Name: Ontwikkeling van een negatieve selecteerbare marker voor Entamoeba histolytica /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-12T17:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 5 s
Description: Leer een negatief selectiesysteem voor Entamoeba histolytica met het FCU1-chimeer eiwit en 5-fluorcytosine. Deze methode maakt selectieve eliminatie van getransfecteerde cellen mogelijk voor genetische manipulatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We willen graag Dr Philippe erbs bedanken voor het verstrekken van ons met de volgorde van FCU1 gen. Dit werk werd ondersteund door NIH subsidie ​​AI 26.649.

1. FCU negatieve selectie System in Entamoeba histolytica <ol><li> De vector controle lijn (HM1 / pKT3M) en de experimentele lijn (HM1/pKT3M-FCU1) werden gegenereerd door de eerder beschreven technieken 1,2. Zaad van de lijnen onder studie van de voorraad buizen in T-25 kolven en te onderhouden selectie door het toevoegen van geschikte antibioticum (12 ug / ml G418) in TYI-S-33 3 medium. De kolven moet 70-80% samenvloeiende na 16-18 uur van de groei op 37 ° C. </li><li> Bereid een verse voorraad 50 mM oplossing van 5-fluorocytosine (5-FC, Sigma) in warm TYI-S-33 medium. Vortex rigoureus een aantal minuten volledig op te lossen 5-FC. Filter-Steriliseer de stock-oplossing door het door een 0,22 urn filter. </li><li> Oogst trofozoïeten door het plaatsen van de kolven op ijs gedurende 3-5 minuten en het verzamelen van de cellen door centrifugeren bij 200xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Resuspendeer de pellet in verse TYI medium en tel de cellen. </li><li> Ontwerp van een typisch experiment maakt gebruik van 0,5 x 10 4 cellen per putje van een 48 wells plaat in een eindvolume van 1 ml, of drie herhalingen voor elke test conditie. Bovendien, om te bevorderen fluorescerende metingen, is een aparte plaat gebruikt voor elke stam per tijdstip. </li><li> Zaad 0,5 x 10 4 cellen per well voor elke test 5-FC concentratie, in drievoud. Handhaaf het antibioticum selectie druk in de TYI medium. Voeg nu de benodigde hoeveelheid van 5-FC stockoplossing aanwezig zijn en trofozoïeten aan elk putje. </li><li> Incubeer de platen in een anaërobe zak bij 37 ° C. </li></ol> 2. Bepaling van de Selectie-efficiëntie <ol><li> Bereid 2 mg / ml stockoplossing van Cell tracker groene CMFDA (Invitrogen) in DMSO. Om de werkende oplossing te verdunnen de voorraad 1000-voudige in serum-vrij TYI medium. </li><li> Volledig verwijderen van het medium uit trophozoite cultuur platen en te vervangen door 150 pi serum-vrij TYI met CMFDA. Ga door incubatie bij 37 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Verwijder de kleurstof oplossing uit putten en lees de plaat in de Spectramax M2 microplaat Spectrofluorometer. De excitatie golflengte moet worden vastgesteld op 492 nm en de fluorescentie-emissie te lezen bij 517 nm. </li><li> Vergelijk de fluorescentie waarden voor de controle cellen ten opzichte van de test transfectanten. </li><li> Ga door het lezen van de platen op elk tijdsinterval. Gebruik de juiste positieve (TYI alleen) en negatieve (25 ug / ml hygromycine) controle putten in elk bord. </li></ol> 3. Representatieve resultaten De E. histolytica transfectanten toonde sterke expressie van codon-geoptimaliseerde recombinant FCU1 (figuur 1). Wanneer dit protocol correct wordt nageleefd dit resulteert in selectieve eliminatie van E. histolytica cellen die FCU1 in aanwezigheid van 0,5 mM 5-fluorocytosine. Controle cellen, blijven in tegenstelling tot normaal groeien tot 5 mM concentratie van 5-FC en de samenvloeiing te bereiken tussen 72 en 96 uur (figuur 2-a). De FCU1 die cellen op 48 uur volledig gelyseerd wanneer de behandelde putten worden bekeken onder een microscoop. Deze tonen ook af fluorescentie na kleuring met de vitale kleurstof CMFDA, die wordt gebruikt in kwantitatieve studies waarbij grote aantal monsters (figuur 2-b). Het FCU1/5-FC systeem is een effectieve en krachtige negatieve selectie tool voor E. histolytica trofozoïeten. <img src="/files/ftp_upload/2410/2410fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Generatie van E. histolytica HM1 transfectanten uiten van negatieve selecteerbare marker (A) FCU1 recombinant eiwit werd ontdekt op een western blot met behulp van anti-c Myc antilichaam (bovenste paneel). Zoals verwacht, zou een 42kDa band worden gedetecteerd (aangegeven door een pijl) in de totale lysaat van de FCU transfectanten, maar niet in de vector alleen controle transfectanten. Het onderste paneel toont dezelfde blot onderzocht met anti actine antilichaam als een laad controle. (B) De resultaten van de kwantitatieve real-time PCR met de expressie van specifieke mRNA FCU1 genormaliseerd tot lgl4 te controleren. <img src="/files/ftp_upload/2410/2410fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. In vitro drug gevoeligheid van E. histolytica transfectanten uiten van negatieve selecteerbare marker Overlevingscurven van (een) controle transfectanten en (b) FCU1 uitdrukken transfectanten gekweekt in 48-well plaat. De cellen werden gekweekt in aanwezigheid van toenemende concentraties van de prodrug-5-fluorocytosine; overleving van de cel werd gekwantificeerd door CMFDA vlekken op elk tijdsinterval zoals aangegeven op de X-as. De Y-as staat voor fluorescentie-eenheden en is een directe weerspiegeling van de overlevende celpopulatie. Houdt u er rekening mee dat de FCU1 uiten transfectanten significant gevoeligheid toonde bij 0,5 mm prodrug concentratie in vergelijking met de controlegroep. Geen cellen werden waargenomen op 120h tijdstip in deze putten als comvergeleken aan de samenvloeiing groei zien in de bijbehorende controle putten onder de microscoop (gegevens niet getoond). Hygro duidt 25μg / ml hygromycine gebruikt als een negatieve controle.

