Name: Elektrofysiologische opnames van de Giant Fiber Pathway van D. melanogaster /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 53 s
Description: Leer elektrofysiologische opnames van synaptische transmissie in het Giant Fiber System van Drosophila melanogaster. Deze methode registreert post-synaptische potentialen in DLM- en TTM-spieren om neuronale circuits te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een Wellcome Trust toe te kennen aan LP

1. Apparatuur en materialen <ol><li> Deze experimenten gebruik van een standaard electrofysiologie setup bestaat uit een stimulator, een stimulans isolatie-eenheid, twee micro-elektrode versterkers, een data-acquisitie-systeem en een computer met software collectie. Extra uitrusting omvat een kooi van Faraday, een stereomicroscoop op een boom staan, een trillingsisolatie tafel, een lichtbron, en een opname platform. </li><li> Vijf micromanipulators worden gebruikt. Twee micromanipulators nodig fijne controles voor de positionering van de registrerende elektroden, terwijl de andere drie micromanipulators vereisen slechts bruto controles om de twee stimulatie elektroden en de massa-elektrode positie. De micromanipulator voor de DLM registratie-elektrode wordt geplaatst aan het uiteinde van de voorbereiding (links van de experimentator) en de micromanipulator voor de TTM registratie-elektrode wordt geplaatst tussen de experimentator en de zijkant van het preparaat (iets naar links van de experimentator). De twee micromanipulators dat houdt de simulatie elektroden worden geplaatst aan het hoofd van het preparaat (rechts van de experimentator). De micromanipulator voor de massa-elektrode wordt geplaatst aan de andere kant van het preparaat </li><li> Trek glazen micro-elektroden opnemen met weerstanden van 40-60 MΩ en op te slaan plat in een schaal wordt ondersteund door was. Voor stimulatie, zijn twee elektrolytisch (NaOH) verscherpt wolfraamelektroden gebruikt. Een wolfraam draad, of een derde elektrolytisch verzonnen elektrode wordt gebruikt als grond. De stimulerende en massa-elektroden worden voorbereid en aan de micromanipulators voor de start van de experimentele sessie en hoeft niet te worden vervangen voor de duur van de sessie. </li></ol> 2. De voorbereiding van de D. melanogaster <ol><li> Zodra de apparatuur is ingesteld, is het tijd om de vliegen te bereiden. Verdoven de vliegen door afkoeling op hen ijs of met behulp van CO 2. Als CO 2 wordt gebruikt, dan is voldoende tijd (ongeveer 20 minuten) voor de effecten van het gas voorafgaand slijten aan het begin van het experiment. </li><li> Gebruik een tang om voorzichtig overdracht van de vliegen door hun benen om een ​​schotel met een platform van zachte was helling onder een hoek van ongeveer 45 °. De volgende vier stappen zijn gedaan onder een dissectiemicroscoop uit de buurt van (maar dicht bij) de opname apparatuur. </li><li> De volgende stap is het veiligstellen van de vlieg in was. Orient-the-fly ventrale zijde naar beneden, met de voorste naar boven op de helling. Met behulp van een paar fijne tang, verlengen de benen naar buiten, in paren, en duw ze in de wax. </li><li> Vertrouwd te maken met de locatie van de spieren op te nemen van: de dorsale longitudinale spieren, of DLM, en de tergotrochanteral spier, of TTM. De subcutane bevestiging sites van de DLMS overeen met het gebied tussen de borstkas en de middellijn van de voorste dorsale haren (of setae). De TTM attachment sites zijn dorsaal gelegen van de achterste en voorste supra-alar haren. Ervoor zorgen dat de vleugels geen toegang tot het DLM-of TTM vezels belemmeren, naar buiten houd de vleugels en de 'lijm' ze aan de was. </li><li> Met behulp van een fijne tang, trek de slurf naar buiten zorgvuldig, en zet het door onderdompeling in de was. Dit is een cruciale stap die enige oefening vereist daar de proboscis is zacht en is gemakkelijk los van de rest van het hoofd. Als dat gebeurt, gooi de vliegen en opnieuw beginnen. Als de kop veilig op deze manier leidt tot problemen bij het invoeren van de stimulatie-elektroden door de ogen. </li></ol> 3. Het plaatsen van de elektroden <ol><li> Zodra de vlieg is verankerd aan de was, de overdracht van de schotel met de bijgevoegde vlieg onder de stereomicroscoop, dat bevindt zich in de kooi van Faraday. Orient de vlieg zijdelings met het hoofd van de vlieg aan de rechterkant van de experimentator. </li><li> De volgende stap is het plaatsen van de elektroden. Grond en stimulatie-elektroden kunnen worden ingevoegd zonder te kijken door de microscoop. Goede opnames steunen op nauwkeurige Impalement, dus het is een goed idee om te oefenen de behandeling van de micromanipulators. Breng de elektrodes die dicht bij de sites van inbrengen met de hulp van micromanipulators naar de juiste plaatsen en de daaropvolgende opnames te vergemakkelijken. </li><li> Laat de aardelektrode in het achterste einde van de buik met behulp van de aanpassing wielen op de micromanipulator. Voor het plaatsen van de aangescherpte wolfraam stimulatie-elektroden in de hersenen, gebruik dan de micromanipulator aan het uiteinde van een van de elektroden positie, zodat het net raakt een van de ogen vliegen's. Doe hetzelfde met de andere zodat beide elektroden zijn net aanraken van de buitenkant van elk oog. Duw de elektroden op zijn beurt, door middel van elk oog, zodat de uiteinden van de elektroden de hersenen bereiken gelegen aan de achterkant van het hoofd capsule (ongeveer 2-3mm). </li><li> Correct geplaatste elektroden wordt geactiveerd de Giant Fiber System. Om te testen dat de stimulatie-elektroden correct zijn geplaatst, pas een korte (0,03 ms) stimulus van 30-60V over de stimulatie-elektroden, en zoek naar beweging van de vleugels en de samentrekkingen van de vlucht / beenspier " </li><li> De volgende stap is om back-vul het glas micro-elektroden met 3M KCl met behulp van een Hamilton of warmte-getrokken plastic spuit, en plaats ze in de fijne-control micromanipulators. Correct geplaatst micro-elektroden gebruikt kan worden voor meerdere rondes van experimenten. </li><li> De eerste registratie-elektrode wordt ingebracht in een DLM vezel. Er zijn twee bilateraal symmetrische DLMS, elk een is opgebouwd uit zes afzonderlijke spiervezels. De opnamen kunnen worden gedaan vanaf elke van de zes vezels, maar de meest gebruikte zijn DLM vezels 45A en 45B als gevolg van hun goede bereikbaarheid via de dorsale zijde van de thoracale cuticula, en het feit dat beide vezels worden geïnnerveerd door dezelfde motorneuron . </li><li> Met behulp van de micromanipulator aan de kant het verst van je, plaatst u een registratie-elektrode in het DLM vezels 45a of b. De helling van het platform kan de DLM elektrode aan de dorsale cuticula betreden op een ~ 60-90 ° hoek, die de penetratie aids. Gebruik maken van de software in