale cellijn als<em&gt; In Vitro</em&gt; Blood Brain Barrier Model

Primaire muis cardiomyocytkweken is een van de cruciale instrumenten voor het onderzoek myofibrillar inrichting en functie. Het volgende protocol beschrijft de isolatie en de cultuur van primaire cardiomyocyten van neonatale muis harten. De resulterende cardiomyocytkweken kunnen vervolgens worden gebruikt voor een verscheidenheid van biomechanische, biochemische en celbiologische assays.

Isolatie en cultuur van de Neonatale Mouse Cardiomyocytes

We hebben een nieuwe en reproduceerbare techniek om primaire culturen van pulmonale arteriële gladde spiercellen (PASMC) isoleren van muizen zo jong als P7 ontwikkeld, waardoor een betere studie van de signaalwegen betrokken bij neonatale gladde spiercellen samentrekken en ontspannen mogelijk.

Isolatie van longslagader gladde spiercel van Neonatale Muizen

Deze video toont een eenvoudige en betrouwbare strategie voor de bereiding van zuivere kweken van endotheelcellen van embryonale voorhersenen binnen 10-12 dagen en zal nuttig zijn voor onderzoek zich op vele aspecten van cerebrale angiogenese.

Isolatie en Cultuur van de endotheelcellen van de embryonale voorhersenen

Hersenmicrovasculaire endotheelcellen (BMEC) zijn onderling verbonden door specifieke junctionele eiwitten die een sterk gereguleerde barrière vormen die bloed en het centrale zenuwstelsel (CZS) scheiden, de zogenaamde bloed-hersenbarrière (BBB). De isolatie van primaire muis-hersenmicrovasculaire endotheelcellen, zoals besproken in dit protocol, maakt gedetailleerde in vitro studies van de BBB mogelijk.

Isolatie van Primary Muriene Brain microvasculaire endotheelcellen

De vasculaire endotheelcellen spelen een belangrijke rol bij veel belangrijke cardiovasculaire aandoeningen. Dit artikel beschrijft een eenvoudige methode om endotheelcellen te isoleren en uit te breiden van de muisaorta zonder het gebruik van speciale apparatuur. Ons protocol biedt een effectieve manier om mechanismen in de fysiopathologie van endotheelcellen te identificeren.

Isolatie en Primaire Cultuur van de muis endotheelcellen

Dit protocol is opgesteld om onze methode voor het isoleren van muizen coronaire endotheelcellen te delen, met als doel beeldvorming of om moleculair-biologische experimenten uit te voeren.

Isolatie van muis coronaire endotheelcellen

In dit artikel werden primaire longendotheelcellen geïsoleerd en gekweekt uit neonatale muizen.

Isolatie van primaire longendotheelcellen van muizen

Hoewel uitdagend, is de isolatie van pulmonale endotheelcellen essentieel voor studies naar longontsteking. Dit protocol beschrijft een procedure voor de hoogproductieve, zeer zuivere isolatie van macrovasculaire en microvasculaire endotheelcellen.

Microvasculaire en macrovasculaire endotheliale celisolatie en zuivering van longmonsters

Dit protocol biedt een op flow cytometrie gebaseerde methode om levensvatbare alveolaire type II epitheelcellen (AECII) te isoleren uit neonatale, juveniele of volwassen muislongen (geïnfecteerd of niet-geïnfecteerd). Deze aanpak maakt downstream moleculaire en/of functionele studies van AECII mogelijk om hun rol tijdens longontsteking en infectie te identificeren.

Isolatie van alveolaire Type II epitheelcellen uit neonatale, juveniele en volwassen muislongen die zich kunnen aanpassen aan infectieuze experimentele omgevingen

Leer pulmonale endotheelcellen isoleren en kweken uit longweefsel van neonatale muizen met behulp van magnetische kralen. Deze methode verbetert de zuiverheid en opbrengst voor vasculair onderzoek.

Isolatie en Cultuur van Pulmonary endotheelcellen van neonatale muizen

Meer video's verkennen