<ol><li>Olvera, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+transfection+of+Entamoeba+histolytica+trophozoites+by+lipofection%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Med.+Res%22%5BJournal%5D)">Stable transfection of Entamoeba histolytica trophozoites by lipofection.</a> Arch. Med. Res. , 49-51 (1997).</li>
<li>Saito-Nakano, Y., Yasuda, T., Nakada-Tsukui, K., Leippe, M., Nozaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab5-associated+vacuoles+play+a+unique+role+in+phagocytosis+of+the+enteric+protozoan+parasite+Entamoeba+histolytica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Rab5-associated vacuoles play a unique role in phagocytosis of the enteric protozoan parasite Entamoeba histolytica.</a> J. Biol. Chem. 279, 49497-49507 (2004).</li>
<li>Diamond, L. S., Harlow, D. R., Cunnick, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+medium+for+the+axenic+cultivation+of+Entamoeba+histolytica+and+other+Entamoeba%5BTitle%5D)+AND+%22Trans.+R.+Soc.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">A new medium for the axenic cultivation of Entamoeba histolytica and other Entamoeba.</a> Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 72, 431-432 (1978).</li>
<li>Clark, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aClark%2C+C+%22Anaerobic+parasitic+protozoa+%3A+genomics+and+molecular+biology%22">Anaerobic parasitic protozoa : genomics and molecular biology</a>. , Caister Academic. Norfolk UK. (2010).</li>
<li>Linford, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+hairpin+RNA-mediated+knockdown+of+protein+expression+in+Entamoeba+histolytica%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Short hairpin RNA-mediated knockdown of protein expression in Entamoeba histolytica.</a> BMC Microbiol. 9, 38-38 (2009).</li>
<li>Solis, C. F., Guillén, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+genes+by+RNA+interference+in+the+protozoan+parasite+Entamoeba+histolytica%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Silencing genes by RNA interference in the protozoan parasite Entamoeba histolytica.</a> Methods Mol. Biol. 442, 113-128 (2008).</li>
<li>Solis, C. F., Santi-Rocca, J., Perdomo, D., Weber, C., Guillén, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+bacterially+expressed+dsRNA+to+downregulate+Entamoeba+histolytica+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Use of bacterially expressed dsRNA to downregulate Entamoeba histolytica gene expression.</a> PLoS ONE. 4, e8424-e8424 (2009).</li>
<li>MacFarlane, R. C., Singh, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+dsRNA-based+gene+silencing+in+Entamoeba+histolytica%3A+implications+for+approaches+to+genetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Loss of dsRNA-based gene silencing in Entamoeba histolytica: implications for approaches to genetic analysis.</a> Exp. Parasitol. 119, 296-300 (2008).</li>
<li>Dhar, S. K., Vines, R. R., Bhattacharya, S., Petri, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+DNA+fragments+enhance+the+stability+of+transfected+DNA+in+Entamoeba+histolytica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Eukaryot.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Ribosomal DNA fragments enhance the stability of transfected DNA in Entamoeba histolytica.</a> J. Eukaryot. Microbiol. 45, 656-660 (1998).</li>
<li>Erbs, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cancer+gene+therapy+by+adenovirus-mediated+transfer+of+a+bifunctional+yeast+cytosine+deaminase%2Furacil+phosphoribosyltransferase+fusion+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">In vivo cancer gene therapy by adenovirus-mediated transfer of a bifunctional yeast cytosine deaminase/uracil phosphoribosyltransferase fusion gene.</a> Cancer Res. 60, 3813-3822 (2000).</li>
<li>Braks, J. A. M., Franke-Fayard, B., Kroeze, H., Janse, C. J., Waters, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+a+positive-negative+selectable+marker+system+for+use+in+reverse+genetics+in+Plasmodium%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Development and application of a positive-negative selectable marker system for use in reverse genetics in Plasmodium.</a> Nucleic Acids Res. 34, e39-e39 (2006).</li>
<li>Maier, A. G., Braks, J. A. M., Waters, A. P., Cowman, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+selection+using+yeast+cytosine+deaminase%2Furacil+phosphoribosyl+transferase+in+Plasmodium+falciparum+for+targeted+gene+deletion+by+double+crossover+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biochem.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Negative selection using yeast cytosine deaminase/uracil phosphoribosyl transferase in Plasmodium falciparum for targeted gene deletion by double crossover recombination.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 150, 118-121 (2006).</li>
</ol>

