Name: Kwantitatieve meting van GLUT4 translocatie naar de plasmamembraan door middel van flowcytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 39 s
Description: Leer hoe u GLUT4-translocatie naar de plasmamembraan kwantificeert met flowcytometrie in myoblasten. Deze methode meet insuline-afhankelijke glucose-transporter-dynamica voor metabool onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de mevrouw Clifford Elder White Graham Bijzonder Onderzoeksfonds en het NIH (AR059838) naar CB, van de NIH (AR052791, AR044387-ARRA, &amp; NS063298) om LTT, en door het Baylor College of Medicine Cytometry en Cell Sorting Core met financiële steun van de NIH (NCRR S10RR024574, NIAID AI036211, en NCI P30CA125123). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de NIH.

1. Cel kleuring <ol><li> Bereid de cellen. De cellen moeten worden gebruikt terwijl nog steeds actief aan de groei (60 - 80% confluentie). Serum 's nachts verhongeren van de cellen, plaat ze cellen op 0,1 miljoen per putje in 0,5 ml serum-vrij medium in een 24-well plaat en plaats in de incubator (37 ° C, 5% CO 2) gedurende 30 min. - 2 uur om te herstellen van trypsine. </li><li> Meng de primaire en secundaire antilichamen. Mix (5 ul van de primaire anti-GLUT4 antilichaam met een ui secundaire kip anti-geit IgG antilichaam geconjugeerd aan AlexaFluor 488) x aantal putten. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker. </li><li> Maak een 2X werkvoorraad van insuline door verdunning van het in medium. </li><li> Controleer of de cellen zijn toegetreden of niet. </li><li> Voorzichtig toe te voegen 6 pi antilichaam mix en 0,5 ml van uw 2X werkvoorraad van insuline om de putjes die de cellen. Vermijd turbulentie van het medium. Incubeer (37 ° C, 5% CO 2) gedurende 30 minuten, in het donker. </li><li> Fixeer de cellen door het toevoegen van 0,5 ml PBS + 1% PFA aan elk putje, zonder dat het schudden van de cellen. Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in het donker. </li><li> Als uw cellen gehandeld op grond van de putten, til ze met een cel lifter. Breng de cellen (1 ml totaal) in buizen die passen in uw flowcytometer en centrifuge aan pellet de cellen. </li><li> Was de pellet tweemaal met 1 ml PBS en resuspendeer in 0,4 ml PBS + 1% PFA. Op dit punt, cellen kunnen worden verpakt in folie en opgeslagen in de koelkast (4-8 ° C) of naar de flowcytometer voor directe data-acquisitie. </li></ol> 2. Data Acquisition <ol><li> Stel een brede hek rondom de levende cellen in de zijwaartse verstrooiing (SSC) versus voorwaartse verstrooiing (FCS) paneel. Gebruik een negatieve buis (cellen die niet behandeld met insuline of cellen "gekleurd" met een isotype controle) om uw FL1 parameter in te stellen. Zorg ervoor dat uw piek is volledig in het paneel, niet bezuinigen op de onderkant. </li><li> Te verwerven gegevens van ten minste 10.000 cellen per buis. </li></ol> 3. Data Analysis <ol><li> Teken een hek rondom het levende cellen in het SSC vs FSC-paneel (zie figuur 1A). Plot de histogrammen van AlexaFluor 488 fluorescentie-intensiteit ten opzichte van het aantal cellen in de live-cell gate (Figuur 1B). U kunt de overlay verschillende histogrammen om de verschillen te visualiseren, maar voor kwantificering, het gemiddelde en mediaan fluorescentie-intensiteit te bepalen voor elke cel populatie en het gebruik van deze nummers voor uw vergelijkingen (Figuur 1C). </li><li> Normaliseren van de gegevens om de waarde verkregen in de afwezigheid van insuline, zoals weergegeven in figuur 1C en 1D. </li></ol> 4. Representatieve resultaten In myoblasten geïsoleerd van een gezonde persoon (geen insuline resistentie), insuline induceert een dosis-afhankelijke translocatie van GLUT4 van het cytoplasma naar het plasmamembraan (Figuur 1, links). In tegenstelling, is insuline geen inductie van GLUT4 translocatie naar de plasmamembraan van myoblasten geïsoleerd uit een patiënt met insulineresistentie (Figuur 1, rechts). <img src="/files/ftp_upload/2429/2429fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Voorbeeld van een kleuring experiment. Myoblasten werden geïsoleerd uit een donor zonder insulineresistentie (links) en van een patiënt met insulineresistentie (rechts). A, SSC (zijwaartse verstrooiing) versus FCS (forward scatter) grond met een hek rondom het levende cellen. B, Cellen in gated A, gekleurd met het antilichaam tegen een externe epitoop van GLUT4, en links ongestimuleerde (rood) of gestimuleerd met insuline 1 nM (blauw), 10 nM (oranje), of 100 nM (groen). Voor de figuur duidelijkheid, we geven alleen gegevens zonder en met 100 nM insuline voor de cellen met insulineresistentie. C, fluorescentie-intensiteiten (MFI) van de histogrammen weergegeven in B werden genormaliseerd tot de MFI van de cellen links ongestimuleerde (geen insuline) Mean. D, Plots van de genormaliseerde MFI gegevens van de histogrammen weergegeven in B.

