Name: Decellularisatie en Recellularization van Whole Levers (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-04T17:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Leer perfusie-decellularisatie van rattenlevers voor regeneratieve geneeskunde. Deze methode behoudt de extracellulaire matrix en vasculaire structuur voor herbevolking met hepatocyten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen graag Jack Milwid bedanken voor het ontwerp van de in vitro perfusie kamer. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Amerikaanse NIH, R01DK59766 en R01DK084053 om MIJN, R00DK080942 aan KU, de Amerikaanse NSF cbet-0853569 aan KU en de Shriners Hospitals for Children te BEU (subsidie ​​niet. 8.503). Erkennen wij ook ondersteuning en de Shriners Hospitals for Children.

1. Lever decellularisatie <ol><li> Oogst een rat lever met poortader canulatie het gebruik en de 18-gauge katheter. Laat de lagere en hogere vena cava open. Houd het orgel gehydrateerd in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) in een 10-cm petrischaal. </li><li> Stel een perfusie systeem dat bestaat uit 8-liter reservoir, peristaltische pomp en een opvanginrichting. </li><li> Vul het perfusie-systeem met fosfaat gebufferde zoutoplossing en houd het draaien voor 10 minuten. Vul PBS in een 10-cm petrischaal en vermindering van het debiet van fosfaat gebufferde zoutoplossing tot 1 ml / min. </li><li> Voorzichtig de geoogste lever naar de fosfaat gebufferde zoutoplossing gevuld 10-cm petrischaal. </li><li> 'S nachts doorgaan met PBS perfusie. </li><li> Begin perfusie met 0,01% (w / v) natriumdodecylsulfaat (SDS) in gedestilleerd water gedurende 5 minuten. </li><li> Perfuseren met PBS gedurende 1 uur. </li><li> Herhaal de stappen 1.6 en 1.7 nog drie keer het verhogen van de SDS perfusie tijd tot 10, 15 en 20 minuten op elk tijdstip. </li><li> Ga door perfusie met 0,01% (w / v) SDS gedurende 24 uur. </li><li> Ga door perfusie met 0,1% (w / v) SDS gedurende 24 uur. </li><li> Perfuseren met 0,2% (w / v) SDS gedurende 3 uur. </li><li> Perfuseren met 0,5% (w / v) SDS gedurende 3 uur. </li><li> Perfuseren met gedestilleerd water gedurende 15 minuten. </li><li> Perfuseren met 1% (w / v) Triton X-100 in gedestilleerd water gedurende 30 minuten aan een gebonden nucleïnezuren te verwijderen. </li><li> Te wassen van de gedecellulariseerde lever matrix (DLM), perfuseren met PBS gedurende 2 uur. </li><li> Optioneel: reseceren alle lobben, behalve de mediaan lob. </li><li> Bewaar de DLM in een schone en verzegeld petrischaal gedrenkt in PBS bij 4 ° C tot het klaar voor gebruik (figuur 1). </li><li> Voor het steriliseren van de DLM: 1) Spoel de DLM met steriele PBS met 0,1% (v / v) perazijnzuur en 4% (v / v) ethanol en incubeer gedurende 3 uur bij 4 ° C. 2) Was met steriele PBS twee keer. 3) Was met steriele PBS met 2% penicilline-streptomycine, 10ug / ml gentamicine en 2,5 ug / ml amfotericine B. Bewaar de gedecellulariseerde lever in dezelfde oplossing bij 4 ° C tot het klaar is om te gebruiken voor recellularization experimenten. </li></ol> 2. Recellularization van gedecellulariseerde lever Matrix <ol><li> Stel een perfusie-systeem dat bestaat uit een perfusie kamer, peristaltische pomp en een opvanginrichting, onder steriele omstandigheden. Vul het perfusie-systeem met 200 ml kweekmedium, bijvoorbeeld, een hoge glucose DMEM (Sigma), 10% foetaal runderserum (Hyclone,), 100 U ml-1 penicilline en 100 ug ml-1 streptomycine (Invitrogen). </li><li> Plaats de gedecellulariseerde lever matrix in de perfusie kamer en sluit de DLM om de perfusie-systeem via de poortader canule, terwijl de pomp draait op 5 ml / min tot de vorming van eventuele luchtbellen te voorkomen. </li><li> Laat perfusie van het medium door middel van de DLM gedurende 30 minuten. </li><li> Isoleer de primaire hepatocyten van een volwassen rat met ten minste 90% levensvatbaarheid. </li><li> Stop de stroming in de perfusie-systeem en langzaam 50000000 hepatocyten (in 1-3 ml kweekmedium) te injecteren in perfusie-systeem via de opvanginrichting. </li><li> Start het debiet bij 10 ml / min en recirculeren het medium voor 10 minuten. </li><li> Herhaal de stappen 2.5 en 2.6 tot een totaal van 200 miljoen cellen worden ingevoerd in het DLM (figuur 2) 6. </li><li> Als alle cellen perfusie in de DLM, het verzamelen van de perfusaat in vier van 50 ml centrifugebuis en centrifugeer bij 600 rpm gedurende 10 minuten. Gooi de supernatants en verzamel de pellets in een enkele buis. Bepaal het aantal cellen en de levensvatbaarheid via trypan blauw uitsluiting voor de seeding efficiency te bepalen. </li></ol> 3. In Vitro Cultuur van de Recellularized lever Graft <ol><li> Stel een perfusie-systeem dat bestaat uit een perfusie kamer, peristaltische pomp, oxygenator en een opvanginrichting, onder