De productie van deze video werd gesponsord door Sigma Aldrich, Inc, die een aantal van de gebruikte reagentia in dit artikel oplevert.

Hoewel er aanzienlijke vooruitgang in de Entamoeba moleculaire biologische tools zijn er geen actuele methoden beschikbaar om te verwijderen of verstoren genen 4. Knockdown van gen-specifieke expressie is bereikt door het gebruik van de hairpin RNA&#39;s 5, kleine interfererende RNA 6 en bacterieel uitgedrukt dsRNA 7. Maar deze methoden, terwijl effectief voor de respectieve streefwaarden genen, hebben een aantal beperkingen zoals het gebruik van dure chemicaliën, continue selectie tegen antibiotica en de noodzaak voor constante validatie door de hoge incidentie van terugval die zich in de tijd (Alicia Linford, persoonlijke communicatie) 8. Elke plasmide kan repliceren in Entamoeba want er is blijkbaar niet een strikte volgorde vereiste voor oorsprong van de DNA-replicatie 9, en dus als getransfecteerd, is het meestal moeilijk om een plasmide te genezen. Dit beperkt het mogelijke gebruik van intacte plasmiden in recombinatie en knockout experimenten. Negatieve selectie markers zijn belangrijke componenten van gen-targeting methodes als ze kunnen worden gebruikt om recombinant subpopulaties te elimineren. We hebben met succes een uitgesproken codon geoptimaliseerd FCU1 gen in Entamoeba histolytica en getest zijn potentieel als een negatief selecteerbare marker. Dit gen fusie werd gebruikt voor zelfmoord gentherapie van menselijke tumorcellen en metaboliseert de prodrug 5-FC in giftige downstream producten, resulterend in remming van RNA en DNA-synthese 10. FCU1 is onlangs gebruikt als een negatief selecteerbare marker in Plasmodium, een ander protozoaire parasiet. Plasmodium berghei cellen die FCU1 bleken bijna 1000 keer meer gevoelig voor de prodrug in vitro en in vivo behandeling met 5-FC doodde meer dan 99,9% van de infecteren recombinant parasieten in de erytrocytaire fase muismodel van malaria 11. E. histolytica cellen die FCU1 toonde slechts een 30-voudige verhoogde gevoeligheid voor de prodrug 5-FC in tegenstelling tot de gevoeligheid waargenomen in P. berghei. Mogelijke redenen hiervoor kan grote pool van nucleotiden in het groeimedium concurreren met de giftige metabolieten worden. In beide P. berghei en P. falciparum de FCU1 marker is gebruikt in gerichte gendisruptie. studies 11,12. Wij streven ernaar om de Entamoeba genoom met behulp van homologe recombinatie te manipuleren. De validatie van de FCU1/5-FC negatieve selectie systeem is een belangrijke stap in de richting van dit doel.