<ol><li>Zhao, F. Q., Keating, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+properties+and+genomics+of+glucose+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Functional properties and genomics of glucose transporters.</a> Curr. Genomics. 8, 113-128 (2007).</li>
<li>Karnieli, E., Armoni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+the+insulin-responsive+glucose+transporter+GLUT4+gene%3A+from+physiology+to+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of the insulin-responsive glucose transporter GLUT4 gene: from physiology to pathology.</a> Am. J. Endocrinol. Metab. 295, 38-45 (2008).</li>
<li>Graham, T. E., Kahn, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+alterations+of+glucose+transport+and+molecular+mechanisms+of+intertissue+communication+in+obesity+and+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Horm.+Metab.+Res%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific alterations of glucose transport and molecular mechanisms of intertissue communication in obesity and type 2 diabetes.</a> Horm. Metab. Res. 39, 717-721 (2007).</li>
<li>Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD107a+as+a+functional+marker+for+the+identification+of+natural+killer+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity.</a> J. Immunol. Methods. 294, 15-22 (2004).</li>
<li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutellingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labeled+Annexin+V%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V.</a> J. Immunol. Methods. 184, 39-51 (1995).</li>
<li>Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+analysis+in+flow+cytometry%3A+the+future+just+started%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Data analysis in flow cytometry: the future just started.</a> Cytometry A. 77, 705-713 (2010).</li>
</ol>

We hebben aangetoond dat een snelle techniek voor het kwantificeren van de translocatie van GLUT4 van het cytoplasma naar de plasmamembraan van de cellen door flowcytometrie. GLUT4 is slechts tijdelijk tot uitdrukking in de plasmamembraan van cellen en is endocytosed. Omdat de gebonden antilichamen gehecht blijven aan de GLUT4, zelfs tijdens endocytose, de fluorescentie-signaal geeft de totale hoeveelheid GLUT4, dat was bij de plasmamembraan blootgesteld tijdens de gekozen duur van de incubatie in de aanwezigheid van insuline. Deze techniek kan ook toegepast worden op het bestuderen van de translocatie van andere eiwitten uit een intracellulaire compartiment van de plasmamembraan, mits een goede antilichaam gericht op een externe epitoop van het eiwit van belang is beschikbaar. Bijvoorbeeld, is een soortgelijke test nu vaak gebruikt om de snelheid van degranulatie van cytotoxische T-lymfocyten en natural killer lymfocyten te beoordelen door het meten van de translocatie van CD107a om hun plasmamembraan 4,5. De translocatie van fosfatidylserine vanaf de binnenzijde van de plasma membraan naar de buitenzijde tijdens cel apoptose of necrose kan ook worden gedetecteerd door middel van flowcytometrie, met behulp van fluorofoor-gelabeld annexine V 6. Naast snelheid van de test, flow cytometrie presenteert het voordeel dat de studie van proteïne translocatie naar de plasmamembraan in gemengde celpopulaties. Inderdaad, kan men combineren kleuring voor cel subset markers en voor het eiwit van belang, gevolgd door de data-acquisitie op een multi-laser flowcytometer 7. De bedragen van antilichamen in paragraaf 1.2 van het protocol zijn een uitgangspunt, raden wij u aan uw antistoffen titreer met je cellen van belang zijn voor de minimum antilichaamconcentratie dat geeft je een maximale signaal te bepalen. Een goed uitgangspunt bereik van de primaire anti-humane antilichaam GLUT4 we hier hebben gebruikt zou 10 tot 10 pi per buis (dat wil zeggen 0,2-2 ug antilichaam per tube), elke buis met niet meer dan 1 miljoen cellen zijn. Voor andere primaire antilichamen, de instructies van de leverancier. Normalisatie van gegevens is noodzakelijk als autofluorescentie van de cellen zal variëren van donor tot donor en van experiment om te experimenteren.