oscilloscoop modus en kijk naar het computerscherm, terwijl het invoegen van het opnemen van elektroden in de thorax. Wanneer de elektrode heeft een spier ging de basislijn zal dalen tot bijna nul of een negatieve waarde. Test met een enkele prikkel om te zien of je kunt de spier reactie te observeren. </li><li> Steek de andere opname elektrode in de TTM het dichtst bij je. Deze elektrode wordt zijdelings geplaatst, voor u, als gevolg van de ligging van de spier gehechtheid site. Opnieuw in acht van de monitor terwijl je dit doet en test met een enkele stimulus zodra het spoor geeft aan dat de elektrode in de spier. </li></ol> 4. Stimulatie en opnemen <ol><li> U bent nu klaar om te beginnen met het stimuleren van de hersenen en het opnemen van de reacties uit het been en de vlucht spieren. Breng een korte (0,03 ms) stimulus over de stimulatie-elektroden te beginnen bij 30 V en oplopend tot 60 V totdat u zich aan een antwoord (dat wil zeggen een spiertrekkingen, en een spiercel depolarisatie zoals waargenomen op de computer monitor). Voor de rest van het experiment, stelt u de spanning 50 tot 10 V boven de respons drempel. </li><li> Voor het meten van respons latentie, het geven van tenminste 5 enkele stimuli met een 5 seconden rust tussen elke stimulus. </li><li> Bepaal het "frequentie van de volgende" door het verstrekken van treinen van stimuli met verschillende snelheden. Typisch 10 treinen van 10 stimuli worden gegeven op 100 Hz (10ms tussen elke stimulus), 200Hz (5ms tussen elke stimulus) en 300Hz (3ms tussen elke stimulus). Laat een rustperiode van 2 seconden tussen elke trein van stimuli. </li></ol> 5. Resultaten: Reactie latencies en frequentie van het volgen van in het Reuzengebergte Fiber Pathway <ol><li> De reactie latency is de tijd tussen stimulatie van de hersenen en depolarisatie van de spier. Dit cijfer vergelijkt de reactie latencies voor DLM en TTM aan een stimulus. Latency tussen de 0,7 en 1,2 ms voor de GF-TTM route en tussen 1,3 en 1,7 ms voor de GF-DLM pad wijzen op een gezonde voorbereiding en een vlot de opname techniek. De latencies kan variëren met genotype, de genetische achtergrond, de temperatuur en leeftijd. Figuur 1 (A en B). Vertegenwoordiger sporen toont de reacties opgenomen van de TTMS en DLMS na een eenmalige prikkel in de hersenen. </li><li> Zoals hier wordt getoond, opnames van de TTM tonen meer variatie in termen van amplitude en vorm van de postsynaptische potentiaal (PSP) in vergelijking met die van de grote DLM vezels; deze verhoogde variabiliteit is te wijten aan de geringe omvang van de TTM spiervezels. Deze variabiliteit is echter geen invloed op de reactie van latency waarden voor de Giant Fiber-to-TTM pad. Figuur 1 (C en D). Verder 'respons latency' sporen uit vier individuele vliegt voor zowel de TTM en DLM. Let op TTM sporen vertonen variatie in vorm, maar PSP reactie latency is onaangetast. Voor de DLM is er minder variatie in PSP vorm. <img src="/files/ftp_upload/2412/2412fig1.jpg" alt="Figuur 1 A-D" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1 A-D"> </li><li> Vergelijk de "frequentie van de volgende" bij 100 Hz, 200 Hz en 300 Hz door het berekenen van het aandeel van de succesvolle reacties (op 10) voor zowel DLM en TTM paden bij elke stimulatie frequentie. Bij 100 Hz, zowel TTM en DLM volg de stimuli 01:01. Bij stimulatie frequenties boven 100 Hz, het DLM reacties start om storingen geven, omdat de tussenpersoon chemische synaps tussen twee interneuronen niet over voldoende tijd om te herstellen tussen de stimuli. De TTM reacties, blijven echter 1:1 met stimuli zelfs verder dan 300Hz. Figuur 2. Vertegenwoordiger sporen met de "frequentie van de volgende" opnamen. Bij 100 Hz, zowel TTMS en DLMS reageren op alle 10 stimuli (links). Bij 200Hz, het DLM reacties beginnen te falen (asterisk). <img src="/files/ftp_upload/2412/2412fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> </li></ol>6. Representatieve resultaten Wild-type een korte latentie reacties (gestimuleerd elektroden worden geplaatst in de ogen, het omzeilen van sensorische receptoren en het activeren van de GF-circuit rechtstreeks) zijn afhankelijk van het genotype, de genetische achtergrond, temperatuur en leeftijd, en variëren tussen 0,7 en 1,2 ms voor de GF-TTM traject en 1.3 and1.7 ms voor de GF-DLM pad (Tanouye en Wyman, 1980; Thomas en Wyman, 1984; Engel en Wu, 1992; Allen en Murphey, 2007; Phelan et al., 2008;. Augustin et al., niet gepubliceerd.) . Deze zeer korte TTM latency is te danken aan de robuuste GF-TTMn elektrochemische synaps van de monosynaptic route en de langere DLM latentie ontstaat als gevolg van de disynaptic aard van de baan alsook door de aanwezigheid van een chemische synaps (PSI-DLMn). Intermediate-en lange-latency reacties (&gt; 3 ms) het gevolg van de activering van de GF afferentia en worden bereikt door het gebruik van een lagere intensiteit stimulatie of het verstrekken van een visueel ("light-off") signaal. Bij 100 Hz zowel TTM en DLM moeten volgen van de stimuli 01:01. Boven de 100 Hz DLM reacties zal beginnen om storingen te zien zijn als de chemische synaps tussen PSI en de DLMns niet over voldoende tijd om te herstellen tussen de stimuli minder dan 10ms uit elkaar. TTM reacties zullen echter blijven 1:1 met stimuli ook buiten 300Hz (Tanouye en Wyman, 1980; Engel en Wu, 1992;. Allen et al., 2007;. Martinez et al., 2007). Mutaties in het shakB gen, dat codeert voor een Drosophila gap junction kanaal ("innexin"), significante toename van de respons latentie van de GF-TTM route (~ 1,5 ms), terwijl de GF-DLM tak is reageert niet (Allen en Murphey, 2007; Phelan et al.., 2008). De mutant reactie kan worden hersteld door het stimuleren van thoracale ganglia direct, waaruit blijkt dat het vertraagde effect niet te wijten is aan verstoord neuromusculaire transmissie. De mogelijkheid om hoge frequentie stimulatie volgen, is ook verminderd in deze mutanten in vergelijking met wild-type vliegt waar de GF-DLM en GF-TTM paden zijn meestal in staat om 10 stimuli te volgen met een verhouding van 1:1 tot 100 Hz en 300 Hz, respectievelijk. Het is belangrijk op te merken dat deze frequenties aanzienlijk boven de normale stimulatie frequenties die door de aanbestedende spieren tijdens de aanhoudende vlucht (3-10 Hz) (Hummon en Costello, 1989). Een andere parameter gebruikt om de stabiliteit van het GFS uitgangen beschrijven is het "refractaire periode", of de minimale tijd tussen twee pulsen prikkel die nog twee reacties produceert uit de spier. De vuurvaste varieert tussen de 1-4 ms voor TTMS en 7-15 ms voor DLMS. De relatief lange refractaire periode voor DLMS is te wijten aan relatief chemische synapsen labiel op de PSI-DLMn kruising (Tanouye en Wyman, 1980; Gorczyca en Hall, 1984; Engel en Wu, 1992; Banerjee et al., 2004;. Allen en Godenschwege, 2010).