<table><tbody><tr><td>TYI-S-33 medium</td><td>ATCC</td><td></td><td>Referentie opgenomen in de tekst</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=F7129%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC">5-Fluorcytosine&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7129</td><td></td></tr><tr><td>Cell tracker green CMFDA</td><td>Invitrogen</td><td>C2925</td><td></td></tr><tr><td>Spectra Max M2 platlezer</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ontwikkeling van een negatieve selecteerbare marker voor entamoeba histolytica</em

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Entamoeba histolytica is de veroorzaker van amebiasis en infecteert tot 10% van de wereldbevolking. De moleculaire technieken die in staat hebben gesteld de up-en down-regulatie van genexpressie vertrouwen op de transfectie van stabiel blijft plasmiden. Hoewel deze hebben onze kennis van Entamoeba virulentiefactoren, de capaciteit om exogeen DNA te integreren in het genoom, die het mogelijk maken reverse genetics experimenten, zou een belangrijk voordeel zijn in de studie van deze parasiet. De uitdagingen van dit organisme zijn onvermogen om te kiezen voor homologe recombinatie gebeurtenissen en problemen bij het episomale plasmide DNA genezen van getransfecteerde trofozoïeten. De latere resulteert in een hoge achtergrond van exogeen DNA, een groot probleem bij de identificatie van trofozoïeten waarin een bonafide genomische integratie gebeurtenis heeft plaatsgevonden. Wij rapporteren de ontwikkeling van een negatieve selectie systeem dat gebaseerd is op transgene expressie van een gist cytosine en uracil deaminase fosforibosyltransferase Chimera (FCU1) en de selectie met prodrug 5-fluorocytosine (5-FC). De FCU1 enzym zet niet-toxische 5-FC in giftige 5-fluorouracil en 5-fluoro-5&#39;-monofosfaat. E. histolytica lijnen uitdrukken FCU1 bleken 30 keer gevoeliger voor de prodrug vergelijking met de controlegroep stam te zijn.

Wij rapporteren de ontwikkeling van een negatieve selectie systeem in<em&gt; E. histolytica</em&gt; Op basis van transgene expressie van een chimeer eiwit (FCU1) en selectie met de prodrug 5-fluorocytosine. De FCU1 eiwit is een fusie van gist cytosine en uracil deaminase fosforibosyl. Expressie van FCU1 resulteerde in een verhoogde<em&gt; E. histolytica</em&gt; Gevoeligheid voor 5-fluorocytosine.

Ontwikkeling van een negatieve selecteerbare marker voor Entamoeba histolytica</em

*Entamoeba histolytica* is het veroorzakende agens van amebiasis en infecteert tot 10% van de wereldbevolking. De moleculaire technieken die het mogelijk hebben gemaakt om ...

