Kwantitatieve meting van GLUT4 translocatie naar de plasmamembraan door middel van flowcytometrie

Het algemene doel van deze procedure is om de translocatie van GLUT4 naar het plasmamembraan van zoogdiercellen te detecteren in reactie op blootstelling aan insuline. Serumuitgehongerde myoblasten, die alleen intravesiculair GLUT4-eiwit bevatten, worden eerst uitgeplaat in een 24-wells kweekschaal. Een antilichaam tegen een extern epitope van GLUT4, gepreïncubeerd met een fluor-geconjugeerd secundair antilichaam, wordt vervolgens aan de cellen toegevoegd, gevolgd door insuline.

Activering van de insulinereceptoren aan het celoppervlak resulteert in de translocatie van GLUT4 naar het oppervlak van het plasmamembraan. GLUT4 wordt vervolgens herkend door antilichamen in het medium. Op dit punt kunnen de cellen gefixeerd worden en kan de intensiteit van de fluorescente kleuring worden gemeten met flowcytometrie.

Deze methode kan worden gebruikt om ggl four translocatie en glucosemetabolisme te bestuderen, maar kan ook worden toegepast op andere systemen, zoals NK-celdegranulatie via de blootstelling van CD 1 0 7 A aan het membraan. Voor deze procedure is het belangrijk om cellen te gebruiken die actief groeien of 60 tot 80% confluent zijn en gedurende de nacht serumvrij zijn gehouden. Nadat de cellen met trypsine zijn geoogst, moeten ze worden gewassen en geresuspendeerd in regulier groeimedium bij 200.000 cellen per milliliter; breng de cellen in een 24-wells plaat aan bij 0,1 miljoen per 500 µL per well. Incubeer de cellen vervolgens gedurende één uur bij 37 °C om de cellen te laten herstellen van de trypsinisatie.

Meng ondertussen het primaire anti-glute four-antilichaam en het Alexa Fluor 4 8 8-geconjugeerde secundaire chicken antigo IgG-antilichaam in een verhouding van vijf op één; bereken het benodigde eindvolume, rekening houdend met het feit dat er 10 µL van het antilichaammengsel per putje wordt gebruikt. Incubeer het antilichaammengsel gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Bereid tijdens de incubatie van het antilichaammengsel een twee keer geconcentreerde werkvoorraad insuline voor door dit te verdunnen tot de gewenste concentratie in groeimedium.

Zodra de cellen één uur hebben geïncubeerd, worden ze uit de incubator gehaald. Voeg voorzichtig 10 µL antilichaamoplossing toe aan elke put met cellen. Zorg ervoor dat ten minste één put ongekleurd blijft.

Deze negatieve controle wordt later gebruikt om de flowcytometer in te stellen. Voeg vervolgens 500 µL van de twee keer geconcentreerde insulinstamoplossing toe aan elke put om de translocatie van GLUT4 naar het celoppervlak te triggeren en incubeer de plaat gedurende 30 minuten bij 37 °C in het donker. Fixeer de cellen na het uitnemen uit de incubator door één mL PBS 1% PFA aan elke put toe te voegen en incubeer de plaat gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Detacheer de gefixeerde cellen voorzichtig met een cellifter van de bodem van de putten en breng ze vanuit elke put over naar een individuele FACS-buis.

Centrifugeer de buisjes om de cellen te pelletteren, vortex vervolgens en resuspendeer ze in één milliliter PBS om de cellen te wassen en opnieuw te centrifugeren; herhaal deze wasstap tweemaal. Verwijder het supernatant tussen de wasbeurten.

Resuspendeer tenslotte de gewassen cellen in 400 µL PBS 1% PFA. De cellen kunnen nu in de flowcytometer worden geanalyseerd op oppervlakte-expressie van glute four. Zodra u met uw monsters bij de flowcytometer bent aangekomen, begint u met het verzamelen van gegevens van de ongesteinde controle.

Definieer een brede gate voor levende cellen op basis van de parameters voor forward scatter en side scatter. Pas vervolgens de voltagesetting voor het FL1-kanaal aan, zodat de negatieve piek binnen de marges van het histogram zichtbaar is. Zodra deze parameters zijn ingesteld, wordt elk experimenteel monster gemeten waarbij ten minste 10.000 levende events per buis worden geregistreerd.

Dit histogram laat de upregulatie zien van GLUT4-kleuring op het oppervlak van myoblasten die zijn blootgesteld aan 0, 1, 10 of 100 nanomolair insuline. In contrast hiermee slagen myoblasten van individuen met insulineresistentie er niet in om GLUT4 op te reguleren in reactie op 100 nanomolair insuline. Als de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van gestimuleerde cellen wordt genormaliseerd ten opzichte van die van ongestimuleerde cellen, is het mogelijk om de MFI's van gezonde en insulineresistente myoblasten direct te vergelijken.

Met deze procedure kunnen cellen worden gekleurd voor aanvullende oppervlakte- of intracellulaire markers om verschillende celpopulaties in gemengde populaties te identificeren.