<ol><li>Allen, M. J., Godenschwege, T. Electrophysiological Recordings from the Drosophila Giant Fiber System. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAllen%2C+MJ+%22Drosophila+Neurobiology%3A+A+Laboratory+Manual%22">Drosophila Neurobiology: A Laboratory Manual</a>. Zhang, B., Freeman, M. R., Wadde, S. , 1st Lab ed, Cold Spring Harbor Press. (2010).</li>
<li>Allen, M. J., Godenschwege, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+an+escape%3A+development+and+function+of+the+Drosophila+giant+fibre+system%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Making an escape: development and function of the Drosophila giant fibre system.</a> Semin Cell Dev Biol. 17, 31-41 (2006).</li>
<li>Allen, M. J., Murphey, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+component+of+the+mixed+GF-TTMn+synapse+in+Drosophila+melanogaster+uses+acetylcholine+as+its+neurotransmitter%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The chemical component of the mixed GF-TTMn synapse in Drosophila melanogaster uses acetylcholine as its neurotransmitter.</a> Eur J Neurosci. 26, 439-445 (2007).</li>
<li>Banerjee, S., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+flight+and+associated+neuronal+rhythmicity+in+inositol+1%2C4%2C5-trisphosphate+receptor+mutants+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Loss of flight and associated neuronal rhythmicity in inositol 1,4,5-trisphosphate receptor mutants of Drosophila.</a> J Neurosci. 24, 7869-7878 (2004).</li>
<li>Engel, J. E., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+membrane+excitability+mutations+affecting+potassium+and+sodium+currents+in+the+flight+and+giant+fiber+escape+systems+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+A%22%5BJournal%5D)">Interactions of membrane excitability mutations affecting potassium and sodium currents in the flight and giant fiber escape systems of Drosophila.</a> J Comp Physiol A. 171, 93-104 (1992).</li>
<li>Gorczyca, M., Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+cholinergic+synapse+in+the+giant+fiber+pathway+of+Drosophila+using+conditional+mutations+of+acetylcholine+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">Identification of a cholinergic synapse in the giant fiber pathway of Drosophila using conditional mutations of acetylcholine synthesis.</a> J Neurogenet. 1, 289-313 (1984).</li>
<li>Hummon, M. R., Costello, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+fiber+activation+of+flight+muscles+in+Drosophila%3A+asynchrony+in+latency+of+wing+depressor+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Giant fiber activation of flight muscles in Drosophila: asynchrony in latency of wing depressor fibers.</a> J Neurobiol. 20, 593-602 (1989).</li>
<li>Jacobs, K., Todman, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptogenesis+in+the+giant-fibre+system+of+Drosophila%3A+interaction+of+the+giant+fibre+and+its+major+motorneuronal+target%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Synaptogenesis in the giant-fibre system of Drosophila: interaction of the giant fibre and its major motorneuronal target.</a> Development. 127, 5203-5212 (2000).</li>
<li>King, D. G., Wyman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+giant+fibre+pathway+in+Drosophila.+I.+Three+thoracic+components+of+the+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the giant fibre pathway in Drosophila. I. Three thoracic components of the pathway.</a> J Neurocytol. 9, 753-770 (1980).</li>
<li>Martinez, V. G., Javadi, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+changes+in+climbing+behavior+and+neural+circuit+physiology+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Age-related changes in climbing behavior and neural circuit physiology in Drosophila.</a> Dev Neurobiol. 67, 778-791 (2007).</li>
<li>Miller, A. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+A+%22Biology+of+Drosophila%22">Biology of Drosophila</a>. Demerec, M. , 2nd, Hafner. New York. 502-503 (1965).</li>
<li>Phelan, P., Goulding, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+rectification+at+identified+electrical+synapses+in+the+Drosophila+giant+fiber+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of rectification at identified electrical synapses in the Drosophila giant fiber system.</a> Curr Biol. 18, 1955-1960 (2008).</li>
<li>Power, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thoracico-abdominal+nervous+system+of+an+adult+insect%2C+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The thoracico-abdominal nervous system of an adult insect, Drosophila melanogaster.</a> J Comp Neurol. 88, 347-409 (1948).</li>
<li>Tanouye, M. A., Wyman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+outputs+of+giant+nerve+fiber+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Motor outputs of giant nerve fiber in Drosophila.</a> J Neurophysiol. 44, 405-421 (1980).</li>
<li>Thomas, J. B., Wyman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+altering+synaptic+connectivity+between+identified+neurons+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mutations altering synaptic connectivity between identified neurons in Drosophila.</a> J Neurosci. 4, 530-538 (1984).</li>
</ol>

