Decellularisatie en Recellularization van Whole Levers

Het algemene doel van deze procedure is het prepareren van gedecellulariseerde levertransplantaten met behulp van een gedecellulariseerde levermatrix. Dit wordt bereikt door eerst een donorlever te cannuleren. Het orgaan wordt vervolgens gedecellulariseerd door perfusie met een reeks detergentoplossingen.

De revascularisatie van de gedecellulariseerde levermatrix wordt vervolgens uitgevoerd door middel van perfusie van primaire hepatocyten van volwassenen. Ten slotte wordt een in vitro profusiesysteem gebruikt om het gecellulariseerde levertransplantaat te kweken. Uiteindelijk kunnen resultaten worden behaald die de hepatische functie van de herschalede transplantaten in vitro aantonen door middel van de meting van albumine, ureum en de totale galzuitsecretie in het profusiemedium.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de fabricage van scaffolds met synthetische biomaterialen en traditionele weefselkweektechnieken, is naar mijn mening de aanwezigheid van de weefselspecifieke samenstelling van de extracellulaire matrix. De geperfuseerde, gedecellulariseerde scaffold behoudt bovendien de weefselspecifieke microarchitectuur, zoals de vasculaire structuur. De aanwezigheid van deze vasculaire structuur stelt ons in staat om de cellen gelijkmatiger in de scaffold te herintroduceren.

Het stelt ons daarnaast in staat om het uniform te perfunderen met voedingsstoffen om de overleving van de cellen te verbeteren. Het deceleratiegedeelte van het protocol zal worden gedemonstreerd door Nima, samen met de postdoctorale onderzoeker in ons laboratorium. Het gedeelte over de retailisatie zal worden gedemonstreerd door Gabriel Price, die eveneens een postdoctoraal onderzoeker is.

Haar werk richt zich op de industrialisatie van deze transplantaten. Om perfusie-decellularisatie uit te voeren, begint u met het oogsten van een rattenlever via canulatie van de vena portalis. Laat de vena cava inferior en superior open met behulp van een katheter van 18 gauge. Houd het orgaan gehydrateerd in fosfaatgebufferde zoutoplossing of PBS in een petrischaal van 10 centimeter.

Stel vervolgens een perfusiesysteem samen dat bestaat uit een reservoir van acht liter, een peristaltische pomp en een belletjesvanger. Vul het perfusiesysteem met fosfaatgebufferde zoutoplossing of PBS en laat dit 10 minuten draaien. Vul daarna een Petrischaal van 10 centimeter met PBS en verlaag de stroomsnelheid van de buffer naar 1,2 milliliters per minuut.

Breng de geoogste lever zorgvuldig over naar de Petrischaal met PBS en laat deze gedurende de nacht perfunderen. De volgende dag wordt de lever gedurende vijf minuten geperfundeerd met 0,01% sodium ESAL sulfate of SDS in gedestilleerd water.

Schakel vervolgens voor één uur terug naar PBS. Herhaal de perfusiestappen met SDS en PBS nog drie keer, waarbij de perfusietijd met SDS wordt verlengd naar 10, 15 en tenslotte 20 minuten. Perfuseer de lever vervolgens met de volgende serie: 0,01% SDS gedurende 24 uur.

0,1% SDS gedurende 24 uur. 0,2% SDS gedurende drie uur, 0,5% SDS gedurende drie uur. Gedestilleerd water gedurende 15 minuten, 1% Triton X 100 in gedestilleerd water gedurende 30 minuten, wat eventuele gebonden nucleïnezuren zal verwijderen.

En tenslotte PBS gedurende twee uur, wat de gedecellulariseerde levermatrix of DLM zal wassen nadat de perfusie is voltooid; indien gewenst, resecteer alle lobben behalve de mediane lob. Bewaar de DLM in een schone en afgesloten Petrischaal in PBS bij vier graden Celsius tot het moment van gebruik. Om de DLM te steriliseren, spoel deze dan met steriele PBS die 0,1% perazijnzuur en 4% ethanol bevat en incubeer deze gedurende drie uur bij vier graden Celsius.

Was daarna de DLM twee keer met steriel PBS. Was vervolgens met PBS dat 2% penicilline streptomycin (10 µg/mL) en 2,5 µg/mL amphotericine B bevat. Bewaar de gedecellulariseerde lever in dezelfde oplossing bij 4 °C tot deze klaar is voor gebruik in de recellularisatie-experimenten.