steriele omstandigheden (figuur 3). Vul het perfusie-systeem met 50 ml kweekmedium, bijvoorbeeld Williams 'E (Sigma), 5% foetaal runderserum (Hyclone,), 0,5 ml-1 U insuline (Eli Lilly), 20 ng ml-1 EGF (Invitrogen) , 14 ng ml-1 glucagon (Bedford Laboratories), 7,5 ug ml-1 hydrocortison (Pharmacia), 100 U ml-1 penicilline en 100 ug ml-1 streptomycine (Invitrogen). </li><li> Plaats de recellularized lever transplantaat in de perfusie kamer en sluit de DLM om de perfusie-systeem via de poortader canule, terwijl de pomp draait op 5 ml / min tot de vorming van eventuele luchtbellen te voorkomen. </li><li> Aseptisch sluit de perfusie kamer en zegel strak om lekkage tijdens de cultuur te vermijden. </li><li> Breng de perfusie-systeem om een incubator die is 37 o C en 10% CO 2 en verhoging van de perfusie debiet tot 15 ml / min. </li><li> Sluit de oxygenator tot een 95% O 2 en 5% CO 2 gasmengsel tank en zet het gas debiet tot 0,5 liter / min. Dit moet bereikt een partiële zuurstofdruk van de onderlingetely 400 mmHg. </li><li> De cultuur kan blijven tot 10 dagen met de dagelijkse veranderingen van de cultuur medium. Het kweekmedium kan dagelijks worden bemonsterd voor de bewaking van de lever functies van het transplantaat zoals albumine, ureum en totaal gal zuursecretie. Aan het einde van de cultuur periode mag de recellularized lever transplantatie worden bemonsterd voor moleculaire en histologische analyse. </li></ol> 4. Representatieve resultaten: De volledige decellularisatie van een rat duurt ongeveer 72 uur met de beschreven protocol. De resulterende matrix behoudt 100% van het collagenen, 50% van de glycosaminoglycanen en slechts 5% van het DNA van de inheemse lever (tabel 1) 6. De vasculaire structuur van de matrix is bewaard gebleven, zoals blijkt uit corrosie gieten en scanning elektronenmicroscopie analyse (figuur 4) 6. De aanwezigheid van de vasculaire microarchitectuur binnen de DLM faciliteert haar herpopulatie met cellen met een rendement van 96% en de latere perfusie voor in vitro cultuur. De recellularized lever transplantatie kunnen worden gekweekt tot 10 dagen in vitro en geeft een goede lever functioneert als bevestigd via albumine, ureum en totaal galzuur secretie (figuur 5) 6. <img src="/files/ftp_upload/2394/2394fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Gedecellulariseerde lever matrix aan het einde van het decellularisatie proces. (A) de gehele lever (b) de mediane lob na resectie. <img src="/files/ftp_upload/2394/2394fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Schematische weergave van de recellularization van het DLM. <img src="/files/ftp_upload/2394/2394fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Perfusie-systeem setup voor in vitro cultuur van de recellularized lever transplantaat. <img src="/files/ftp_upload/2394/2394fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. De microvasculaire structuur is behouden in de gedecellulariseerde lever matrix. Corrosie gegoten beelden van een), een normale lever b) een gedecellulariseerde lever, portal (rood) en veneuze (blauw) vaatstelsel. Scanning elektronenmicroscopie beelden van het DLM c) een schip, d) een deel met galweg-achtige kleine schepen (pijlen), Schaal bars (a, b) 5 mm (c, d) 20 micrometer. <img src="/files/ftp_upload/2394/2394fig5.jpg" alt="Figuur 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 5"> Figuur 5. Lever specifieke functies van de lever recellularized graft tijdens de perfusie in vitro cultuur. a) albumine secretie (p = 0,5249), b) ureum productie (p = 0,5271) en c) het totaal gal zuursecretie (p = 0,0114). Statistische analyse van het verschil tussen het experiment en de controle werd uitgevoerd op de 10 d cultuur periode door te testen Friedman's op a = 0.01. Foutbalken geven sem (n = 3). <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Verse Livera </td><td> Gedecellulariseerde lever matrix een </td><td rowspan="2"> p-waarden </td><td rowspan="2"> % Van de verse lever </td></tr><tr><td></td><td> n = 4 </td><td> n = 8 </td></tr><tr><td> Collageen </td><td rowspan="2"> 0,07 ± 0,01 </td><td rowspan="2"> 0,08 ± 0,03 </td><td rowspan="2"> 0.56 </td><td rowspan="2"> 114% </td></tr><tr><td> (Mg per g lever) </td></tr><tr><td> Glycosaminoglycanen </td><td rowspan="2"> 73,1 ± 6,7 </td><td rowspan="2"> 34,2 ± 2,9 </td><td rowspan="2"> 0.004 </td><td rowspan="2"> 47% </td></tr><tr><td> (Mg per g lever) </td></tr><tr><td> DNA </td><td rowspan="2"> 14,9 ± 5,6 </td><td rowspan="2"> 0,44 ± 0,08 </td><td rowspan="2"> 3.3 10 -5 </td><td rowspan="2"> 2,9% </td></tr><tr><td> (Mg per g lever) </td></tr></tbody></table> Tabel 1. De biochemische samenstelling van het gedecellulariseerde lever matrix ten opzichte van de autochtone lever. een Waarden zijn weergegeven als gemiddelde ± SEM