Een van de belangrijkste dingen die men moet letten wanneer het proberen om opnames van hoge kwaliteit te verkrijgen is de juiste richting en de gezondheid van de bereiding. Idealiter zou de vlieg nog in leven zijn op het einde van de opname sessie en reageren op elektrische prikkels. Voor de registrerende elektroden om zo efficiënt mogelijk doordringen in de thoracale exoskelet, moet het vliegen worden vastgelijmd aan het oppervlak op zodanige wijze dat een rechte hoek vormen met de elektroden, indien nodig, het inbrengen van elektroden kan worden vergemakkelijkt door het verwijderen van een deel van de dorsale thoracale nagelriemen met een tungsten scalpel dus het blootstellen van de DLM vlucht spier (deze stap biedt een extra voordeel dat het moeilijker voor de tips van glas elektrodes te breken). Ook moet de zorg worden genomen om te voorkomen dat het indrukken van de elektroden door het subcuticularly gelegen DLMS en TTMS. Het hoofd van de vlieg moet goed worden vastgezet, zodat voor de stimulatie-elektroden goed worden ingebracht in de hersenen en om te voorkomen dat ze getrokken tijdens de opnamesessie. Door zijn grootte en goed beschreven morfologie, de GFS is een van de meest toegankelijke neuronale paden in Drosophila. De doorlaatbaarheid van elektrische synapsen aan kleine moleculaire gewicht tracer kleurstoffen zorgt voor de visualisatie van elektrisch gekoppelde neuronen, en de verschillende beschikbare GAL4 lijnen maken het mogelijk om genexpressie niveau te manipuleren in een subset van cellen of celgroepen (Jacobs et al., 2000;. Allen et al., 2006). In aanvulling op de hierboven genoemde voordelen, zowel afferente en thoracale componenten van het circuit weergave-eigenschappen, zoals gewenning, spontaan herstel en dishabituation, waardoor de Drosophila GFS een handig modelsysteem voor het bestuderen van neuronale plasticiteit (Engel en Wu, 1996).