<table><tbody><tr><td>Anti-humane GLUT4-antilichamen</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-1606</td><td>Tegen een extern epitoop van GLUT4</td></tr><tr><td>Kippen anti-geit IgG geconjugeerd aan AlexaFluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21467</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant humaan insuline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2643</td><td></td></tr><tr><td>Celophaalbjes</td><td>VWR international</td><td>29942-118</td><td>Op maat gesneden voor de wells</td></tr><tr><td>5 ml buisjes voor FACS</td><td>VWR international</td><td>60819-138</td><td>Geschikt voor alle BD-apparaten</td></tr></tbody></table>

kwantitatieve meting van glut4 translocatie naar de plasmamembraan door middel van flowcytometrie

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is de belangrijkste bron van energie voor het lichaam, waarvoor een constante regulatie van de bloedconcentratie. De afgifte van insuline door de alvleesklier veroorzaakt glucose-opname door insuline-gevoelige weefsels, met name de hersenen, skeletspieren, en adipocyten. Patiënten die lijden aan type-2 diabetes en / of obesitas ontwikkelen vaak insulineresistentie en niet in staat zijn om hun glucose-homeostase te controleren. Nieuwe inzichten in de mechanismen van insulineresistentie kunnen voorzien in nieuwe behandelingsstrategieën voor type-2 diabetes. De GLUT familie van glucose transporters bestaat uit dertien leden verdeeld over de verschillende weefsels in het hele lichaam een. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is de belangrijkste vervoerder dat bemiddelt glucose-opname door insuline gevoelige weefsels, zoals de skeletspieren. Na binding van insuline aan zijn receptor, blaasjes waarin GLUT4 uit het cytoplasma transloceren naar de plasmamembraan, het induceren van de opname van glucose. Verminderde GLUT4 translocatie is een van de oorzaken van insulineresistentie bij type-2 diabetes 2,3. De translocatie van GLUT4 van het cytoplasma naar de plasma membraan kan worden gevisualiseerd door middel van immunocytochemie, met behulp van fluorofoor-geconjugeerd GLUT4-specifieke antilichamen. Hier beschrijven we een techniek om de totale hoeveelheid GLUT4 translocatie kwantificeren van de plasmamembraan van de cellen tijdens een gekozen duur, met behulp van flow cytometrie. Dit protocol is snel (minder dan 4 uur, inclusief incubatie met insuline) en laat de analyse van zo weinig als 3000 cellen of zo veel als 1 miljoen cellen per aandoening in een enkel experiment. Zij beroept zich op anti-GLUT4 antilichamen die zijn gericht op een externe epitoop van de vervoerder die zich binden aan het zo snel als het is blootgesteld aan de extracellulaire medium na translocatie naar de plasmamembraan.

Dit protocol beschrijft een snelle techniek om de translocatie van GLUT4 kwantificeren van het cytoplasma naar de plasmamembraan van de cellen door flowcytometrie.

Kwantitatieve meting van GLUT4 translocatie naar de plasmamembraan door middel van flowcytometrie

Glucose is de belangrijkste energiebron voor het lichaam, waarbij een constante regulatie van de bloedconcentratie noodzakelijk is. Insulineruise vanuit de pancreas induceert ...