<ol><li>Kulig, K. M., Vacanti, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Transpl+Immunol%22%5BJournal%5D)">Hepatic tissue engineering.</a> Transpl Immunol. 12, 303-310 (2004).</li>
<li>Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biomaterials+as+instructive+extracellular+microenvironments+for+morphogenesis+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering.</a> Nature biotechnology. 23, 47-55 (2005).</li>
<li>Dahl, S. L., Koh, J., Prabhakar, V., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+native+and+engineered+arterial+scaffolds+for+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Decellularized native and engineered arterial scaffolds for transplantation.</a> Cell Transplant. 12, 659-666 (2003).</li>
<li>Schechner, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engraftment+of+a+vascularized+human+skin+equivalent%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Engraftment of a vascularized human skin equivalent.</a> FASEB J. 17, 2250-2256 (2003).</li>
<li>Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F., F, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+of+tissues+and+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Decellularization of tissues and organs.</a> Biomaterials. 27, 3675-3683 (2006).</li>
<li>Uygun, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+reengineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nat Med. , (2010).</li>
</ol>

De perfusie decellularisatie hier beschreven methode levert een hele lever steiger die dezelfde grove structuur en de vasculaire microarchitectuur van de inheemse lever heeft. De steiger heeft een extracellulaire matrix samenstelling vergelijkbaar is met de inheemse lever. De recellularization methode bereikt herbevolking van de steiger met cellen bij hoge rendement en de cellen blijven haalbare en functionele tijdens de in vitro geteste cultuur periode. Met de toevoeging van nonparenchymal cellen in de lever r...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/Details.php?ID=2394">Decellularization and Recellularization of Whole Livers</a>. There was an error with an author's name. The author's last name had a typo and was corrected to:
Nima Saeidi
instead of:
Nima Saedi.