<table border="1"><tbody><tr><td> NAAM </td><td> BEDRIJF </td><td> CAT. # </td><td> COMMENTAAR </td></tr><tr><td> S48 Square Pulse Stimulator </td><td> Gras Instrumenten </td><td></td><td> http://www.grasstechnologies.com/ </td></tr><tr><td> Stimulatie unit </td><td> Gras Instrumenten </td><td></td><td> http://www.grasstechnologies.com/ </td></tr><tr><td> SIU5 RF-transformator isolatie-eenheid </td><td> Gras Instrumenten </td><td></td><td> http://www.grasstechnologies.com/ </td></tr><tr><td> 5A twee-kanaals intracellulaire micro-elektrode Versterker </td><td> Aan de instrumenten </td><td></td><td> http://www.gettinginstruments.com/ </td></tr><tr><td> Digidata 1440A data-acquisitiesysteem </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> http://www.moleculardevices.com/ </td></tr><tr><td> Analoog-digitale Digidata 1320 en Axoscope 9.0 software </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> http://www.moleculardevices.com/ </td></tr><tr><td> Opname platform met handmatige micromanipulators </td><td> Narishige, Sutter Ins., World Precision Ins. </td><td></td><td> http://narishige-group.com/ http://www.sutter.com/index.html http://www.wpi-europe.com/en/ </td></tr><tr><td> Lichtbron </td><td> Fostec </td><td></td><td> http://www.nuhsbaum.com/FOSTEC.htm </td></tr><tr><td> Wild M5 stereomicroscoop </td><td> Wild Heerbrugg </td><td></td><td> http://www.wild-heerbrugg.com/ </td></tr><tr><td> Trillingsisolatie tafel </td><td> TMC </td><td></td><td> http://www.techmfg.com/ </td></tr><tr><td> Borosilicaat buis voor de micro-elektroden </td><td> Sutter Instrument </td><td></td><td> http://www.sutter.com/index.html </td></tr><tr><td> P-95 Micropipet puller </td><td> Sutter Instrument </td><td></td><td> http://www.sutter.com/index.html </td></tr><tr><td> Microfil 34 meter, 67 mm (elektrode filler) </td><td> Wereld precisie-instrumenten </td><td> MF34G-5 </td><td> http://www.wpi-europe.com/en/ </td></tr><tr><td> Microdissectie tools (tangen, ...) </td><td> Fijn Science Tools </td><td></td><td> www.finescience.com </td></tr><tr><td> Ontleden (stereo) microscoop </td><td> Leica </td><td></td><td> http://www.leica-microsystems.com/ </td></tr><tr><td> Kooi van Faraday </td><td> Onbekende fabrikant </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Andere: kunststof spuiten, wolfraam aardedraad en NaOH-geslepen wolfraamelektroden, KCl, was platform, een PC met monitor ...

elektrofysiologische opnames van de giant fiber pathway van d. melanogaster</em

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

Toen schrok volwassen D. melanogaster reageren door te springen in de lucht en weg te vliegen. In vele ongewervelde diersoorten, waaronder D. melanogaster, de &quot;escape&quot; (of &quot;schrikreactie&quot;) respons tijdens het volwassen stadium wordt gemedieerd door de multi-component neuronale circuit genaamd de Giant Fiber System (GFS). De vergelijkende grote omvang van de neuronen, hun kenmerkende morfologie en eenvoudige connectiviteit maken het GFS een aantrekkelijk model voor het bestuderen van neuronale circuits. Het GFS route is samengesteld uit twee tweezijdig symmetrische Giant Fiber (GF) interneuronen waarvan axonen afdalen van de hersenen over de middellijn in de thoracale ganglion via de baarmoederhals bindweefsel. In de mesothoracic neuromere (T2) van de ventrale ganglia het GFS vorm elektro-chemische synapsen met 1) de grote mediale dendrieten van de ipsilaterale motorneuron (TTMn), die de tergotrochanteral spier drives (TTM), de belangrijkste extensor voor de mesothoracic femur / been , en 2) de contralaterale perifeer synapsing interneuron (PSI), die op hun beurt vormen chemische (cholinerge) synapsen met de motorneurons (DLMns) van de dorsale longitudinale spieren (DLMS), de vleugel depressoren. De neuronale route (s) om de dorsovental spieren (DVMS), de vleugel liften, is nog niet uitgewerkt (de DLMS en DVMS zijn gezamenlijk bekend als indirecte vlucht spieren - ze zijn niet direct op de vleugels, maar zet de vleugels indirect door verstoring van de nabijgelegen thoracale cuticula) (Koning en Wyman, 1980;. Allen et al., 2006). De di-synaptische activatie van de DLMS (via PSI) veroorzaakt een kleine maar belangrijke vertraging in de timing van de contractie van deze spieren ten opzichte van de monosynaptic activering van TTM (~ 0,5 ms) waardoor de TTMS om eerst uit te breiden het femur en de stuwen vliegen van de grond. De TTMS tegelijkertijd stretch-activeren van de DLMS die onderling op zijn beurt de DVMS stretch-activeren voor de duur van de vlucht. De GF pad kan indirect worden geactiveerd door het toepassen van een zintuiglijke (bijvoorbeeld &quot;air-puff&quot; of &quot;lights-off&quot;) stimulus, of rechtstreeks door een supra-drempel elektrische prikkel naar de hersenen (hier beschreven). In beide gevallen, een actiepotentiaal bereikt de TTMS en DLMS uitsluitend via de GFS, aangevers verzorgen, en TTM / DLM motoneuronen, hoewel de TTMns en DLMns wel andere, nog onbekende, zintuiglijke input. Het meten van &quot;latency reactie&quot; (de tijd tussen de stimulatie en spier depolarisatie) en de &quot;volgende te hoge frequentie stimulatie &#39;(het aantal succesvolle antwoorden op een aantal hoge frequentie stimuli) biedt een manier om reproduceerbaar en kwantitatief beoordelen van de functionele status van het GFS onderdelen, waaronder zowel centraal synapsen (GF-TTMn, GF-PSI, PSI-DLMn) en de chemische (glutamaat) neuromusculaire verbindingen (TTMn-TTM en DLMn-DLM). Het is gebruikt om genen die betrokken zijn in het centrum van synapsvorming te identificeren en om CZS functioneren te beoordelen.