Het algemene doel van deze procedure is om de translocatie van GLUT4 naar het plasmamembraan van zoogdiercellen te detecteren in reactie op blootstelling aan insuline. Serumuitgehongerde myoblasten, die alleen intravesiculair GLUT4-eiwit bevatten, worden eerst uitgeplaat in een 24-wells kweekschaal. Een antilichaam tegen een extern epitope van GLUT4, gepreïncubeerd met een fluor-geconjugeerd secundair antilichaam, wordt vervolgens aan de cellen toegevoegd, gevolgd door insuline.Activering van de insulinereceptoren aan het celoppervlak resulteert in de translocatie van GLUT4 naar het oppervlak van het plasmamembraan. GLUT4 wordt vervolgens herkend door antilichamen in het medium. Op dit punt kunnen de cellen gefixeerd worden en kan de intensiteit van de fluorescente kleuring worden gemeten met flowcytometrie.Deze methode kan worden gebruikt om ggl four translocatie en glucosemetabolisme te bestuderen, maar kan ook worden toegepast op andere systemen, zoals NK-celdegranulatie via de blootstelling van CD 1 0 7 A aan het membraan. Voor deze procedure is het belangrijk om cellen te gebruiken die actief groeien of 60 tot 80% confluent zijn en gedurende de nacht serumvrij zijn gehouden. Nadat de cellen met trypsine zijn geoogst, moeten ze worden gewassen en geresuspendeerd in regulier groeimedium bij 200.000 cellen per milliliter; breng de cellen in een 24-wells plaat aan bij 0,1 miljoen per 500 µL per well. Incubeer de cellen vervolgens gedurende één uur bij 37 °C om de cellen te laten herstellen van de trypsinisatie.Meng ondertussen het primaire anti-glute four-antilichaam en het Alexa Fluor 4 8 8-geconjugeerde secundaire chicken antigo IgG-antilichaam in een verhouding van vijf op één; bereken het benodigde eindvolume, rekening houdend met het feit dat er 10 µL van het antilichaammengsel per putje wordt gebruikt. Incubeer het antilichaammengsel gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Bereid tijdens de incubatie van het antilichaammengsel een twee keer geconcentreerde werkvoorraad insuline voor door dit te verdunnen tot de gewenste concentratie in groeimedium.Zodra de cellen één uur hebben geïncubeerd, worden ze uit de incubator gehaald. Voeg voorzichtig 10 µL antilichaamoplossing toe aan elke put met cellen. Zorg ervoor dat ten minste één put ongekleurd blijft.Deze negatieve controle wordt later gebruikt om de flowcytometer in te stellen. Voeg vervolgens 500 µL van de twee keer geconcentreerde insulinstamoplossing toe aan elke put om de translocatie van GLUT4 naar het celoppervlak te triggeren en incubeer de plaat gedurende 30 minuten bij 37 °C in het donker. Fixeer de cellen na het uitnemen uit de incubator door één mL PBS 1% PFA aan elke put toe te voegen en incubeer de plaat gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Detacheer de gefixeerde cellen voorzichtig met een cellifter van de bodem van de putten en breng ze vanuit elke put over naar een individuele FACS-buis.Centrifugeer de buisjes om de cellen te pelletteren, vortex vervolgens en resuspendeer ze in één milliliter PBS om de cellen te wassen en opnieuw te centrifugeren; herhaal deze wasstap tweemaal. Verwijder het supernatant tussen de wasbeurten.Resuspendeer tenslotte de gewassen cellen in 400 µL PBS 1% PFA. De cellen kunnen nu in de flowcytometer worden geanalyseerd op oppervlakte-expressie van glute four. Zodra u met uw monsters bij de flowcytometer bent aangekomen, begint u met het verzamelen van gegevens van de ongesteinde controle.Definieer een brede gate voor levende cellen op basis van de parameters voor forward scatter en side scatter. Pas vervolgens de voltagesetting voor het FL1-kanaal aan, zodat de negatieve piek binnen de marges van het histogram zichtbaar is. Zodra deze parameters zijn ingesteld, wordt elk experimenteel monster gemeten waarbij ten minste 10.000 levende events per buis worden geregistreerd.Dit histogram laat de upregulatie zien van GLUT4-kleuring op het oppervlak van myoblasten die zijn blootgesteld aan 0, 1, 10 of 100 nanomolair insuline. In contrast hiermee slagen myoblasten van individuen met insulineresistentie er niet in om GLUT4 op te reguleren in reactie op 100 nanomolair insuline. Als de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van gestimuleerde cellen wordt genormaliseerd ten opzichte van die van ongestimuleerde cellen, is het mogelijk om de MFI's van gezonde en insulineresistente myoblasten direct te vergelijken.Met deze procedure kunnen cellen worden gekleurd voor aanvullende oppervlakte- of intracellulaire markers om verschillende celpopulaties in gemengde populaties te identificeren.

quantitative-measurement-glut4-translocation-to-plasma-membrane-flow

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video demonstrates flow cytometry for measuring microglial uptake of fluorescent bioparticles after intravitreal delivery in a mouse eye. Flow cytometry detects live cells expressing CD11b and distinguishes phagocytic microglia cells exhibiting green fluorescence from other myeloid cells, including Ly6C-expressing monocytes and Ly6G-expressing neutrophils.