Erratum: Decellularization and Recellularization of Whole Livers

<table><tbody><tr><td>Natriumdodecylsulfaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4390</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S digitale aandrijving</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07523-80</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S standaard pompkop</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW- 07013-81</td><td></td></tr><tr><td>Bellenvanger</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>130149</td><td></td></tr></tbody></table>

decellularisatie en recellularization van whole levers

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

De lever is een complex orgaan dat constant perfusie vereist voor de levering van voedingsstoffen en zuurstof en de verwijdering van afval om een overleven. Pogingen om opnieuw of de lever microstructuur na te bootsen met een terrein-up benadering met behulp van tissue engineering en microfabricage technieken zijn niet succesvol geweest tot nu toe als gevolg van dit ontwerp uitdaging. Daarnaast zijn synthetische biomaterialen gebruikt om de steigers voor de lever tissue engineering-applicaties te maken is beperkt in het induceren van weefselregeneratie en reparatie voor een groot deel te wijten aan het ontbreken van een specifieke cel binding motieven die zou leiden tot de juiste celfuncties 2. Gedecellulariseerde inheemse weefsels zoals bloedvaten en de huid 3 4 aan de andere kant hebben vele toepassingen gevonden in tissue engineering, en hebben een praktische oplossing voor enkele van de uitdagingen. Het voordeel van gedecellulariseerde inheemse matrix, is dat het behouden, tot op zekere hoogte, de originele samenstelling, en de microstructuur, dus versterking van celhechting en reorganisatie 5. In dit werk beschrijven we de methoden om perfusie-decellularisatie van de lever, zodanig dat een intact lever bioscaffold dat de structuur van de grote bloedvaten behoudt wordt verkregen uit te voeren. Verder beschrijven we methoden om deze bioscaffolds recellularize met volwassen primaire hepatocyten, het creëren van een lever transplantatie die functioneel is in vitro, en heeft het schip toegang nodig is voor transplantatie in vivo.

Perfusie decellularisatie is een nieuwe techniek om hele lever scaffolds dat het orgel van de extracellulaire matrix samenstelling en microarchitectuur behoudt produceren. Hierin wordt de werkwijze voor het bereiden gehele orgel steigers met behulp van perfusie decellularisatie en de daaropvolgende herstel van de populatie met hepatocyten beschreven. Functionele en transplanteerbare lever enten kan worden gegenereerd met behulp van deze techniek.

Decellularisatie en Recellularization van Whole Levers

De lever is een complex orgaan dat een constante perfusie vereist voor de aanvoer van voedingsstoffen en zuurstof en de afvoer van afvalstoffen om te kunnen overleven1. Pogingen om ...

Het algemene doel van deze procedure is het prepareren van gedecellulariseerde levertransplantaten met behulp van een gedecellulariseerde levermatrix. Dit wordt bereikt door eerst een donorlever te cannuleren. Het orgaan wordt vervolgens gedecellulariseerd door perfusie met een reeks detergentoplossingen.De revascularisatie van de gedecellulariseerde levermatrix wordt vervolgens uitgevoerd door middel van perfusie van primaire hepatocyten van volwassenen. Ten slotte wordt een in vitro profusiesysteem gebruikt om het gecellulariseerde levertransplantaat te kweken. Uiteindelijk kunnen resultaten worden behaald die de hepatische functie van de herschalede transplantaten in vitro aantonen door middel van de meting van albumine, ureum en de totale galzuitsecretie in het profusiemedium.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de fabricage van scaffolds met synthetische biomaterialen en traditionele weefselkweektechnieken, is naar mijn mening de aanwezigheid van de weefselspecifieke samenstelling van de extracellulaire matrix. De geperfuseerde, gedecellulariseerde scaffold behoudt bovendien de weefselspecifieke microarchitectuur, zoals de vas

decellularization-and-recellularization-of-whole-livers

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

De studie van de lever sinusoïdale endotheelcellen (SEC) moeten worden uitgevoerd met primaire cellen afkomstig van het dier als geen cel-lijnen bestaan. Deze methode is gebaseerd op de lever spijsvertering en differentiële centrifugatie voor SEC zuivering voor latere kweken en experimenteren.