De Giant Fiber System is een eenvoudige neuronale circuit van de volwassen<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Met de grootste neuronen in de vlieg. We beschrijven het protocol voor de controle synaptische transmissie via deze route door het opnemen van posten synaptische potentialen in dorsale longitudinaal (DLM) en tergotrochanteral (TTM) spieren na directe stimulatie van de Giant Fiber interneuronen.

Elektrofysiologische opnames van de Giant Fiber Pathway van D. melanogaster</em

Wanneer ze schrikken, reageren volwassen D. melanogaster door in de lucht te springen en weg te vliegen. Bij veel ongewervelde diersoorten, waaronder D. melanogaster, is de 'vlucht' ...

Het algemene doel van deze procedure is om de synaptische transmissie via het giant fiber-pad te monitoren door postsynaptische potentialen vast te leggen van een dorsale longitudinale spier (DLM) en van een Togo tro cantoral spier (TTM) na directe stimulatie van de giant fiber in neuronen. Dit wordt bereikt door eerst een geanestheseerde vlieg correct te fixeren in een schaaltje met een klodder was. De volgende stap van de procedure is het inbrengen van stimulerende-, aardings- en registratie-elektroden in de vlieg.De laatste stap van de procedure is het stimuleren van de hersenen en het registreren van de reacties van de spring- en vliegspieren. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die veranderingen in de functionele eigenschappen van het reuzelvezelpad laten zien als functie van genotype, leeftijd, temperatuur, enzovoort. Dit gebeurt door de tijd tussen de stimulus en de respons te registreren en door het aantal succesvolle responsen na een reeks hoogfrequente stimuli te tellen.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van enkele kernvragen binnen het veld van de neurofysiologie en kan worden gebruikt om de functionele eigenschappen van neuronale paden te onderzoeken. Deze techniek kan worden ingezet, ofwel als een inleidend experiment dat wordt gevolgd door genetische of moleculaire analyse, ofwel als een manier om fysiologische en functionele eigenschappen te beoordelen bij dieren met een bekende mutatie. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel.Omdat de voorbereidings- en impairmentstappen enige tijd vergen om te leren en vliegen relatief klein zijn, is een zeker niveau van stabiliteit en coördinatie vereist voordat experimenten correct kunnen worden uitgevoerd. Deze experimenten maken gebruik van een standaard electrofysiologische opstelling bestaande uit een stimulator, een stimulus-isolatie-unit, twee micro-elektrodeversterkers, een gegevensacquisitiesysteem en een computer met verzamelsoftware.Aanvullende apparatuur omvat een kooi van Faraday, een stereomicroscoop op een zwenkarmstatief, een trillingsisolatietafel, een lichtbron en een registratieplatform. Er worden vijf micromanipulatoren gebruikt. Twee micromanipulatoren vereisen fijne bediening voor het positioneren van de registratie-elektroden, terwijl de andere drie micromanipulatoren slechts grove bediening vereisen.Om de twee stimulatie-elektroden en de maaselektrode te positioneren, wordt de manipulator voor de DLM-registratie-elektrode aan het uiteinde van de staart van het preparaat geplaatst. De micromanipulator voor de TTM-registratie-elektrode wordt tussen de experimentator en de zijkant van het preparaat geplaatst. De twee micromanipulatoren voor de stimulatie-elektroden worden aan de kopzijde van het preparaat geplaatst.De micromanipulator voor de grounding-elektrode wordt aan de verre zijde van het preparaat geplaatst. Trek glazen registratie-micro-elektroden met weerstanden van 40 tot 60 mega ohm en bewaar deze plat in een schaal ondersteund door was. Gebruik twee elektromagnetisch geslepen wolfraamelektroden voor stimulatie.Gebruik een stamdraad of een derde elektromagnetisch gefabriceerde elektrode. Bevestig de stimulerende en grounding-elektroden vóór aanvang van de experimentele sessie als aarde aan de micromanipulators. Deze hoeven gedurende de sessie niet te worden vervangen.Zodra uw apparatuur is opgesteld, is het tijd om de vliegen voor te bereiden. Anestheseer de vliegen door ze 10 tot 15 minuten op ijs te koelen. Gebruik een pincet om de vlieg voorzichtig bij de poten over te brengen naar een schaal met een platform van zachte was dat onder een hoek van ongeveer 45 graden staat.De volgende stap is het vastzetten van de vlieg in de was. Positioneer de vlieg met de ventrale zijde naar beneden en de anteriorzijde naar boven gericht op de helling. Gebruik een fijne pincet om de poten paargewijs naar buiten te spreiden en ze in de was te drukken.Zodra u bekend bent met de locatie van de spieren die tijdens dit experiment geregistreerd moeten worden, de dorsale longitudinale spier of DLM en de transversale thoracale spier of TTM, komen de subcuticulaire aanhechtingsplaatsen van de DLM's overeen met het gebied tussen de thoracale middellijn en de anterieure dorsale borstels. De aanhechtingsplaatsen van de TTM bevinden zich dorsaal van de posterieure en anterieure supra-alaire borstels; zorg ervoor dat de vleugels de toegang tot de DLM- of TTM-vezels niet belemmeren door de vleugels naar buiten te houden en ze met was vast te lijmen. Trek met een fijne pincet de PSI voorzichtig naar buiten en zet deze vast door deze in de was te dompelen.Dit is een kritische stap die enige oefening vereist, aangezien de proboscis zacht is en gemakkelijk losraakt van de rest van de kop. Als dat gebeurt, gooi de vlieg dan weg en begin opnieuw. Als de kop niet op deze manier wordt vastgezet, ontstaan er problemen bij het inbrengen van de stimulerende elektroden via de ogen.Zodra de vlieg aan de was is bevestigd, wordt de preparatie onder het stereomicroscoop in de kooi van Faraday