Het algemene doel van dit experiment is het valideren van het gebruik van het 5-FC FCU1-systeem als een negatieve selectiemethode in Enteramoeba histolytica. Zaai E. histolytica in 48-wells platen, transfect lijnen die ofwel het FCU1-gen of een passende vectorcontrole tot expressie brengen, en behandel de cellen met het pro-drug 5-FC. In cellen die hoge niveaus van FCU1 tot expressie brengen, zal 5-FC worden omgezet in effectieve hoeveelheden toxische eindproducten. De overlevende celpopulatie wordt gekleurd met CMFDA om de selectieve eliminatie van FCU1-expresserende cellen in de aanwezigheid van 5-FC aan te tonen en om de efficiëntie van de negatieve selectie kwantitatief te vergelijken. Dit negatieve selectiesysteem stelt ons in staat om voor het eerst episomale plasmiden te verwijderen uit getransfecteerde E. histolytica.Gezien de uitdagingen bij de aanwezigheid van conventionele genetische manipulatie, zou deze methode ons in staat kunnen stellen om genen te verstoren en te verwijderen, om vervolgens doelwit-VIR-factoren in ons programma voor geneesmiddelenonderzoek te testen. Trophozoïeten kunnen variëren in de mate waarin de voorraadculturen in het medium gedijen. Een fout aan het begin kan leiden tot artefacten en daarom is kwaliteitscontrole van de startcultuur een kritische vroege stap.Zaai de bestudeerde inba hisa-lijnen vanuit stockbuizen over in T 25-kolfjes en handhaaf de selectie door het toevoegen van het juiste antibioticum in TYIS 33-medium. Incubeer de kolfjes bij 37 °C gedurende 16 uur totdat de culturen een confluentie van ongeveer 80% hebben bereikt. Bereid voor deze procedure altijd een verse 50 mM stockoplossing van five fluorine of FC in warm TYIS 33.Vortex het medium grondig gedurende enkele minuten om de vijf FC volledig op te lossen en filter vervolgens om de stockoplossing te steriliseren via een 0,22 micron filter om de trofozoïeten te oogsten. Plaats de kolven drie tot vijf minuten op ijs en verzamel de cellen door te centrifugeren bij 200 ×g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Resuspendeer het pellet in vers TYI-medium en tel de cellen om latere fluorescentiemetingen te faciliteren.Voer de experimenten in drievoud uit en gebruik voor elke stam per tijdspunt een aparte plaat met 48 wells. Zaai 0,5 × 10⁴ cellen per well in een volume van 0,5 ml voor elke 5-FC concentratie, en handhaaf de antibiotische selectiedruk in het TYI-medium. Voeg nu de vereiste hoeveelheid 5-FC-stockoplossing toe, gevolgd door TYI-medium tot een eindvolume van 1 ml per well, en incubeer de platen in een anaerobe zak bij 37 °C.Bereid een voorraadoplossing van 2 mg/mL CellTracker Green C-M-F-D-A in DMSO. Verdun vervolgens de voorraadoplossing 1000 keer in serumvrij TYI-medium op de gespecificeerde experimentele tijdspunten om de werkoplosssing te maken. Verwijder het medium volledig uit de Tropho Xite-kweekplaten en vervang dit door 150 µL serumvrij TYI dat C-M-F-D-A bevat.Zet de incubatie voort bij 37 °C gedurende één uur en aspireer vervolgens de DI-oplossing uit de putjes. Lees tot slot de plaat uit in de SpectraMax M2 microplate spectrofluorimeter, met een excitatiegolflengte van 492 nm en een fluorescentie-emissie van 517 nm. Vergelijk de fluorescentiewaarden van de controlecellen met die van de geteste transfectie.Zet het aflezen van de platen voort bij elk tijdinterval. Gebruik altijd passende positieve en negatieve controleputjes in elke plaat. Western BLO-analyses tonen de succesvolle generatie aan van lya-transfecten die FCU one, de gist-cytosine-deaminase en uraciel-fosforibosyltransferase-chymera, tot expressie brengen.Deze resultaten worden ook weerspiegeld in kwantitatieve PCR-metingen. In de aanwezigheid van vijffluoruracil groeien controlecellen normaal tot een concentratie van 5 mM en bereiken ze confluentie tussen 72 en 96 uur. Daarentegen worden FCU1-expresserende E. histolytica-cellen selectief geëlimineerd in de aanwezigheid van 0,5 mM van het prodrug onder brightfield-microscopie.De selectieve respons van FCU-expresserende E. histolytica-cellen op het middel FC Pro is zichtbaar door het oplossen van de cellen. In dit geval worden de cellen 72 uur na transfectie gekweekt. Bij het uitvoeren van dit experiment is het belangrijk om de groei bij elk tijdstip te bewaken.Deze methode kan worden gebruikt bij hit-and-run mutagenese, wat we zullen gebruiken om belangrijke vragen over de virulentie van Inba Hisa te beantwoorden.