In vivo Lever endocytose gevolgd door zuivering van levercellen door leverperfusie

Een methode om snel en volledig cellulaire componenten uit een intact varkens hart door retrograde perfusie beschreven. Deze methode levert een plaatsspecifieke cardiale extracellulaire matrix scaffold die het potentieel voor gebruik in verscheidene klinische toepassingen.

Procedure voor decellularisatie van Varkens Heart van Retrograde coronaire perfusie

Het artikel beschrijft een methode voor de productie van een acellulair matrix rat darm. De afleiding van intestinale steigers is belangrijk voor toekomstige toepassingen in tissue engineering, stamcel biologie en drugstesten.

Een Decellularisatie Methode voor de productie van een natuurlijke Acellular Intestinale Matrix

Decellularisatie van hele organen produceert natuurlijke biologische scaffolds die kunnen worden gebruikt voor regeneratieve geneeskunde. Er wordt een beschrijving gepresenteerd van een niet-menselijke primaatmodel van longregeneratie waarbij hele longen worden gedecellulariseerd en vervolgens worden gezaaid met volwassen stamcellen en endotheelcellen in een bioreactor die vasculaire circulatie en vloeibare media-ventilatie vergemakkelijkt.

Niet-menselijke primaat longdecellurisatie en recellerisatie met behulp van een gespecialiseerde bioreactor voor grote organen

De gepresenteerde technieken voor leveroogst, canulerings- en perfusietechnieken met behulp van ons eigen apparaat, maken geavanceerde perfusie-opstellingen mogelijk om de decellularisatie- en recellularisatie-experimenten in rattenlevers te verbeteren.

Procedure voor Decellularisatie van Rat Levers in een oscillerende druk perfusie Device

Dit protocol beschrijft de decellularisatie van Sprague Dawley rattennieren door antegrade perfusie van detergenten door het vaatstelsel, waardoor acellulaire nier extracellulaire matrices ontstaan die dienen als sjablonen voor herbevolking met menselijke nier epitheliale cellen. Recellularisatie en het gebruik van de resazurin perfusie assay om groei te monitoren wordt uitgevoerd binnen speciaal ontworpen perfusie bioreactoren.

Epitheelcellen Herbevolking en voorbereiding van knaagdieren extracellulaire matrix Stellingen voor nierweefsel Development

De recellulariseerde extracellulaire matrix van een decellulaire rattenlever kan worden gebruikt als een gehumaniseerd, driedimensionaal ex vivo model om de distributie en transgenexpressie van een virus of vireel vector te bestuderen.

Studie van virale vectoren in een drie-dimensionale lever Model herbevolkt met de menselijke hepatocellulair carcinoom cellijn HepG2

Hier beschrijven we een protocol voor de decellularization van de saphenous ader met behulp van detergenten en recellularization door perfusie van het perifere bloed en het endotheel medium.

Decellularization en Recellularization methodologie voor menselijke Saphenous aderen

We stellen een nieuwe chirurgische techniek voor een in vivo één lever kwab perfusie model in rat als een voorwaarde voor de verdere studie van in vivo gedeeltelijke lever techniek in de toekomst.

Een nieuwe chirurgische techniek als een fundament voor In Vivo gedeeltelijke lever Engineering in Rat

Deze methode kan decellularization voor een complexe solide orgel met behulp van een eenvoudig protocol gebaseerd op osmotische schok en perfusie van Ionische detergent met minimale orgel matrix verstoring. Het bestaat uit een roman decellularization-techniek voor menselijke harten binnen een hydrofoor etui met real-time bewaking van flow dynamics en cellulaire puin uitstroom.

Decellularization van gehele menselijk hart binnen een hydrofoor tasje in een omgekeerde richting

Weefselengineering van de hele alvleesklier is een uitdaging vanwege zijn exocrine en endocriene functies. Laten we een methode voor de dissectie van een intact varkens alvleesklier en het proces van succesvolle decellularization door perfusie van detergentia Triton X-100, natrium-deoxycholate, en deoxyribonuclease.

Isolatie en Decellularization van een hele varkens alvleesklier

Leer perfusie-decellularisatie van rattenlevers voor regeneratieve geneeskunde. Deze methode behoudt de extracellulaire matrix en vasculaire structuur voor herbevolking met hepatocyten.

Decellularisatie en Recellularization van Whole Levers

Meer video's verkennen