geplaatst; oriënteer de vlieg zijwaarts, met de kop van de vlieg rechts van de experimentator. De volgende stap is het inbrengen van de elektroden. Breng de elektroden met behulp van de micromanipulators dicht bij de insertieplaatsen om een juiste plaatsing en daaropvolgende registraties te vergemakkelijken. Breng vervolgens, zonder door het oculair te kijken, de grounding-elektrode in het achterste uiteinde van het abdomen door de stelschroeven van de micromanipulator te gebruiken, om de aangescherpte wolfraam-stimulatie-elektroden in de hersenen te plaatsen.Gebruik de micromanipulator om de punt van een van de elektroden zo te positioneren dat deze net een van de ogen van de vlieg raakt. Doe hetzelfde met de andere elektrode, zodat beide elektroden net de buitenkant van elk oog raken. Duw vervolgens de elektroden naar binnen.Draai door elk oog ongeveer twee tot drie millimeter, zodat de punten van de elektroden het brein bereiken dat zich aan de achterzijde van de kopcapsule bevindt. Correct geplaatste elektroden zullen het reuzenervezelsysteem activeren om te controleren of de stimulerende elektroden juist zijn geplaatst. Dien een korte stimulus van 30 tot 60 volt toe via de stimulerende elektroden en let op bewegingen van de vleugels en trekkingen van de vlieg- of pootspieren.De volgende stap is het vullen van de glazen micro-elektroden met drie molair kaliumchloride met behulp van een Hamilton-spuit of een hitte-getrokken plastic spuit, en het plaatsen hiervan in de fijnregeling-micromanipulatoren. Correct geplaatste micro-elektroden kunnen voor meerdere experimentele rondes worden gebruikt. De eerste registreerelektrode wordt ingebracht in een DLM-vezel.Er zijn twee bilateraal symmetrische dlms. Elke dlm is opgebouwd uit zes individuele spiervezels. De opnames kunnen bij elke van de zes vezels worden uitgevoerd, maar de meest gebruikte zijn de DLM-vezels 45 A en 45 B, vanwege hun goede toegankelijkheid via de dorsale zijde van het thoracale cuticula en het feit dat beide vezels worden geïnnerveerd door hetzelfde motorneuron.Gebruik de micromanipulator die aan de staart van de preparatiehouder is geplaatst om de registreerelektrode in DLM-vezel 45 A of B in te brengen aan de zijde van de vlieg die het verst weg ligt. De helling van het platform maakt het mogelijk dat de DLM-elektrode de dorsale cuticula onder een hoek van 60 tot 90 graden binnendringt, wat de penetratie vergemakkelijkt door de software in oscilloscoopmodus te gebruiken. Kijk naar het computermonitor terwijl de registreerelektrode in de thorax wordt ingebracht.Wanneer de elektrode een spier is binnengedrongen, daalt de basislijn naar een waarde nabij nul of een negatieve waarde; test dit met een enkele stimulus om te zien of de spierrespons waarneembaar is. Plaats de andere registreerelektrode in de TTM aan de zijde van de vlieg die het dichtst bij u bevindt. Deze elektrode wordt lateraal voor u ingebracht vanwege de locatie van de spieraanhechtingsplaats.Houd tijdens deze handeling opnieuw de monitor in de gaten. Zodra het spoor aangeeft dat de elektrode zich in de spier bevindt, wordt er een enkele stimulus gegeven om een spierrespons op te wekken. Om te beginnen met het stimuleren van de hersenen en het registreren van responsen van de poot- en vliegspieren, wordt een stimulus van 0,03 milliseconde via de stimulerende elektroden aangelegd, beginnend bij 30 volt en toenemend tot 60 volt, totdat er een spiertrekking en een depolarisatie van de spiercel op de computermonitor waarneembaar zijn.Stel voor de rest van het experiment de spanning in op vijf tot 10 volt boven de responsdrempel. Om de responstijd te meten, worden er minimaal vijf enkelvoudige stimuli gegeven met een rustperiode van vijf seconden tussen elke stimulus.Bepaal de frequentie van de respons door stimuli-treinen aan te bieden met verschillende snelheden. Doorgaans worden 10 treinen van 10 stimuli gegeven bij 100 hertz, 200 hertz en 300 hertz, waarbij een rustperiode van twee seconden tussen elke stimuli-trein wordt gehanteerd. Deze figuur toont de responsen die zijn geregistreerd vanuit de TTM's en dlms na een enkele stimulus aan het brein.De responstijd is de tijd tussen de stimulatie van de hersenen en de depolarisatie van de spier. Een gezonde preparatie en een correcte registratietechniek worden gekenmerkt door latenties tussen 0,7 en 1,2 milliseconden voor het G-F-T-T-M-pad en tussen 1,2 en 1,7 milliseconden voor het GF DLM-pad. De latenties kunnen variëren afhankelijk van het genotype, de genetische achtergrond, de temperatuur en de leeftijd, zoals hier wordt getoond.Opnames van de TTM vertonen meer variabiliteit wat betreft de amplitude en vorm van het postsynaptische potentieel in vergelijking met die van de grote DLM-vezels. Deze toegenomen variabiliteit is te wijten aan de kleine omvang van de TTM-spiervezels. Deze variabiliteit heeft echter geen invloed op de responstijden voor het pad van de reuzenvezel naar de TTM.Deze figuur toont TTM- en DLM-stimulatie bij 100 hertz en 200 hertz. Zowel de TTM's als de DLM's reageren op alle 10 stimuli bij 200 hertz. De TTM-responsen blijven één-op-één, maar de DLM-responsen beginnen uit te vallen.De reden dat de DLM bij stimulatiefrequenties boven de 100 hertz niet meer volgt, is dat de tussenliggende chemische synaps tussen twee interneuronen onvoldoende tijd heeft om te herstellen tussen stimuli. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in ongeveer 30 minuten worden uitgevoerd. Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht in hoe neurotransmissie via het reuzelvezelpad kan worden gemonitord.Dit wordt gedaan door de reuzenvezel naar neuronen in de hersenen te stimuleren en vervolgens registraties te verrichten bij een springspier en vliegspieren in de thorax.