Ten tweede, om een gedecellulariseerde levermatrix te cellulariseren onder een weefselkweekkap. Begin met een perfusiesysteem dat vergelijkbaar is met het systeem dat werd gebruikt om de lever te decellulariseren. Vul het perfusiesysteem met 200 milliliters kweekmedium, zoals high glucose DMEM, 10% foetaal runderserum, 100 units per milliliter penicilline en 100 micrograms per milliliter Streptomycine.

Plaats de DLM in de perfusiekamer en verbind deze via de canule van de poortader met het perfusiesysteem terwijl de pomp draait met vijf milliliters per minuut. Om de vorming van luchtbellen te voorkomen, laat u het medium de DLM gedurende 30 minuten perfunderen. Stop vervolgens de stroom in het perfusiesysteem en injecteer langzaam 50 miljoen hepatocyten, die zijn geïsoleerd uit een volwassen rat, via de luchtbelvanger in het perfusiesysteem.

Hervat de doorstroming bij 10 milliliters per minuut en recirculeer het medium gedurende 10 minuten. Stop de doorstroming van het medium opnieuw. Injecteer nog eens 50 miljoen hepatocyten.

Start vervolgens de flow opnieuw op 10 milliliters per minuut. Herhaal deze procedure totdat in totaal 200 miljoen hepatocyten in het DLM zijn gebracht. Zodra alle cellen in het DLM zijn geïnjecteerd, worden de profuse eight verzameld in 50 milliliter centrifugebuizen en gecentrifugeerd bij 800 RPM gedurende vijf minuten.

Verwijder de supernatanten en breng de pellets samen in één enkele buis. Bepaal het aantal cellen en hun levensvatbaarheid via tryanblauw-uitsluiting. Dit dient om de zaaiefficiëntie voor de kweek vast te stellen.

Een levertransplantat cellulariseren. Stel een steriel perfusiesysteem in dat een oxygenator bevat. Vul het perfusiesysteem met 50 milliliters kweekmedium, zoals Williams E met 5%PBS en 0,5 units per milliliter insuline.

20 nanogram per milliliter EGF, 14 nanogram per milliliter glucagon, 7,5 microgram per milliliter hydrocortison, 100 units per milliliter penicilline en 100 microgram per milliliter streptomycine. Plaats het gecellulariseerde levertransplantaat in de perfusiekamer en verbind het via de canule van de poortader met het perfusiesysteem terwijl de pomp draait op vijf milliliter per minuut.

Sluit de perfusiekamer aseptisch om de vorming van luchtbellen te voorkomen en verzegel deze stevig om lekkage tijdens het kweken te vermijden. Incubeer het perfusiesysteem bij 37 °C met 10% CO2 en verhoog de perfusiesnelheid naar 15 mL per minuut. Sluit de oxygenator aan op een gastank met een mengsel van 95% O2 en 5% CO2 en stel de gasstroomsnelheid in op 0,5 L per minuut.

Hiermee moet een zuurstofpartiële druk van ongeveer 400 millimeter kwik worden bereikt. Zet de cultuur tot maximaal 10 dagen voort, waarbij het cultuurmedium dagelijks wordt ververst. Neem dagelijks monsters van het medium om de secretie van albumine, ureum en totale galzuren te bepalen, zodat de leverfuncties van het transplantaat aan het einde van de cultuurperiode kunnen worden gemonitord.

Neem monsters van het gedecellulariseerde levertransplantaat voor moleculaire en histologische analyse. De volledige decellularisatie van een rattenlever duurt ongeveer 72 uur, gebruikmakend van het beschreven protocol.

De resulterende matrix behoudt 100% van het fibrillaire collageen, 50% van de glycoaminoglycanen en slechts 5% van het DNA van de oorspronkelijke lever. De vasculaire structuur van de matrix blijft behouden, zoals aangetoond door corrosiegieten en scanning elektronenmicroscopie-analyse. De aanwezigheid van de vasculaire microarchitectuur binnen de DLM vergemakkelijkt de repopulatie met cellen met een efficiëntie van 96% en de daaropvolgende perfusie.

Voor in vitro cultuur kan het levertransplantaat tot 10 dagen in vitro worden gekweekt en vertoont het correcte leverfuncties, zoals bevestigd via de secretie van albumine, ureum en totale galzuren. Na het bekijken van deze video zou u dus een goed inzicht hebben in hoe u de gehele lever kunt decellulariseren en recellulariseren.