Measuring Microglial Uptake of Intravitreally-Delivered Fluorescent Particles Using Flow Cytometry

Dit artikel laat zien hoe u glutamine dynamiek in levende cellen met behulp van FRET. Genetisch gecodeerde sensoren mogelijk real-time monitoring van biologische moleculen op een subcellulaire resolutie. Experimenteel ontwerp, technische specificaties van de experimentele instellingen, en overwegingen voor post-experimentele analyses voor genetisch gecodeerd glutamine sensoren worden besproken.

Glutamine Flux Imaging Met behulp van genetisch gecodeerde Sensoren

Monocyten zijn integrale componenten van het menselijke aangeboren immuunsysteem die afhankelijk zijn van glycolytisch metabolisme wanneer geactiveerd. We beschrijven een flowcytometrieprotocol om glucosetransporterexpressie en glucoseopname door totale monocyten en monocytensubpopulaties in vers volbloed te meten.

Een eenvoudige Flowcytometrische methode om te meten glucose opname en Glucose Transporter Expression voor monocyten subpopulaties in volbloed

Dit protocol beschrijft een methode om de nucleocytoplasmatische transportsnelheid binnen motor neuronachtige NSC-34 cellen nauwkeurig te meten door de real-time verandering in de nucleaire invoer van een NLS-NES-GFP eiwit te kwantificeren.

Assay voor het meten van nucleocytoplasmisch transport in realtime binnen motor neuronachtige NSC-34 cellen

Twee biotinylatie-gebaseerde methoden, ontworpen voor het bepalen van de expressie van de celoppervlak en de endocytische snelheid van eiwitten uitgedrukt in het plasmamembraan, worden in dit rapport weergegeven.

Bepaling van de expressie van de celoppervlakte en de endocytische snelheid van eiwitten in primaire astrocytekulturen met behulp van biotinylering

Glucoseopname is verhoogd in Drosophila motorneuronen die worden beïnvloed door TAR DNA-bindend eiwit (TDP-43) proteïnopathie, zoals aangegeven door een FRET-gebaseerde, genetisch gecodeerde glucosesensor.

Glucoseopname meten in Drosophila-modellen van TDP-43-proteïnopathie

Dit werk beschrijft een protocol voor de kwantificering van globale histonmodificaties met behulp van intranucleaire flowcytometrie in geïsoleerde hersenmicroglia. Het werk bevat ook het microglia-isolatieprotocol dat werd gebruikt voor het verzamelen van gegevens.

Kwantificering van globale histon posttranslationele modificaties met behulp van intranucleaire flowcytometrie in geïsoleerde microglia in de hersenen van muizen

Hier presenteren we twee protocollen om microgliale inslokking van vGLUT1-positieve synapsen en pHRodo Red-gelabelde ruwe synaptosomen te kwantificeren met behulp van flowcytometrie.

Kwantificering van microgliale inslokking van synaptisch materiaal met behulp van flowcytometrie

Gereglementeerde endocytose regelt de cel oppervlakte-expressie niveaus van de meerderheid van de membraaneiwitten. Hier maken wij gebruik van herleidbaar, membraan impermeant biotinylatie reagentia aan de endocytische koers van de dopamine transporter (DAT), een membraaneiwit polytopic te meten. De methode maakt een directe benadering van het meten van de endocytische snelheid van de meeste plasma-membraan eiwitten.

Het meten van plasma membraaneiwit endocytische de tarieven door Omkeerbare biotinylatie

Het IP-FCM methode is gepresenteerd, die een gevoelige, robuust, biochemische evaluatie van de natieve eiwit-eiwit interacties mogelijk maakt, zonder dat genetische manipulatie of grote steekproeven.

IP-FCM: Immunoprecipitatie gedetecteerd door middel van flowcytometrie

Leer hoe u GLUT4-translocatie naar de plasmamembraan kwantificeert met flowcytometrie in myoblasten. Deze methode meet insuline-afhankelijke glucose-transporter-dynamica voor metabool onderzoek.

Kwantitatieve meting van GLUT4 translocatie naar de plasmamembraan door middel van flowcytometrie

Meer video's verkennen