development-of-a-negative-selectable-marker-for-entamoeba-histolytica

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

De mogelijkheid om transgenen te produceren...

De productie van C. elegans Transgenen via Recombineering met de GalK Selecteerbare marker

Dit protocol beschrijft de bereiding van een synthetisch tRNA substraat voor...

In vitro tRNA methylatie test met de Entamoeba histolytica DNA en tRNA methyltransferase Dnmt2 (Ehmeth) Enzym

Hier laten we zien een eenvoudig protocol om een ​​willekeurige mutant bibliotheek te creëren voor een bepaalde doelsequentie. We laten zien hoe deze methode, die in vivo uitgevoerd in Escherichia coli, kan worden gecombineerd met functionele selecties van nieuwe enzymatische activiteiten evolueren.

Mutagenese en functionele selectie Protocollen voor Gerichte ontwikkeling van eiwitten in E. coli</em

Selectie van Plasmodium falciparum Parasieten voor Cytoadhesion Human Brain endotheelcellen

Forward genetica is een krachtige methode om moleculair niveau te ontrafelen van...

Een genetische screen te isoleren Toxoplasma gondii Host-cel Egress Mutants

Menselijke infectie door Entamoeba histolytica leidt tot amoebiasis, een belangrijke oorzaak van diarree in tropische landen. Infectie wordt gestart door pathogeen interactie met intestinale epitheelcellen, veroorzaken de opening van cel-cel contacten en bijgevolg diarree, soms gevolgd door leverbesmetting. Dit artikel geeft een model om de vroege gastheer-pathogeen interacties beoordelen in ons begrip van amoebiasis pathogenese verbeteren.

Analyse van de epitheelbeschadiging Geproduceerd door<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Infectie

Hier beschreven is een methode voor gerichte, markerless gen verwijdering in Chlamydia trachomatis met behulp van floxed cassette allelic uitwisseling mutagenese, FLAEM.

Markerless Gene Deletion door Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Hier beschrijven we de methodologie die wordt gebruikt voor het genereren van L. panamensis - en L. donovani-stammen die het gen voor eGFP tot expressie brengen als een stabiel geïntegreerd transgen met behulp van het pLEXSY-systeem. Getransfecteerde parasieten werden gekloond door verdunning te beperken en klonen met de hoogste fluorescentie-intensiteit in beide soorten werden geselecteerd voor verder gebruik in medicijnscreeningtests.

Ontwikkeling van Leishmania-soortenstammen met constitutieve expressie van eGFP

Met behulp van gemakkelijk beschikbare materialen, dit biocontained compostering systeem maakt het mogelijk effectieve on-site de verwijdering van grote kadavers die in het geval van besmettelijke ziekten uitbreken. Deze procedure doodt de meeste ziekteverwekkers bij karkassen en besmette mest. Zodra besmettelijke agent is bevestigd niet levensvatbaar, rijpe compost kan worden verspreid als meststof.

Biocontained Karkas Compostering voor de bestrijding van besmettelijke ziekte uitbreekt in Vee

We een flow cytometrie gebaseerde methode om T cel ontwikkeling...

Onderzoek van thymus positieve en negatieve selectie via flowcytometrie

Leer een negatief selectiesysteem voor Entamoeba histolytica met het FCU1-chimeer eiwit en 5-fluorcytosine. Deze methode maakt selectieve eliminatie van getransfecteerde cellen mogelijk voor genetische manipulatie.

Ontwikkeling van een negatieve selecteerbare marker voor Entamoeba histolytica

Meer video's verkennen