electrophysiological-recordings-from-giant-fiber-pathway-d

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Hier beschrijven we elektrofysiologische methoden voor het meten van synaptische transmissie bij de neuromusculaire junctie van Drosophila larve. Evoked release wordt kunstmatig geïnitieerd door het stimuleren van de motorische neuron axonen, en de transmissie door middel van de NMJ kan worden gemeten door de postsynaptische respons opgeroepen in de spier.

Elektrofysiologische methoden voor opname Synaptic Potentials van de NMJ van Drosophila Larven

Elektrofysiologische opname in de Drosophila Embryo

Hele Mount Voorbereiding van de Adult Drosophila Ventraal Nerve Fiber Koord voor Giant Dye Injectie

Gekoppelde Nanoinjection en Elektrofysiologie test voor het screenen op bioactiviteit van verbindingen met behulp van de Drosophila melanogaster Giant Fiber System

The video demonstrates the extracellular recording of neuronal activity from the central nervous system (CNS) of Drosophila larvae. The transected CNS is positioned in a recording chamber, and the electrical activity from a descending nerve is recorded to establish the baseline firing frequency. A test agent is then introduced, and the change in firing frequency is recorded to determine the agent's excitatory or inhibitory effect.

Extracellular Recording of Electrical Activity in the Drosophila Central Nervous System

Dit protocol beschrijft extracellulaire van de actiepotentiaal reacties afgevuurd door labellar smaak neuronen in Drosophila.

Elektrofysiologische Opnemen vanaf<em&gt; Drosophila</em&gt; Labellar Proef sensilla

Scherpe micro-elektroden maken nauwkeurige elektrofysiologische karakterisering van fotoreceptor en visuele interneuron-output in levende Drosophila mogelijk. Hier laten we zien hoe je deze methode kunt gebruiken om hoogwaardige spanningsresponsen van individuele cellen op gecontroleerde lichtstimulatie op te nemen. Deze methode is ideaal voor het bestuderen van neurale informatieverwerking in samengestelde ogen van insecten.

Elektrofysiologische Methode voor opname intracellulaire Voltage Reacties van<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotoreceptoren en Interneurons naar Light Stimuli<em&gt; In Vivo</em

Whole-cell opnames van Drosophila melanogaster fotoreceptoren maken het mogelijk om spontaan donkere stoten, kwantumstoten, macroscopische reacties op licht en spanningsrelaties onder verschillende omstandigheden te meten. In combinatie met D. melanogaster genetische manipulatie instrumenten, deze methode maakt het mogelijk om de alomtegenwoordige inositol-lipide signalering weg en zijn doel, het TRP kanaal te onderzoeken.

Elektrofysiologische methode voor opname van volledige spanningsklemmen van<em&gt; Drosophila</em&gt; Photoreceptors

Synaptic stromingen kunnen focally worden opgenomen van de gevisualiseerde synaptic los op de Drosophila derde instar larven motorische eindplaat. Deze techniek maakt het mogelijk de activiteiten van een enkele synaptic bouton worden gecontroleerd.

Focal Macropatch opnames van Synaptic stromingen uit de larvale Drosophila motorische eindplaat

Dit protocol beschrijft een methode om vast te leggen van de aflopende elektrische activiteit van het centrale zenuwstelsel van Drosophila melanogaster zodat de kosten-efficiënte en handige testen van farmacologische agenten, genetische mutaties van neurale eiwitten, en/of de rol van onontgonnen fysiologische trajecten.

Elektrofysiologische opname van de activiteit van het centrale zenuwstelsel van derde-Instar Drosophila Melanogaster

Dit protocol demonstreert de lasercelablatie van individuele neuronen in intacte Drosophila-larven . De methode maakt het mogelijk om het effect te bestuderen van het verminderen van competitie tussen neuronen in het zich ontwikkelende zenuwstelsel.

Lasercelablatie in intacte Drosophila-larven onthult synaptische competitie

Leer elektrofysiologische opnames van synaptische transmissie in het Giant Fiber System van Drosophila melanogaster. Deze methode registreert post-synaptische potentialen in DLM- en TTM-spieren om neuronale circuits te bestuderen.

Elektrofysiologische opnames van de Giant Fiber Pathway van D. melanogaster

Meer video's verkennen